(完整word版)HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理
hat选择培养基筛选杂交瘤细胞的原理
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单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。
第一次筛选的原理和方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。
其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。
再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。
另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
第二次筛选的原理和方法：在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
杂交瘤细胞筛选实验报告
一、实验目的本实验旨在通过细胞融合技术，获得具有无限增殖能力和特异性抗体分泌能力的杂交瘤细胞。
通过筛选和克隆化，最终获得纯化的单克隆抗体。
二、实验原理杂交瘤细胞筛选技术是利用细胞融合技术，将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的淋巴细胞融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限增殖的特性，同时保留淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。
通过筛选和克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
三、实验材料1. 试剂：聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、抗原、酶联免疫吸附剂（ELISA）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG抗体、包被液、脱脂奶粉、洗涤液、底物显色液、终止液等。
2. 仪器：倒置显微镜、细胞培养箱、超净工作台、冰箱、酶标仪、微量移液器、恒温箱、96孔板等。
3. 实验动物：小鼠。
四、实验步骤1. 细胞融合：将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞按照一定比例混合，加入PEG诱导细胞融合。
2. 细胞培养：将融合后的细胞接种于含有HAT培养基的培养瓶中，在细胞培养箱中培养。
3. 细胞筛选：经过1-2周的培养，筛选出能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：采用ELISA方法，将抗原固相在微孔板上，将杂交瘤细胞培养上清加入微孔板中，检测抗体与抗原的结合情况。
5. 克隆化：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，确保获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：利用间接ELISA方法，检测克隆化后的杂交瘤细胞是否产生特异性抗体。
五、实验结果1. 细胞融合：成功将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞融合。
2. 细胞培养：在HAT培养基中，杂交瘤细胞能够存活并无限增殖。
3. 细胞筛选：经过筛选，获得能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：ELISA结果显示，部分杂交瘤细胞能够产生特异性抗体。
5. 克隆化：对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：间接ELISA结果显示，克隆化后的杂交瘤细胞均能产生特异性抗体。
杂交瘤细胞筛选原理
杂交瘤细胞筛选原理
1.融合：将癌细胞和免疫细胞以一定的比例混合，并经过刺激，使其融合成杂交瘤细胞。
刺激方法可以采用化学物质（如聚乙二醇）或电脉冲等。
2.杂交瘤细胞培养：将融合后的细胞在含有足够营养物质的培养基中进行培养。
由于杂交瘤细胞一般具有对培养条件要求较高且很容易生长，所以培养基的选择和培养方式等需要进行优化。
3.筛选：为了筛选出能够分泌目标抗体的杂交瘤细胞，常会进行抗体的检测。
最常用的方法是酶联免疫吸附测定（ELISA），将培养液中的抗体与特异抗原结合，然后用酶标记的二抗结合，通过酶作用的颜色反应来检测抗体的存在。
4.单克隆化：通常通过稀释法将筛选出的杂交瘤细胞进行单克隆化。
即将细胞进行限稀化，使得每个培养皿上只有一个细胞。
然后扩大单个细胞的培养，并进行抗体检测和细胞鉴定，最终得到稳定的分泌目标抗体的单克隆细胞株。
杂交瘤细胞筛选的原理基于杂交瘤细胞的特性，由于是细胞的融合，杂交瘤细胞可以同时继承两种源细胞的特性。
癌细胞提供了高增殖能力，可以快速扩大细胞数目，从而提高抗体的生产能力；而免疫细胞提供了抗体的生产能力。
通过对杂交瘤细胞的筛选，可以选择出分泌高水平目标抗体的细胞株，从而用于大规模生产特定抗体。
总之，杂交瘤细胞筛选是一种利用细胞融合技术筛选特定细胞株的方法。
通过融合癌细胞和免疫细胞形成杂交瘤细胞，再通过抗体检测的方式筛选出特定抗体分泌细胞，最终可以得到稳定的杂交瘤细胞株。
这种技术
在生物医学和制药领域中具有广泛的应用前景，可以用于生产高效、稳定的蛋白质和抗体等重组产物。
hat培养基筛选杂交瘤细胞的原理
hat培养基筛选杂交瘤细胞的原理
筛选杂交瘤细胞原理是一种用来检测细胞的方法，它可以帮助我们发现不同的基因变化以及个体之间的活动。
筛选杂交瘤细胞使用的荧光技术是一种将少量物质转变成荧光信号的技术。
通过荧光技术，科学家们可以观察一个特定对照组，以及另一个不同的细胞群体。
在这种情况下，研究人员可以观察杂交瘤细胞，并尝试判断去区分哪些细胞是真正的杂交瘤细胞，哪些是质变或未发生突变的细胞。
筛选杂交瘤细胞也可以使用一种称为“hat select”的技术，它是一种在细胞的遗传学性质上控制细胞突变的技术。
“hat select”使用的原理是在受精卵上插入一种含有新基因的病毒，该病毒具有抗生素抵抗力的能力，病毒的基因将与卵染色体的基因结合，从而杂交瘤细胞将具备抗生素抵抗力的可能性。
不同的抗生素将被用来筛选不同的基因变异，并确定有几个药物抵抗力的基因变异。
筛选杂交瘤细胞是一种非常重要的手段，它可以为我们提供有用的信息，以便进行细胞的诊断和治疗。
这种技术的使用不仅可以使细胞的诊断更加准确，而且可以帮助科学家们更好地理解细胞的行为，以及特定紊乱的产生。
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
二轮小专题单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。
第一次筛选的原理和方法：HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理HAT培养基是指含有次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质的细胞培养基。
