实验动物(大鼠、小鼠、兔)原代心肌细胞
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的细胞类型，对于心脏生理学和病理学研究具有重要意义。
在研究心脏疾病发生发展机制、药物筛选及分子生物学研究中，大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是必不可少的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）动物：健康的大鼠（2）工具：手术刀、剪刀、镊子、针头、离心管、培养皿等（3）试剂：PBS、Hanks液、COLLAGENASE、TRYPSIN、DNA酶I2. 心肌细胞的分离（1）准备心肌组织：选取健康的大鼠，进行心肌组织的分离。
将动物取出心脏，迅速放入含有PBS的离心管中，冷藏备用。
（2）组织的机械分离：将心脏取出后进行机械分离，去掉多余的结缔组织等。
（3）酶消化：将组织加入COLLAGENASE、TRYPSIN等酶进行消化，使细胞释放。
（4）滤网过筛：将酶消化后的组织经过滤网过筛，得到心肌细胞的悬液。
（5）细胞纯化：使用密度梯度离心法或其他方法对心肌细胞悬液进行纯化，得到较纯的心肌细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 形态学鉴定（1）显微镜观察：将得到的心肌细胞悬液放入培养皿中，通过显微镜观察心肌细胞的形态。
（2）心肌细胞的特征：心肌细胞具有两个或多个横纹和中央的单核的细胞核，且具有特殊的形状和排列方式。
2. 免疫细胞化学鉴定（1）选取适当的心肌细胞标记物：如肌球蛋白、酸性肌球蛋白等（2）进行免疫细胞化学染色：使用特异性抗体对心肌细胞进行染色，观察标记物的表达情况。
（3）通过显微镜观察：观察心肌细胞的染色情况，以确定其特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）培养基配方：DMEM/F12培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素+适量营养因子（2）pH值调节：将配制好的培养基进行pH值调节至7.42. 大鼠心肌细胞的培养（1）培养皿涂层：将培养皿内涂覆明胶或胶原等基质蛋白，有利于细胞的附着生长。
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养㈠、概述整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。
小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。
㈡、[试剂]1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。
3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L㈢、[实验步骤]1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min 振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。
（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中（37℃5%CO2）培养。
原代细胞分离培养鉴定2(SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞)
原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。
体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。
其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。
目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。
非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。
近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。
心脏 大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。
腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。
C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、 心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细 胞间质。
CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代 谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功 能、细胞因子分泌和血管生成。
细胞工程实验三：乳鼠心肌细胞的原代培养-治
将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层，收获细胞
