第章酶免疫技术
免疫酶技术的原理及应用
免疫酶技术的原理及应用免疫酶技术是一种通过使用特定的抗体与抗原相互作用，然后利用酶的活性来检测和分析目标分子的方法。
其原理主要涉及到两个关键步骤：抗原-抗体结合和酶的活性检测。
首先，免疫酶技术的第一步是抗原-抗体结合。
抗原是指引起机体免疫反应的分子，抗体则是由机体产生的对特定抗原具有高度特异性的蛋白质。
在免疫酶技术中，抗原和抗体通过它们之间的亲和性结合在一起。
这一步通常称为“抗原-抗体反应”。
通过特定的反应条件和各种试剂，可以使抗原和抗体结合形成抗原-抗体复合物。
接下来的关键步骤是酶的活性检测。
在免疫酶技术中，通常选择一种酶来标记或连接到抗体上。
当抗原-抗体复合物形成后，酶会与复合物结合。
最常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
一旦复合物与酶结合，就可以加入特定的底物，使酶开始催化底物的转化。
这种底物通常是可以产生颜色变化或发光的物质。
通过对底物的催化反应，酶会产生可测量的信号。
这种信号包括吸光光度、荧光或发光强度等。
这种信号与目标分子的存在呈正相关关系。
因此，可以通过测量信号的强度来确定目标分子的存在和相对数量。
免疫酶技术具有广泛的应用。
其中包括：1. 疾病诊断：免疫酶技术可用于检测和诊断多种疾病，如感染性疾病、肿瘤标志物、自身免疫性疾病等。
通过测量特定标志物的存在和浓度，可以实现早期疾病检测和诊断。
2. 药物研发：免疫酶技术可用于筛选和评估新药物的活性和效果。
通过测量目标分子在药物处理后的变化，可以评估药物的疗效和毒副作用。
3. 环境监测：免疫酶技术可用于环境监测和污染物检测。
通过检测水体、土壤、空气中的污染物，可以评估环境污染的程度和影响。
4. 食品安全：免疫酶技术可用于食品安全监测和检测食品中的有害物质、过敏原等。
这对于确保食品质量和保护消费者的健康至关重要。
总之，免疫酶技术通过结合特异性抗体和酶活性，能够准确、快速地检测和分析目标分子。
它在医学、生物学、环境科学等领域具有广泛的应用价值。
酶免疫技术的实验报告
酶免疫技术的实验报告实验目的：本实验旨在通过酶免疫技术（Enzyme Immunoassay, EIA）来检测特定抗原或抗体的存在，了解其原理和应用，提高实验操作技能。
实验原理：酶免疫技术是一种利用酶标记的抗体或抗原进行检测的方法。
它结合了酶的催化活性和免疫反应的特异性，通过酶的催化作用放大信号，提高检测的灵敏度。
常用的酶免疫技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）等。
实验材料：1. 待测样本：含有目标抗原或抗体的生物样本。
2. 酶标记的抗体或抗原：用于与待测样本特异性结合。
3. 酶底物：与酶反应产生可检测的信号。
4. 标准品：用于建立标准曲线，定量分析。
5. 洗涤液：用于去除未结合的酶标记物。
6. 酶标仪：用于测定吸光度或荧光强度。
实验步骤：1. 准备实验所需的试剂和材料，包括待测样本、酶标记物、酶底物、标准品等。
2. 根据实验设计，选择合适的ELISA方法（直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA等）。
3. 将待测样本和标准品按照一定比例稀释，并加入到预先包被的酶标板中。
4. 孵育一定时间后，用洗涤液清洗酶标板，去除未结合的样本和酶标记物。
5. 加入酶底物，使酶催化底物产生可检测的信号。
6. 在酶标仪上测定吸光度或荧光强度，记录数据。
7. 根据标准品的吸光度或荧光强度，建立标准曲线，计算待测样本中目标抗原或抗体的浓度。
实验结果：通过实验操作，我们得到了以下结果：- 标准曲线的建立：根据标准品的吸光度或荧光强度，绘制出标准曲线，其线性关系良好。
- 待测样本的定量分析：根据标准曲线，计算出待测样本中目标抗原或抗体的浓度。
实验讨论：在本实验中，我们成功地应用了酶免疫技术来检测特定抗原或抗体的存在。
实验结果表明，酶免疫技术具有较高的灵敏度和特异性，适用于生物医学研究和临床诊断。
然而，实验过程中也存在一些局限性，如酶标记物的稳定性、非特异性结合等问题，需要进一步优化实验条件。