1.细胞内合成DNA原料的核苷酸形成的途径（1）起始合成途径（denovo pathway）：由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程。
（2）中间合成途径（salvage pathway）：利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。
2.利用HAT培养基筛选杂交瘤细胞（1）经融合后细胞将以多种形式出现：融合的脾细胞—瘤细胞、融合的脾细胞—脾细胞、融合的瘤细胞—瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。
正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。
而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。
（2）融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的中间合成途径缺失株（例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株），即只有起始合成途径。
效应B细胞虽不增殖，但有两条DNA合成途径。
（3）氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻碍起始合成途径。
HAT培养基中含有氨基蝶呤时，细胞只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。
杂交瘤细胞的起始合成途径被氨基喋呤阻断，但可通过中间合成途径利用以培养基中次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷为原料进行合成。
而缺失中间合成途径的瘤细胞，失去增殖能力。
从而选择出杂交瘤细胞。
重复一遍，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D 途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。
HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理审批稿
H A T培养基筛选杂交瘤细胞的原理YKK standardization office【 YKK5AB- YKK08- YKK2C- YKK18】HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理HAT培养基是指含有次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质的细胞培养基。
1.细胞内合成DNA原料的核苷酸形成的途径（1）起始合成途径（de novo pathway）：由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程。
（2）中间合成途径（salvage pa-thway）：利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。
2.利用HAT培养基筛选杂交瘤细胞（1）经融合后细胞将以多种形式出现：融合的脾细胞—瘤细胞、融合的脾细胞—脾细胞、融合的瘤细胞—瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。
正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。
而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。
（2）融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的中间合成途径缺失株（例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株），即只有起始合成途径。
效应B细胞虽不增殖，但有两条DNA合成途径。
（3）氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻碍起始合成途径。
HAT培养基中含有氨基蝶呤时，细胞只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。
杂交瘤细胞的起始合成途径被氨基喋呤阻断，但可通过中间合成途径利用以培养基中次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷为原料进行合成。
而缺失中间合成途径的瘤细胞，失去增殖能力。
从而选择出杂交瘤细胞。
HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理之欧阳美创编
HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理
HAT培养基是指含有次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质的细胞培养基。
1.细胞内合成DNA原料的核苷酸形成的途径
（1）起始合成途径（de novo pathway）：
由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程。
（2）中间合成途径（salvage pa-thway）：
利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。
2.利用HAT培养基筛选杂交瘤细胞
（1）经融合后细胞将以多种形式出现：融合的脾细胞—瘤细胞、融合的脾细胞—脾细胞、融合的瘤细胞—瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。
正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。
而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。
（2）融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的中间合成途径缺失株（例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株），即只有起始合成途径。
效应B细胞虽不增殖，但有两条DNA合成途径。
（3）氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻碍起始合成途径。
HAT 培养基中含有氨基蝶呤时，细胞只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。
杂交瘤细胞的起始合成途径被氨基喋呤阻断，但可通过中间合成途径利用以培养基中次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷为原料进行合成。
而缺失中间合成途径的瘤细胞，失去增殖能力。
