脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。

方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。

单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。

结果采用Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。

细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。

结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。

【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro, and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition, and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained, the shape of cells were observed by microscope, then the cell growth curve, the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%～70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed-cells in tissue engineering.Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。

寻找来源丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点[1]。

脐血(umbilical cord blood, UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。

与骨髓相比，UCB来源更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。

有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)。

如果从脐血中培养出MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值[2,3]。

本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，分析UCB-MSCs 作为间充质干细胞来源的可行性。

1 材料与方法1.1 UCB-MSCs的分离与培养9 份脐血标本均来源于辽宁医学院附属第一医院，均获得产妇同意。

以等量的PBS ，1.073 g/mL,美国Sigma公司)，650 g离心15 min PBS缓冲液洗涤离心，基础培养液(DMEM/F12，10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺)重悬，接种至100 mm培养皿，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内培养。

第5天首次全量换液，之后每周2次换液，2周后达60%～80%融合时，0.25%胰酶(含 0.02%EDTA)常规消化传代。

1.2 UCB-MSCs细胞表面抗原分析分别取第1、5、9代细胞，胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。

含2%牛血清白蛋白的PBS缓冲液冲洗细胞，室温下分别与CD29-PE、 CD34-PE、CD44-PE及CD45-PE单克隆抗体避光孵育15 min。

PBS缓冲液冲洗细胞，离心，弃上清。

加入含1%多聚甲醛的PBS缓冲液0.3 mL，使用同型对照单克隆抗体确定背景标记，流式细胞仪分析细胞表面抗原。

1.3 UCB-MSCs体外增殖能力检测分别取第1、5、9代细胞，胰蛋白酶消化，接种24孔板，每孔1×104个细胞/mL。

胰酶消化并计数，每天计数3孔，绘制细胞的生长曲线。

1.4 细胞活性检测分别取第1、5、9代细胞，胰蛋白酶消化，调整细胞浓度至1×104个细胞/mL，每孔100 μL接种于96孔板，在37 ℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱内培养2天。

向每孔加MTT溶液(5 mg/mL用PBS，pH=7.4配制)10 μL。

继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。

每孔加150 μLDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。

1.5 统计学处理应用SPSS 12.0统计学软件处理，结果以均数±标准差表示，采用配对t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果2.1 细胞形态学观察原代细胞接种5 d后首次换液，细胞呈圆形或短梭形(图1A)。

9 d后细胞进入增殖期，形成细胞集落，细胞形态也逐渐向长梭形改变。

2周后基本达到70%融合状态(图1B)，传代培养。

传代后细胞分布均匀，呈成纤维样细胞形态，4～5 d后可达80%融合。

2.2 细胞表面抗原分析不同代次UCB-MSCs表面抗原检测结果见表1。

第1、5、9代细胞的CD29和CD44均呈较高表达，阳性率在50%～70%左右。

CD34和CD45则呈低表达，阳性率不超过5%。

表1 不同代次UCB-MSCs表面抗原的阳性表达率2.3 细胞倍增时间分析细胞传代培养的潜伏期约为36～48 h，第3天开始，数量逐渐增多，对数增殖期约为4～7 d，随后细胞逐渐减少(图2)。

根据生长直方图可知，UCB-MSCs 的群体倍增时间为(47.5±9.32)h。

从第9代开始细胞倍增时间逐渐延长达(71.6±6.28)h，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 细胞活性检测为了检测长期培养后的细胞活力，本实验用MTT法检测培养的1、5、9代细胞活力。

结果显示培养的UCB-MSCs的生长状态良好，在细胞活力方面1～5代细胞无明显的差异(P>0.05)，但在第9代细胞的增殖活力稍下降，但差异不明显(P>0.05)。

3 讨论间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 具有多向分化潜能，是组织工程研究中较为理想的种子细胞，是研究人工组织工程材料的必备条件。