实验结论：通过本次实验，我们掌握了酶免疫技术的原理和操作流程，能够利用该技术进行生物样本中特定抗原或抗体的检测。
酶免疫技术
酶免疫技术（Enzyme Immunoassay，EIA）了解：1.酶免疫技术中相关技术环节2.酶免疫测定的应用理解：1.酶免疫技术的分类、测定原理及主要类型2.酶免疫技术的特点掌握：ELISA的基本原理、主要类型、方法、步骤、结果判断一、酶免疫技术概述（一）基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。
EIA：抗原抗体反应的特异性、酶高效催化的专一性（二）基本特点：1.①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性2.②酶促反应专一性，保证特异性3.③底物反应放大作用，提高敏感性4.④酶标试剂保存稳定5.⑤操作简便，安全易行（三）主要试剂的制备与要求：1.酶与酶作用底物(1)用于标记酶的要求：①酶活性高②标记后酶活性稳定,不影响抗原抗体的免疫反应性③酶催化底物后信号易判定或测定④酶活性不受样品中其他成分的影响⑤酶、辅因子及底物理化性质稳定,安全无害、价廉2.酶标记抗体或抗原(1)通过化学反应或者免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或酶结合物。
(2)酶结合物（conjugate）：①酶免疫技术的核心组成部分②直接影响酶免疫技术的应用效果③它的制备是酶免疫技术中非常关键的一个环节①戊二醛交联法②改良过碘酸钠法（直接法）3.固相载体目的：分离游离和结合的酶标志物(1)基本要求①结合容量高，结合稳定②可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合③生物大分子固化后仍保持活性④固化方法简便易行、快捷经济(2)固相载体的种类与选择1)塑料制品（聚苯乙烯）：材料经济，操作简便，易于自动化，最常用2)微颗粒（免疫磁珠）：结合容量大，反应迅速，普遍用于自动化分析3)膜载体（western-blot）：硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA (3)包被与封闭1)包被（coating）：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程，一般采用偏碱（pH 9.6）的碳酸盐溶液2)封闭（blocking）：1％-5％牛血清白蛋白或5％-20％小牛血清，再包被以消除固相载体未覆盖位点产生的非特异干扰二、酶免疫技术的分类（一）均相酶免疫测定基本原理利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。
简述酶免疫技术的原理
简述酶免疫技术的原理
酶免疫技术是一种利用酶作为信号标记物来检测特定分子的技术。
其原理基于酶与底物之间的特异性反应和酶催化反应的高度灵敏性。
酶免疫技术的主要步骤如下：
1. 抗原与抗体结合：在实验中，首先将待检测的抗原与已知与之特异结合的抗体进行反应，形成抗原-抗体复合物。
这里的抗体通常是经过特定方式制备的单克隆或多克隆抗体。
2. 添加酶标记二抗：接下来，将与抗体特异结合的酶标记二级抗体加入反应体系中，并与抗原-抗体复合物作用。
酶标记二抗是一种具有亲和力的抗体，其可与特异抗体发生结合反应。
酶标记二抗上结合有特定的酶，常用的有辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
3. 底物添加和酶反应：在酶标记二抗与抗原-抗体复合物反应完毕后，加入与酶标记物对应的底物，并提供适宜的反应条件。
酶标记物与底物之间发生特异性反应，产生显色、发光或荧光等信号。
4. 信号检测与分析：通过合适的检测方法，例如比色法、放射免疫法、荧光免疫法等，对产生的信号进行测量和分析。
通过测定信号的强度，可以判断待测物质的含量或存在与否。
酶免疫技术的原理基于酶的高催化活性、底物特异性反应以及抗原与抗体的特异结合。
借助于酶与底物之间的反应，可以将待测抗原的信号放大，提高检测
的敏感性和可靠性。
酶免疫技术在分子诊断、生物学研究和生物制药等领域广泛应用。
酶免疫技术原理