从而选择出杂交瘤细胞。
hat筛选杂交瘤细胞原理
hat筛选杂交瘤细胞原理嗨，亲爱的小伙伴！今天咱们来唠唠HAT筛选杂交瘤细胞这个超有趣的事儿。
咱们先得知道啥是杂交瘤细胞呢。
简单来说呀，就是把一种能无限增殖的细胞（像骨髓瘤细胞）和一种能产生特异性抗体的细胞（比如B淋巴细胞）融合在一起，这样就得到了杂交瘤细胞。
这个杂交瘤细胞可厉害啦，它既有骨髓瘤细胞无限增殖的本事，又有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。
那HAT是啥呢？HAT是一种特殊的培养基，它里面有三种关键的成分，分别是次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）。
这就像是一场特殊的考验，只有符合条件的细胞才能在这个培养基里快乐地生长。
对于骨髓瘤细胞来说呢，它有个小毛病。
正常的细胞可以自己合成DNA的一些原料，但是骨髓瘤细胞在氨基蝶呤（A）存在的情况下，它自己合成DNA的路就被堵住了。
因为氨基蝶呤会阻断细胞内嘌呤和嘧啶合成的主要途径。
那骨髓瘤细胞要想在HAT培养基里生长，就得走另外一条路，也就是利用次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）来利用次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）合成DNA。
可是呀，很多骨髓瘤细胞是缺乏HGPRT酶的，所以在HAT培养基里，它就没法生长啦，就像一个找不到路的小迷糊，只能慢慢被淘汰掉。
再说说B淋巴细胞呢，B淋巴细胞本身是正常的细胞，它有HGPRT酶，理论上可以在HAT培养基里生长。
但是呢，B淋巴细胞有个小弱点，它不能无限增殖呀，在培养的过程中，它自己就慢慢不行了，就像一个小蜡烛，燃烧一会儿就熄灭了。
而咱们的杂交瘤细胞就不一样喽。
杂交瘤细胞是融合了骨髓瘤细胞和B淋巴细胞的优点。
它从B淋巴细胞那里得到了HGPRT酶，这样就可以在氨基蝶呤存在的情况下，利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷来合成DNA啦。
同时呢，它又从骨髓瘤细胞那里继承了无限增殖的能力。
所以在HAT培养基里，杂交瘤细胞就像一个超级小战士，能够茁壮成长。
其他不符合条件的细胞，就都被这个特殊的培养基给筛选掉了。
HAT培养基的筛选原则
HAT培养基的筛选原则HAT培养基的筛选原则��HAT系次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。
对具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径（de novo pathway）和中间合成途径（salvage pa-thway）。
由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。
至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死亡。
根据这一点，不仅把混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培养进行选择，例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞，即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。
在这种情况下，利用HAT培养基可对杂种细胞进行选择。
次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料而进行添加。
单克隆抗体技术中也要选择有用的杂种细胞（即能产生抗体，又能无限传代）根据细胞特性，抑制一些细胞的生长，而促进另一些细胞的生长而达到选择的目的。
HAT即次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷的首字母缩写。
显然HAT培养基中含有以上三种物质。
对于合成DNA的原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有其实起始合成途径和中间合成途径。
由于氨基蝶呤可以抑制起始合成途径，故在次培养基上的细胞只有中间合成途径，对于没有中间合成途径的细胞来说，就无法进行合成，而致其死亡，用此原理筛选出杂种细胞。
例如嘌呤的中间产物缺失株和嘧啶中间合成缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞在HAT培养基中可以增殖，故可以达到筛选的目的。
次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可以作为中间合成途径的原料进行添加。
HAT筛选与杂交瘤克隆化的原理方法
HAT筛选与杂交瘤克隆化的原理方法HAT筛选原理： HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。
动物细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。
再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。
另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D 途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。
杂交瘤细胞亚克隆原理：在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3-4次，直至确信每孔中增殖的细胞为单克隆细胞。
第二次筛选也是鉴定的过程。
常用的亚克隆方法为有限稀释法和软琼脂法。
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞(用选择培养基）,第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞.第一次筛选的原理和方法：细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。
其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径(“D途径”)，即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。
再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。
