碱性磷酸酶Km值的测定课件

碱性磷酸酶Km值的测定
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【实验结果】
1、原始数据
结果记录 1 2 3 4
5
OD
底物浓度 1 3 5 6 8 mmol/L
6
78
12
16
0
1/[S] 1/OD
1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 -
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2、作图
• 以 [s]为横轴，OD510为纵横作图，观察曲线形状； 查Km 值
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Vmax•[S] V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度， 当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法
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• 将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v －1／[s]作图，将各点连线，在横轴截 距为-／km，据此可算出Km值。
0.90 0.90
0.90
蒸馏水 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00
混匀后37℃水浴，预温5分钟左右
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酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
加入酶液后立即混匀（保持37℃水浴）， 反应开始。
从加入酶液起计时至下一步 加入碱性 溶液停止反应，各管反应时间应准确一 致，为15分钟。
• 1/V=Km/ Vmax•[S] + 1/ Vmax
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• 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生 成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用， 经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色的深浅 可测出酶活力高低。其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O AKP OH- 苯酚
• 比较两种Km测定方法各自的优缺点
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苯酚+4-氨基安替比林
K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
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【实验操作】
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00
(0.04M)
碳酸缓 液(pH=10)
0.90 0.90
0.90 0.90
0.90
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碱性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
4-氨基安 替比林
铁氰化钾
1.0 1.0 2.0 2.0
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度
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【实验目的】
•1.了解酶的Km值测定原理和方法
• 2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测定的原理 和方法
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【实验原理】
• 在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加， 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应速 度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反应 速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来 表示，即：
• 以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作图，观察 曲线形状；查Km 值
• 比较两个值的差异.
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OD510
1/OD510
VMAX
1/2VMAX
1/Vmax
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
[S]
-1/Km
双倒数曲线
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1/[s]
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【实验讨论】
• 比较两个值的大小,分析实验误差产生的原 因