实战程序 第四大步骤：清洗细胞，培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液，置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免 毒性产生，而且动作要轻，以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】（参考教材P128）
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房（心脏上半部分）及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次（至没有血时）
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后，转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤：消化组织，获得细胞
加0.125%胰蛋白酶（2ml）
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层（细胞在悬液中，未消化好的组织块在底层） 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应，反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪（1ml）及枪头 每组2个：离心管、培养皿
大鼠原代心肌细胞培养实验的
相关记录：年月日星期天气：实验内容：C57小鼠心肌细胞培养参加人员：王朗郭源源一、培养前准备：1 器械：取心脏： wpi剪2把、显微镊弯2把、眼科镊1把取心脏后：显微剪1把、持针器2把、吉利刀片2片、眼科镊2把、400目细胞滤网2 器皿：外：烧杯1个 100ml内：盛酒精小烧杯、棉签2包，鼠板盛小鼠尸体，玻璃皿100mm 2，碎冰盆底加两个冰袋，离心管架1，6孔板，EP管，15ml离心管，50ml离心管3 试剂与配制1.培养基：DMEM/F12，添加15%FBS2.提前融化：BrdU溴脱氧尿苷 100X储藏液(10 mM)，小牛血清、II型胶原酶〔10mg/ml储藏液〕、0.25%胰酶提前融化3.D-Hanks液：二方法1 心脏取出1. 加10ml和6ml未加血清的DMEM/F12到2个100mm皿中，平皿放入冰盆预冷。
2. 将20只小鼠婴放入100mm玻璃平皿，镊取小鼠放入75%酒精中浸泡数秒，对其颈部以下消毒，抓取小鼠，固定住上肢与下肢，从颈部剪下头部，剪刀由颈部伸入胸腔沿胸骨左侧剪开，轻轻挤压胸廓，让心脏跳出，迅速用镊子取下心脏，放入盛有10ml DMEM/F12的玻璃平皿中。
3. 轻柔清洗心脏的血液后转入另一个盛有10ml DMEM/F12液的10cm培养皿中，用显微剪将心脏剪成1-2mm的碎片。
4. 以上过程应在冰上30min之内完成。
2 消化细胞1. 将剪碎的组织转入15ml离心管，吸去DMEM/F12，参加酶消化液4ml。
2. 37度水浴中轻摇，消化10min，静止数秒钟，吸取上清液，弃去。
此时消化下的细胞为不需要的红细胞、细胞碎片以与心内膜和心外膜细胞。
3. 37度水浴中轻摇，消化4-5min。
静止数秒钟，吸取上清液，放入预先放好7ml〔体积为上清液体积的2-3倍〕含20%小牛血清的DMEM/F12培养基的15ml离心管中终止消化，并置于冰上。
4. 重复3步骤，循环5-6次。
取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。
大鼠胚胎原代心肌细胞解冻和储存
大鼠胚胎原代心肌细胞解冻和储存桂林赛奥生物技术有限公司大鼠原代心肌细胞（Primary cardiac myocytes）是一种源于SD大鼠胚胎心脏组织心肌层的亚克隆原代细胞，以贴壁形式生长。
这种细胞保有心肌的多种生物学特性，包括肌球蛋白和肌激酶的表达，可增殖培养并可传代多达10次。
细胞置于冻存管放在液氮罐中储存，一般每一个冻存管所含细胞数> 5 x 105。
1、冻存细胞解冻操作步骤：z预先将解冻培养基置于37℃水浴中加热；z将细胞冻存管从液氮罐中取出并迅速（数分钟内）将其置入37℃水浴中；z分别把12 ml解冻培养基加到75 cm2的培养瓶或10 ml 直径100 mm培养皿内；z缓慢地（不得少于1分钟）把细胞接种到培养瓶或培养皿；z将已经接种细胞的培养瓶或培养皿置于二氧化碳培养箱内，不要过度振摇；z当细胞贴壁时（通常需要数小时），更换新鲜生长培养基并继续培养。
在细胞长满之前作次（传）代培养。
2、次代培养步骤z将培养瓶或培养皿中的培养液吸弃；z用2 ml 的0.25% (w/v) Trypsin-0.53 mM EDTA溶液简单清洗细胞层；z加3 ml的Trypsin-EDTA溶液，置37℃二氧化碳培养箱中, 在倒置显微镜下观察细胞层脱落；z加入7.0 ml完全生长培养基，用吸液管轻轻抽吸细胞使细胞分散；z按照1:4～6的比例将细胞再次接种于新的培养瓶或培养皿中，置37℃二氧化碳培养箱中培养；z每2～3天更换一次新鲜培养基。
3、解冻培养液：将5ml 生长培养基与17ml去离子水、3ml胎牛血清（FBS）混合。
4、生长培养基：Dulbecco’s改良任格氏培养基（DMEM），含10% FBS以及1000U/L 青霉素、1mg/L链霉素。
5、培养条件：95%空气；5%CO2；温度37.0℃。
6、储存冷冻液: 生长培养基添加DMSO，浓度为 7.5% (v/v) 。