另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断,随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞,因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡.只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖.第二次筛选的原理和方法：在单克隆抗体的生产过程中,由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法之樊仲川亿创作单克隆抗体制备过程中, 有两次筛选过程, 第一次是选出杂交瘤细胞（用选择培养基）, 第二次是进一步选出能发生我们需要的抗体的杂交瘤细胞.第一次筛选的原理和方法：细胞融合后, 杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键.普遍采纳的HAT选择性培养液是在普通的植物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸.其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”）, 即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸, 为DNA分子的合成提供原料.再此合成过程中, 叶酸作为重要的辅酶介入这一过程, 而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物, 可以阻断DNA合成的D途径.另一条途径是应急途径（“S途径”）, 她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸, 两种酶缺一不成.因此, 在HAT培养液中, 未融合的效应B 细胞核两个效应B 细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断, 随S途径正常, 但因缺乏在体外培养液中增殖的能力, 一般10天左右会死亡.对骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言, 由于通常采纳的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞, 因此自身没有S途径, 且D 途径又被氨基蝶呤阻断, 所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡.只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞, 既具有效应B细胞的S途径, 又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性, 因此能在HAT培养液中选择性存活下来, 其实不竭增殖.第二次筛选的原理和方法：在单克隆抗体的生产过程中, 由于效应B细胞的特异性是分歧的, 经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞发生的抗体存在不同, 必需对杂交瘤细胞进行第二次筛选, 选出能发生特定抗体的杂交瘤细胞.二次筛选通常采纳有限稀释克隆细胞的方法, 将杂交瘤细胞多倍稀释, 接种在多孔的细胞培养板上, 是每孔细胞不超越一个, 通过培养让其增殖, 然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体, 上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔.阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞, 继续进行有限稀释, 一般重复3-4次, 直至确信每孔中增殖的细胞为单克隆细胞.第二次筛选也是鉴定的过程.。
hat培养基筛选原理
hat培养基筛选原理Hat培养基筛选原理。
培养基是微生物学中常用的一种实验工具，而培养基的筛选则是指通过特定的方法和条件，从大量的微生物中筛选出所需的目标微生物。
在微生物实验中，常用的培养基筛选方法有很多种，其中hat培养基筛选方法是一种常见且有效的筛选方法。
本文将介绍hat 培养基的筛选原理，希望能对相关领域的研究者有所帮助。
首先，hat培养基是一种含有嘌呤拮抗剂（Hypoxanthine）、腺嘌呤拮抗剂（Aminopterin）和嘌呤（Thymidine）的培养基。
这三种成分分别对DNA合成途径中的嘌呤代谢酶、腺嘌呤代谢酶和嘌呤代谢酶起着抑制作用。
因此，只有细胞内具有这三种酶的微生物才能在hat培养基上生长。
其次，hat培养基的筛选原理是基于微生物对嘌呤、腺嘌呤和嘌呤拮抗剂的敏感性差异。
一般来说，正常的细胞具有嘌呤、腺嘌呤和嘌呤拮抗剂的代谢途径，能够将这些物质转化为细胞内所需的核酸和蛋白质。
而缺乏这些代谢途径的细胞则无法生长。
因此，hat 培养基能够通过这种原理，筛选出对这三种成分敏感的微生物。
在实际操作中，研究者将待筛选的微生物接种在含有hat培养基的琼脂平板上，然后进行培养。
在培养的过程中，对于对hat培养基敏感的微生物，它们将无法在培养基上生长形成克隆，而对于对hat培养基不敏感的微生物，则能够在培养基上生长形成克隆。
通过观察培养基上的克隆情况，研究者就能够筛选出对hat培养基敏感的微生物。
总之，hat培养基筛选原理是基于微生物对嘌呤、腺嘌呤和嘌呤拮抗剂的敏感性差异，利用这种差异来筛选出对这三种成分敏感的微生物。
通过这种筛选方法，研究者能够快速、有效地获得所需的微生物，为微生物学研究和实验提供了重要的工具和支持。
希望本文能够对hat培养基的筛选原理有所帮助，同时也希望读者能够在实际操作中根据具体的研究需求选择合适的培养基筛选方法，为微生物学研究工作的顺利开展提供支持和帮助。
杂交瘤技术的实验原理
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
三、抗体的检测
要求：
常用方法：
简便、快速、敏感; 在短时间内能检测大量样品
酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 双相扩散法
☺短程免疫法
☺体外免疫法
“省时” “操作繁琐”
免疫途径பைடு நூலகம் 皮下注射 腹腔注射 静脉注射
常规免疫法：
第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂 (皮下注射)
第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂 (皮下注射)
第3次免疫：抗原+不加佐剂 (皮下注射或静脉注射) 第4次免疫：抗原+不加佐剂 (静脉注射)
二、细胞融合及HAT筛选
酶联免疫吸附法(ELISA)
技术原理：
有色产物 底物 第2抗体 酶标仪检测
酶
第1抗体 待检杂交瘤培养上清液
抗原
四、克隆化
常用克隆化方法：
有限稀释法 软琼脂平板法
80个细胞/96孔 饲养细胞(feeder cells)
显微操作法
ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清， 选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为 单克隆抗体。
1984年Nobel医学奖
3. 杂交瘤细胞的筛选 ：
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
脾细胞/脾细胞
骨髓瘤细胞/ 骨髓瘤细胞
