筛选杂交瘤细胞的方法

如何筛选杂交瘤细胞？

教学中经常有学生问：如何筛选杂交瘤细胞？

浙科版选修3教材中有筛选杂交瘤细胞的内容，但没有如何筛选的方法，以下的上海高考试题可以在教学中作为一个情境感知。

单克隆抗体制备示意图

情境导入：

已知细胞合成D N A有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有D N A合成的S途径，但一般不分裂增殖，鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加入聚乙二醇促进融合，获得杂种细胞（一般只考虑细胞两两融合）。

细胞存在情况分析：

骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合形成3种杂种细胞，则试管中有5种细胞，即B淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞、杂交瘤细胞、B淋巴细胞和骨髓瘤细胞；鼠骨髓瘤细胞能不断分裂增殖，因此骨髓瘤细胞自身融合的细胞、杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞能增殖。

设计方法：

在培养液中添加入氨基嘌呤再收集增殖的细胞。

原理分析：

加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有该合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的瘤细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞可以利用淋巴细胞中的S途径合成D N A而增殖。

NO.2

HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞的机理

首先，在已免疫过的B淋巴细胞（即效应B细胞）和骨髓瘤细胞进行杂交时，可能出现的情况应该先弄清楚。

如果只考虑两两融合，可能的情况有：（1）（效应）B淋巴细胞和（效应）B淋巴细胞的融合；（2）（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）；（3）骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）。

第一类细胞在体外培养的条件下，因为无法无限增殖，最终死亡，因此，筛选的关键是限制第二类细胞的增殖。科学家在设计实验时，已经考虑到这方面问题，所以他们选择的瘤细胞是有遗传缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（T K－）或者次黄嘌呤磷酸核苷转移酶（H G P R T－）缺陷。

筛选的目的：获得杂交瘤细胞。

筛选的方法：用选择性培养基来完成，即H A T培养基。

加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的培养基称H A T培养基。其中，氨基喋呤可阻断D N A合成的主要途径。主要途径阻断后，依靠应急途径即在H G P R T（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移

酶）和T K（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成D N A，缺少其中一种，D N A合成不能发生。

用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无T K或H G P R T，所以单个或融合骨髓瘤细胞在H A T 培养液中将死亡。B细胞虽然有H G P R T和T K，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。因此，只有杂交瘤细胞才能在H A T培养液中生长繁殖。

淋巴细胞：不能生长，5到7天死亡，原因是D N A的主要合成途径被A 阻断。

骨髓瘤细胞：不能生长，5到7天死亡，原因是H G P R T缺乏，D N A合成的旁路途经受阻。

骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成杂交瘤细胞：可长期生长繁殖。利用淋巴细胞的H G R T将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成D N A从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息，从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力。

由于通过以上方法选择出杂交瘤细胞，虽然都是杂交瘤细胞，但可能是同一抗原的不同抗原决定簇刺激产生的。所以产生抗体是不纯的。如果不进一步提纯，这样得到的是多克隆抗体，所以，需要进一步筛选。

典例解析

试题：人绒毛膜促性腺激素（H C G）是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，人工制备的抗H C G单克隆抗体可用于早孕的诊断。回答下列问题：

（1）制备单克隆抗体过程中要用到和技术。制备单克隆抗体过程中，给小鼠注射的H C G相当于，使小鼠产生能分泌相应抗体的浆细胞。

（2）在细胞内D N A合成一般有两条途径。主要途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成D N A，而氨基喋呤可以阻断此途径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶催化合成

D N A，而骨髓瘤细胞的D N A合成没有此辅助途径。根据这样的原理，向

经诱导后的浆细胞与骨髓瘤细胞混合培养液中添加氨基喋

呤（“能”或“不能”）能筛选杂交瘤细胞，原因

是。

（3）筛选获得的杂交瘤细胞具有的特点。利用杂交瘤细胞生产的单克隆抗体可以与特异性结合，从而诊断早孕。

答案：

（1）动物细胞培养；动物细胞融合；抗原；（2）能；浆细胞不能增殖，骨髄瘤细胞中的D N A合成途径被阻断不能增殖，杂交瘤细胞可通过辅助途径合成D N A，能够增殖；（3）能无限增殖并分泌特异性抗体；人绒毛膜促性腺激素（或H C G）。

解析：

（1）单克隆抗体技术的原理是：将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞融合，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞，培养该细胞并以此生产抗体，所以这个过程涉及细胞培养、细胞融合技术；制备单克隆抗体过程中，给小鼠注射的H C G相当于抗原，刺激小鼠产生能分泌相应抗体的浆细胞。

（2）由题意可知杂交瘤细胞均能通过途径一和途径二合成核苷酸，而骨髓瘤细胞只能通过途径一合成核苷酸，而浆细胞不能增殖，所以加入氨基喋呤阻断途径一之后，只有杂交瘤细胞能增殖，所以能够筛选杂交瘤细胞。

（3）因为杂交瘤细胞是由浆细胞和瘤细胞融合而成，同时具有两种细胞的功能，所以杂交瘤细胞既能够无限增殖又能够分泌特异性抗体；因为产生该特异性抗体的浆细胞是由H C G刺激产生的，所以杂交瘤细胞生产的单克隆抗体能够与H C G（抗原）特异性结合，从而诊断早孕。