7、储存操作步骤：将温度从 -20℃降到 -80℃ ( -80℃冰箱或液氮气) ，放置数小时，然后转入-190℃液氮(罐)中。
小鼠心肌细胞的原代培养注意事项
小鼠心肌细胞的原代培养注意事项
一、实验前准备
1.1 材料准备
1.2 设备准备
1.3 环境要求
二、小鼠心肌细胞的原代培养操作步骤
2.1 小鼠心肌细胞的分离和培养基的配制
2.2 小鼠心肌细胞的原代培养
三、培养基的更换和维护
3.1 培养基的更换
3.2 细胞状态观察和维护
四、实验中常见问题及解决方法
4.1 细胞污染问题及解决方法
4.2 细胞生长不良问题及解决方法
4.3 细胞死亡问题及解决方法
五、实验安全注意事项
5.1 实验室安全措施要求
5.2 实验过程中个人防护措施要求
六、实验结果的分析和记录方式
6.1 实验结果的观察和记录方式
6.2 数据处理和结果分析方法
七、实验结束后处理方式
7.1 培养皿、试管等废弃物处理方式要求7.2 试剂废弃物处理方式要求。
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。
2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。
3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。
4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。
5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。
封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。
第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。
之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。
放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。
这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。
（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。
5只鼠铺一个培养瓶。
4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。
心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。
注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。
小鼠乳鼠原代心肌细胞的改良培养
通讯作者 ：黄莺，博士，
副 主任 医 师 ，副教 授 ，新
疆医科大学第一附属 医院
心 脏 中心 ，冠 ・ ， １ ２ 病木
齐市 ８ ３ Ｏ Ｏ５ ４
中图分类 号： Ｒ ３ １ ８
文 献标 识码 ： Ａ
组 织Ｉ 程 ：飘镪 瞻 心 畦： 小 鼠
Ｍｏｄｉ ｆ ｉ ｅｄ ｐｒ ｉ ｍａｒ ｙ ｃｕｌ ｔ ｕｒ ｅ ｏ ｆ ｎｅｏｎａ ｔ ａｌ ｍｏｕｓ ｅ ｍｙｏｃａ ｒ ｄｉ ａｌ ｃｅｌ ｌ ｓ
Ｍｅ ｎ ｇ Ｌ ｉ ｎ — Ｉ ｉ ｎ ’ Ｈｕａｎ ｇ Ｙｉ ｎ ｇ’ Ｍａ Ｙ ｉ ． ｔ ｏ ｎ ｇ ’Ｌ ｉ ｕ Ｆ ｅｎ ，Ｃｈ ｅｎ Ｂａｎ ｇ— ｄａｎ ｇ 。 Ｃｈｅｎ Ｘｉ ａｏ ． ｃｕ ｉ ， Ｇ ａｉ Ｍｉ ｎ ． ｔ ａｏ
基 金资 助 ：
国家 自然科 学 基金 资勃 项 目【 毽 １ ２ ６ ０ ０ ２ ２ ） ：额 疆维 吾尔 自治 区 自然科 学基 金 资助项 ￣（ ２ ０ １ ４ ２ １ １ Ｃ ０ ４ ０ ）
摘要
文章编 号： ２ ０ ９ ５ ４３ ４ ４
（ ２ ０ １ ５ ） ３ ７ － ０ ５ ９ ９ ３ － ０ ５
稿 件接 受：２ ０ １ ５ － ０ ８ － ０ ７
ｈ ｔ ｔ ｐ： ／ ／ ＷＷＷ ｃ ｒ ｔ ｅ ｒ ． ｏｒ ｇ
背 景 ： 大 鼠心肌 细 胞原 代培 养技 术 日渐 成 熟 ，但 小 鼠心 肌细 胞 在 同样 实验 条件 下不 易获 得 ，而 小 鼠基 因组与 人 类 基 因组有 更 多相似 之 处 ，具有 更 高的研 究 价值 。 目的： 改进 小 鼠乳 鼠原 代心 肌 细胞 的培 养 方法 ，得 到纯 度 高 、活 力强 、保 持心 肌 细胞 原有 结构 和功 能 的心肌
正常大鼠原代心肌细胞培养
正常大鼠原代心肌细胞培养一、实验试剂1、培养基：PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement2、冻存液：PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO3、洗涤液：1×PBS（pH 7.4）+ 1% P/S4、染色液：0.4% Trypan Blue5、消化液：PriCells Isolation of Primary Cell Kit6、检测试剂：一抗小鼠抗大鼠α-横纹肌肌动蛋白，二抗FITC标记山羊抗小鼠IgG，乙醇丙酮混合液（1∶1）二、实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊5、200目网筛6、玻璃滴管7、烧杯8、15ml离心管三、实验流程取材↓取心肌组织放入D-Hanks中洗涤3次↓剪碎至1mm3 +消化液（PriCells）↓37℃水浴8min，吸弃上层悬液（非心肌细胞）↓余下组织加消化液（PriCells）37℃磁力搅拌10min，60r/min↓上层悬液加消化终止液（PriCells）↓余下组织再加消化液（PriCells）继续消化3-5次↓收集所有混悬液过200目网筛↓收集滤液1000RPM/10min↓去上清，收集沉淀，2ml培养基重悬↓染色计数四、实验操作1、培养瓶预包被。