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞(用选择培养基），第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞。
第一次筛选的原理和方法：细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键.普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。
其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”）,即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。
再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。
另一条途径是应急途径(“S途径”)，她是利用次黄嘌呤-—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断，随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞，因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。
只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖.第二次筛选的原理和方法：在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异,必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个,通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
hat培养基筛选原理
hat培养基筛选原理首先，我们需要了解hat培养基的含义。
hat培养基是一种含有嘌呤类抗生素（Hypoxanthine）、鸟嘌呤（Aminopterin）和嘌呤（Thymidine）的培养基，它可以选择性地筛选出缺乏鸟嘌呤和嘌呤的细胞。
在实验中，我们可以通过添加hat培养基来筛选出对这些物质敏感的细胞，从而进行后续的实验操作。
其次，hat培养基筛选的原理是基于细胞对嘌呤类抗生素的敏感性。
嘌呤类抗生素可以抑制细胞对嘌呤的合成，从而导致细胞无法正常生长和分裂。
而在培养基中添加了鸟嘌呤和嘌呤后，对这些物质敏感的细胞将无法生长，而对这些物质不敏感的细胞则可以正常生长。
因此，通过添加hat培养基，我们可以筛选出对这些物质敏感的细胞，从而进行后续的实验操作。
在实际操作中，我们需要根据实验的需要来选择合适的hat培养基浓度。
一般来说，hat培养基的浓度可以根据实验所用细胞的特性和对嘌呤类抗生素的敏感性来确定。
在进行培养基筛选实验时，我们需要在培养基中添加适量的hat培养基，并将待筛选的细胞接种于其中。
经过一定时间的培养后，我们可以观察细胞的生长情况，从而筛选出对hat培养基敏感的细胞。
除了浓度外，培养基的配制和保存也是影响实验结果的重要因素。
在配制hat培养基时，我们需要严格按照配方比例来添加各种成分，并进行充分的混合和溶解。
此外，我们还需要注意培养基的保存条件，避免其受到污染或变质，从而影响实验结果的准确性。
总之，hat培养基筛选原理是基于细胞对嘌呤类抗生素的敏感性，通过添加hat培养基来筛选出对这些物质敏感的细胞。
在实验中，我们需要根据实验的需要选择合适的培养基浓度，并严格控制培养基的配制和保存条件，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文能为大家对hat培养基筛选原理有所了解，并在实验操作中有所帮助。
hat培养基的原理
hat培养基的原理
Hat培养基是一种含有水杨酸乙酯（5-氨基-4-氧代-5-(2-巯基乙氨基)嘧啶）和次黄嘌呤（6-甲基黄嘌呤）的细胞培养基，用于筛选能够在此培养基中生长的鼠髓瘤细胞株和其他能够在其中生长的细胞株。
Hat培养基的原理基于两种化学物质对细胞鉴别的原理。
首先，水杨酸乙酯（Aminopterin）能够抑制细胞中一种叫做二氢叶酸还原酶的酶，这种酶是细胞在合成嘌呤的过程中所必需的。
因此，添加了Aminopterin 的培养基可以选择性地抑制缺少这种酶的菌株，包括缺乏转座子的、位点变异深度的突变株。
其次，次黄嘌呤（Hypoxanthine）与胞内的魏氏菌或枯草芽孢杆菌共同作用，形成单核苷酸。
单核苷酸是细胞合成DNA和RNA的基本单元，需要通过细胞内特定酶的催化作用得到。
添加了次黄嘌呤的培养基可以选择性地筛选出能够代谢次黄嘌呤的细胞株，在这种培养基中生长良好。
因此，Hat培养基通过两种物质的作用，实现了对具有突变基因的细胞的选择性筛选，能够有选择地筛选出能够生长在其中的细胞株。
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HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理
HAT培养基是指含有次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质的细胞培养基。
1.细胞内合成DNA原料的核苷酸形成的途径
（1）起始合成途径（de novo pathway）：
由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。
在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程。
（2）中间合成途径（salvage pa-thway）：
利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸。
2.利用HAT培养基筛选杂交瘤细胞
（1）经融合后细胞将以多种形式出现：融合的脾细胞—瘤细胞、融合的脾细胞—脾细胞、融合的瘤细胞—瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。
正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。
而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。
（2）融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的中间合成途径缺失株（例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株），即只有起始合成途径。
效应B细胞虽不增殖，但有两条DNA合成途径。
（3）氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻碍起始合成途径。
HAT培养基中含有氨基蝶呤时，细胞只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。
杂交瘤细胞的起始合成途径被氨基喋呤阻断，但可通过中间合成途径利用以培养基中次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷为原料进行合成。
而缺失中间合成途径的瘤细胞，失去增殖能力。
从而选择出杂交瘤细胞。