安全、充足并不受伦理学制约的间充质干细胞来源是组织工程研究中要解决的问题。

以往的文献报道和研究证实,骨髓作为MSCs的来源已经得到证实，并针对骨髓源性的MSCs进行了一积极的探索[4-6]。

但随着年龄的增加，骨髓中MSCs的含量明显减少[1]1847-1861，且受病毒感染机会显著增加，获得骨髓的过程也会造成一定的二次损伤，这些均限制了骨髓源性的MSCs的应用，寻找替代的间充质干细胞来源成为研究者关注的热点。

有人认为脐血也有含有MSCs，但随胚胎成就程度的不同MSCs的含量各不相同。

但脐血是否存在MSCs，并作为 MSCs供源一直有争议[7]。

支持者认为脐血与骨髓相比较，具有更充足的来源，且免疫原性低，能耐受更大程度HLA配型不符，分离出的MSCs纯度更高 [8] 。

虽然脐血MSCs占脐血单个核细胞(mononuclear, MNC)的比例较小，仅有约25%的脐血样本的MNC含有并经培养后出现MSCs，但脐血MSCs有85%以上处于细胞周期的G0/G 期[9]。

因此，从脐血中成功分离扩增出MSCs，将作为一种新的MSCs的来源应用于科研和临床。

本实验采取密度梯度离心与直接贴壁法相结合，先用密度为1.073 g/L的淋巴细胞分离液对脐带血进行密度梯度离心，收获的中间层细胞中含有较多的单个核细胞;再经反复贴壁培养和除去悬浮生长细胞，得到较多呈融合状态的贴壁细胞。

经MTT实验说明培养细胞有9代以前均具有良好的增殖能力，9代后稍下降。

细胞的表面抗原检测发现细胞高表达CD29和CD44，但低表达 C34和CD45，这与文献报道的一致[10]。

一般认为，贴壁细胞中呈现成纤维细胞样形态，具有旺盛的分裂增殖能力，且同时表达CD29、CD44，可以初步判断为是MSCs[3]。

本研究经分离纯化获得均一生长的长梭形或多角形贴壁细胞，经过反复传代后贴壁细胞形态趋于均一，且细胞表型更为纯化，50～70%的细胞表达CD29、CD44，表明能从脐血中成功分离出UCB-MSCs。

本实验在证明了脐血中含有MSCs的同时，成功的对UCB- MSCs进行了扩增，进行了初步的鉴定和生物学特征的检测，为MSCs进一步研究奠定了基础。

【参考文献】[1] Au A,Boehm CA,Mayes AM,et al. Formation of osteogenic colonies on well-defined adhesion peptides by freshly isolated human marrow cells[J].Biomaterials,2007,28:1847-1861.[2] Lee OK, Kuo KT, Chen WM, et al. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood[J].Blood,2004,103:1669-1675.[3] Bieback K, Kern S, Kluter H, et al. Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood[J]. Stem cells, 2004, 22: 625-634.[4] 郑德宇，张玉华，姚素艳,等.人骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓基质细胞复合生物活性玻璃陶瓷修复颅骨缺损[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2009，13(34):6705-6708.[5] 郑德宇,秦书俭,姚素艳.PcDNA3-hBMP2转染骨髓基质细胞及其稳定表达[J]. 中国临床解剖学杂志，2004，22(2):210-213.[6] Stute N,Holtz K,Bubenheim M,et al. Autologous serum for isolation and expandsion of human mesenchymal stem cells for clinical use[J]. Exp Hemato1,2004,32：1212-1225.[7] Goodwin HS，Bicknese AR，Chien SN，et al.Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood:expression of bone，fat，and neural markers[J].Biol Blood Marrow Transplant，2001，7(11):581-588.[8] Romanov YA，Svintsitskaya VA，Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord[J].Stem Cells，2003，21(1):105-110.[9] Deans RJ，Moseley AB.Mesenchymal stem cells:biololgy andpotential clinical uses[J].Exp Haematol，2000，28: 875-884.[10] 刘广鹏，张文杰，李宇琳，等.长期体外培养对人脐血间充质干细胞成骨分化潜能的影响[J].组织工程与重建外科杂志，2009,5(1):4-7.。