试验前一天预包培养瓶，置于超静台吹干或45℃烘箱烘干（切记保持无菌），4℃冰箱放置，备用。
2、取材：出生1—3天幼鼠。
3、材料预处理：将获取的心脏放入含有1% P/S的1×PBS（pH 7.4）中，剪去心房，反复洗涤，至心室内无血渍，洗涤液澄清为止。
4、消化：将心室肌用眼科剪剪成1mm3大小组织块，加入消化液10ml，37℃水浴8min后，吸取上层混悬液遗弃；余下组织加入消化液10ml，37℃水浴并用磁力搅拌器搅拌10min；吸取上层混悬液，终止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至组织块完全消化。
小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养
小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养娜几娜;王凌鹏;马艳;侯月梅【摘要】目的:观察原代培养的小鼠乳鼠心肌细胞的形态特征.方法:Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶消化心脏组织,差速贴壁分离法.结果:12 h心肌细胞基本贴壁,第2天可长成单层,第3～4天细胞伸出伪足相互接触交织成网,逐渐形成细胞簇或细胞单层,搏动呈同步性,收缩明显有力,搏动频率为30～120次/min.结论:用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分离培养小鼠乳鼠心肌细胞可获得形态、活力良好的心肌细胞.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2008(031)007【总页数】2页(P786-787)【关键词】乳鼠;心肌细胞;培养【作者】娜几娜;王凌鹏;马艳;侯月梅【作者单位】新疆医科大学第一附属医院,心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院,心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院,干细胞移植研究中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院,心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011【正文语种】中文【中图分类】R-332心肌细胞培养已成为心血管研究的基本方法和手段之一，目前在心肌细胞的生长发育、生理、代谢、病理、药理等方面已开展了多项基础研究。
其中体外培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点,并具有自发性节律搏动,且心肌细胞的培养具有简便、定量、重复性好以及不受神经体液因素的影响等特点。
利用培养的心肌细胞在探索非血液动力学因素所致的心肌肥厚的调节,研究心肌细胞的生物力学、凋亡、受体下调、缺血预处理、信号通路、对作用于心脏的新药进行筛选并对其安全性进行评价以及从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子等方面具有广阔的应用前景,故引起了人们的高度重视并竞相进行与心肌细胞培养有关的研究[1]。
心肌细胞培养的常见动物是大鼠,常用的细胞培养方法包括新生大鼠心肌细胞的培养和成年大鼠细胞的培养。
为观察原代培养小鼠乳鼠心肌细胞的形态特征，本研究用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分离培养小鼠乳鼠心肌细胞。
大鼠心肌细胞原代培养
实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定1、材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001）。
1.1.2主要仪器与试剂 5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2incubator）；倒置相差显微镜（XD-101 98010）；PH计（mettler toledo320-s）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI），上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；微量移液枪（法国Gilson）；血球记数板（上海市沪江医疗器材经营部）；HH-6数显恒温水浴锅；离心机（LDZ5-2）；75cm2培养瓶、50ml离心管（美国corning公司）；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板（BS1101S 德国）；一次性滤器（22μm, GILSON）；DMEM/F12培养基 (美国GIBCO)；特级胎牛血清（FBS， Hyclone）；青、链霉素（Hyclone）；D-Hank’s液（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3，苯酚红,南京化学试剂厂）；心肌肌钙蛋白T(Santa cruz) ;FITC连接的兔抗山羊IgG(Santa cruz);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)。
1.2方法于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4℃的D-Hank’S液中漂洗3～4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1 mm3碎块后，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒温水浴箱中消化3 min，然后弃上清。
于剩余沉淀中加入混合消化液5 ml（0.0625％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶），置37℃水浴消化8～10 min，其间振荡2～3次，静置后将上清液移入离心管中，加含10％胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法将大鼠的心肌细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。
2. 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
3. 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
二、方法1. 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2. 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
3. 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养㈠、概述整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。
小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。
㈡、[试剂]1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。
3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L㈢、[实验步骤]1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min 振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。
（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中（37℃5%CO2）培养。
西藏小鼠心肌原代干细胞培养技巧
西藏小鼠心肌原代干细胞培养技巧（一）前言西藏小鼠是我国唯一野生高原兽种，具有高寿命、高抗氧化、高抗缺氧、高红细胞密度等特性。
为了更好地研究和利用这一资源，在研究中心的引导下，我积极参与了有关西藏小鼠心肌原代干细胞培养技术的学习和研究工作。
在这一过程中，我积累了许多经验并发现了一些问题，现将我的一些心得体会分享给大家。
（二）心肌原代干细胞的提取提取心肌原代干细胞是研究心脏干细胞的一个重要步骤。
在提取过程中，需要仔细操作，以确保提取到的细胞数量和质量达到要求。
1. 准备工作。
在提取心肌原代干细胞前，需要准备好所需的仪器和试剂，例如工作台、培养皿、培养液、离心机等。
2. 切割心脏组织。
首先，需要将小鼠的心脏组织切割成小块。
切割时应注意不要受到污染。
3. 消化组织。
将心肌块加入消化液中，并放入恒温水浴中，可使心肌块中的细胞逐渐分离。
4. 筛选出心肌原代细胞。
将消化液中的细胞用过滤网进行筛选，将细胞培养在含有胰酶的培养液中几分钟，胰酶可使心肌细胞逐渐分离。
（三）心肌原代干细胞的培养1. 培养基的选择。
为了更好地培养心肌原代干细胞，我们选择了以DMEM/F12为基础的培养基，添加适量的FBS、酵母抽提物、L-谷氨酰胺、丝氨酸等营养成分，促进心肌干细胞的生长。
2. 恒温箱的设定。
在细胞培养的过程中，需要保持适宜的温度和湿度，使细胞能够良好地生长和繁殖。
3. 细胞培养周期的控制。
要保证心肌干细胞能够稳定地生长和繁殖，需要控制细胞培养周期和对培养液中营养成分的添加。
（四）细胞活力的检测细胞活力是心肌干细胞繁殖和生长的重要指标，也是评价心肌干细胞培养质量的重要标准。
因此，在进行心肌干细胞培养的过程中，需要对细胞活性进行监测和控制，以确保实验的可靠性和有效性。
1. 测定细胞的生长曲线。
生长曲线是细胞生长和繁殖的重要指标，通过细胞培养基中的OD值来测定细胞生长情况。
2. 检测细胞彗星现象。
细胞彗星现象是细胞死亡的标志之一，通过对细胞DNA的断裂情况和细胞核的形态进行观察和检测，可以得出细胞的生命状态和活性。
原代心肌细胞分离 实验(体验版)
原代心肌细胞分离1 材料与方法1.1实验动物选择出生0.5-1天的清洁级SD新生大鼠，雌雄不限1.2主要的实验仪器CO2恒温培养箱；倒置显微镜；Nikon-E440荧光显微镜胰酶；Ⅱ型胶原酶；5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）；肌球蛋白重链蛋白（MF-20）单克隆抗体（武汉博士德公司）;Hoechest；无钙镁磷酸盐缓溶液；胎牛血清（FBS）；氯霉素+新链霉素溶液I 15ml（DMEM-F12 13.5ml，FBS1.5ml，氯霉素+新链霉素150ul）溶液II 30ml（DMEM-F12 25.5ml，FBS4.5ml，氯霉素+新链霉素300ul,BrdU 100ul 10mg/ml）新鲜的0.1%Ⅱ型胶原酶（0.01g粉末+ 10ml PBS 0.2um过滤器过滤）1.3大鼠心肌细胞分离和培养于超净工作台中，取新生1-2天SD大鼠10只，75%酒精溶液浸泡3-5s杀菌消毒。
更换器械于无菌条件下立即打开胸腔,准确取出心脏,放于预冷的无钙镁磷酸盐缓溶液中漂洗5次，并依次去除心脏周围及心脏房室腔内的血液或血凝块，剪去心房部分，获取心尖心室部分，迅速转移至200ul预冷的0.1%胰酶的无钙镁磷酸盐缓液中，将心肌组织反复剪成约0.5-1 mm3的组织块，将剪碎的组织块混合液转移到50ml的离心管中静置于冰箱4℃消化过夜（每隔段时间摇晃一下）。
第二日，配置新鲜的0.1%Ⅱ型胶原酶10ml（0.2um过滤器过滤），置换等量心脏消化液，于磁力搅拌器上温和搅拌消化30min，温度34℃，转速100-120g。
待消化液中组织块全部消化完时，加入10ml溶液I终止消化，1500rpm离心10min,小心弃去上清，加入5ml溶液I，1500rpm离心5min，小心弃去上清，加入溶液II 10ml(含0.1 mmol/L BrdU，以抑制成纤维细胞的增殖)，轻轻吸打混匀后400目细胞筛过筛入10cm大皿中，置于体积分数为5%的CO2培养箱中，差速贴壁培养2h。
提高新生大鼠原代心肌细胞纯度方法的探讨
提高新生大鼠原代心肌细胞纯度方法的探讨王新陆;崔琳;王幼平;李彬;谢世阳;朱明军【摘要】目的：探讨提高新生大鼠原代心肌细胞纯度的方法。
方法：应用0.08%心肌细胞消化液重复消化出生第1-3天乳鼠的心肌组织多次；收集的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基中和。
用差速贴壁分离法分离后，加入红细胞裂解液，以除去红细胞，加入溴脱氧尿嘧啶（Brdu）纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育2天，无血清同步化1天。
结果：分离1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为1.2×106个，有活力心肌细胞占90%以上，心肌细胞纯度>90%，3-4天后心肌细胞融合成片，并出现自发性节律性搏动。
结论：该方法在保证心肌细胞产量和心肌细胞活性的同时，能大幅度提高心肌细胞纯度。
%This study was aimed to explore the method to improve the purity of primary myocardial cells from neonatal rats. The myocardial tissues of rats which were born 1-3 days were repeated digested by 0.08% myocardial cells digestive juices. And then, cells were neutralized with DMEM medium which containing 10% fetal bovine serum. The cells were separated with differential sidewall ion. The red blood cell cracking liquid was added to remove the red blood cells. Bromine deoxidization uracil (Brdu) was added to purify the myocardial cells. Then, cells were incubated in the CO2 incubator for two days. The serum-free synchronization was performed for one day. The results showed that the output of myocardial cells from one rat was about 1.2 × 106. The dynamic myocardial cells occupied more than 90%. The purity of myocardial cells was more than 90%. After 3 to 4 days, the cell fusion of myocardial cells was formed with spontaneous rhythm beats. It wasconcluded that the method can ensure the yield and the activity of the myocardial cells. At the same time, the purity of myocardial cells can also be improved greatly.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】5页(P333-337)【关键词】新生大鼠;心肌细胞;原代培养;鉴定【作者】王新陆;崔琳;王幼平;李彬;谢世阳;朱明军【作者单位】河南中医学院郑州 450000;河南中医学院第一附属医院郑州450000;河南中医学院第一附属医院郑州 450000;河南中医学院第一附属医院郑州 450000;河南中医学院第一附属医院郑州 450000;河南中医学院第一附属医院郑州 450000【正文语种】中文【中图分类】Q813.1自1960年Haracy L等[1]首次对乳鼠的心肌细胞进行培养以来，原代心肌细胞越来越多的用于实验中，经过国内、外学者对原代心肌细胞培养方法的不断探索，原代心肌细胞的产量和活性都得到了大幅度的提高。
动物实验报告
实验名称：小鼠心肌细胞损伤模型建立及干预研究一、实验目的本研究旨在建立小鼠心肌细胞损伤模型，探讨干预措施对心肌细胞损伤的保护作用，为临床治疗心肌损伤提供理论依据。
二、实验材料1. 实验动物：SPF级雄性昆明小鼠，体重18-22g，由某实验动物中心提供。
2. 试剂：大鼠心肌细胞损伤试剂盒、兔抗小鼠心肌细胞损伤抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗、DAB显色剂、Trizol试剂、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒等。
3. 仪器：显微镜、荧光定量PCR仪、凝胶成像系统、离心机、电泳仪等。
三、实验方法1. 心肌细胞损伤模型的建立（1）取小鼠，腹腔注射10%的水合氯醛进行麻醉，剪开胸腔，暴露心脏，取出一部分心肌组织。
（2）将心肌组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，放入含有RPMI-1640培养基的平皿中，用眼科剪剪成单细胞悬液。
（3）将细胞悬液接种于培养瓶中，放入CO2培养箱培养。
（4）培养24小时后，用0.1%Triton X-100处理细胞，使其损伤。
2. 干预措施（1）实验分组：将实验小鼠随机分为正常组、模型组、干预组。
（2）干预组小鼠给予一定剂量的干预药物，连续给药7天。
3. 实验指标检测（1）细胞损伤程度检测：采用大鼠心肌细胞损伤试剂盒检测细胞损伤程度。
（2）心肌细胞凋亡检测：采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡。
（3）心肌细胞损伤相关蛋白表达检测：采用免疫组化法检测心肌细胞损伤相关蛋白表达。
（4）荧光定量PCR检测心肌细胞损伤相关基因表达：提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，荧光定量PCR检测心肌细胞损伤相关基因表达。
四、实验结果1. 心肌细胞损伤程度与正常组相比，模型组细胞损伤程度显著升高（P<0.05）；干预组细胞损伤程度明显降低（P<0.05）。
2. 心肌细胞凋亡与正常组相比，模型组细胞凋亡率显著升高（P<0.05）；干预组细胞凋亡率明显降低（P<0.05）。
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实验动物（大鼠、小鼠、兔）原代心肌细胞
产品编号：RAT/MIC/RAB-iCell-c001
产品规格：>5×105细胞数
产品价格：3930/3910/4350
包装规格：1ml冻存细胞悬液或T-25培养瓶
细胞详述：
心肌的工作细胞包括心房肌和心室肌。
心肌细胞为短柱状，一般只有一个细胞核，心肌细胞之间有闰盘结构。
该处细胞膜凹凸相嵌，并特殊分化形成桥粒，彼此紧密连接，但心肌细胞之间并无原生质的连续。
心肌细胞的细胞核多位于细胞中部，形状似椭圆或似长方形，其长轴与肌原纤维的方向一致。
肌原纤维绕核而行，核的两端富有肌浆，其中含有丰富的糖原颗粒和线粒体，以适应心肌持续性节律收缩活动的需要。
细胞特性:
1)组织来源于实验动物的正常心脏组织。
2)细胞鉴定：肌球蛋白重链(MHC)免疫荧光染色为阳性。
3)经鉴定细胞纯度高于90%。
4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。
5)细胞生长方式：长柱状细胞，不规则细胞，贴壁培养。
产品的运输和保存：
视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。
1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进
行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。
2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生
长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。
推荐培养基：
我们推荐使用iCell原代心肌细胞培养体系（产品编号：PriMed-iCELL-022）作为体外培养原代心肌细胞的培养基。
产品使用：
1)本产品仅能用于科研
2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核
3)本产品未通过用于活体诊断的审核。