酶免疫技术原理酶免疫技术是一种常用的实验技术，其原理是将酶标记的抗体与待检测物相互作用，通过检测酶标记的反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
酶免疫技术可以用于检测抗体、蛋白质、核酸等生物分子，也可以用于定量或半定量分析。
酶免疫技术的步骤通常包括以下几个步骤：1.抗原或抗体的加样和固定将待检测物加入到试剂盒中的孔洞中，然后使其在盒子表面固定。
2.疫苗抗体的反应将已知的疫苗抗体加入到试剂盒孔洞中，使其与待检测物结合。
3.标记酶的加入将用于标记酶的物质加入到试剂盒孔洞中，使其可以与疫苗抗体结合。
4.洗涤用冷凝水或其他方式，将未结合的物质从孔洞中提取出来，以保证准确性。
5.色素反应加入染料或颜料，使得待检测物和标记酶协同反应，产生色素反应。
6.结果的读取和分析根据产生的颜色和染料的浓度，来分析待检测物的浓度和质量。
酶免疫技术通常有两种形式：1.间接ELISA间接ELISA是酶免疫技术中最常用的一种方法。
它利用酶标记的二抗与待检测物的一抗结合，通过检测酶标记反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
间接ELISA具有灵敏度高、特异性好、反应快、操作简便等特点。
2.竞争ELISA竞争ELISA是利用酶标记的抗体与水相抗原或待测物相竞争结合的一种方法。
当待测物或水相抗原与标记抗体竞争时，标记抗体附着在固定物上的数量姗姗而后，细胞内的信号会变弱或消失。
通过测定标记抗体的数量，可以计算出被测物质的含量。
酶免疫技术是一种有效的生物分析技术，其通过简单的实验流程和基于酶反应的原理，可以快速准确地检测分析生物分子的存在和浓度。
酶免疫技术在生物医学、环境科学、食品质量检测等领域有广泛的应用。
1.免疫学研究酶免疫技术在免疫学研究中有着重要的作用。
利用酶免疫技术，可以检测和定量各种免疫球蛋白、细胞因子和细胞表面标志物，研究它们在疾病状态和治疗方案中的作用。
2.临床诊断酶免疫技术在临床诊断中也有很重要的应用。
可以用于检测肿瘤标志物、气道标志物和血液蛋白等，帮助诊断癌症、哮喘和重症肌无力等疾病。
酶免疫技术思维导图
捕获法
用于血清中IgM类抗病原体抗体，测定特异性抗体亚型，类风湿因子
原理：先用抗人IgM（抗人μ链抗体）包被固相载体，以捕获标本中所有IgM，洗涤去除未结合物，加入已知抗原与相对应 的待测IgM结合形成免疫复合物，再加入针对已知抗原的酶标抗体，形成抗人IgM抗体-IgM-抗原-酶标抗体复合物
自动化酶联免疫分析系统
多任务，多通道，平行过程处理
用于小分子抗原或半抗原的测定，属于竞争性结合分析模式
酶放大免疫测定（EMIT）
原理：半抗原与酶结合形成酶标半抗原，保留半抗原与酶的生物活性，当酶标半抗原与抗体结合后，半抗原分子上的酶蛋白与 抗体密切接触，导致酶的活性受到抑制
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫测定
待测标本中半抗原浓度低，与抗体结合的酶标半抗原的比例就高，游离酶标半抗原少，反应显色就越浅，即显色的深浅与样本中待测半抗原的浓度呈正相关。
同一张膜条可以检测多种抗体，检测自身抗体谱
斑点酶免疫吸附实验（dot-ELISA）
实质上是双抗体夹心法
用于单个B细胞分泌抗体的功能检测，从单细胞水平检测细胞分泌的细胞因子或抗体 包被单克隆抗体，成正比
酶联免疫斑点实验
每一个斑点代表一个分泌细胞因子的细胞，PPD（结核菌素）、CEF（T细胞表位肽）
应用于抗原组分及免疫活性测定，艾滋病感染确诊
双抗原夹心法
原理
方法类型与原理
间接法
测抗体，也可以测抗原（少见）
通用性强，但易出现假阳性，时间长，针对免疫球蛋白分子同种型抗原表位，一种酶标二抗检测同一种属中各种与抗 原相对应的抗体，非竞争性结合试验。
原理：先将定量的特异性抗体包被在固相载体表面，待测抗原与定量的酶标抗原竞争性结合固相抗体，结合于固相 的酶标抗原量与待测抗原浓度呈负相关
第三版免疫学检验技术第9-13章中级试题及答案
第九章酶免疫技术一、A11、下图所示的为哪一种ELISA技术的反应原理示意图（）。
A、双抗原夹心法B、双位点一步法C、间接法测抗体D、竞争法E、捕获法2、钩状效应是指用ELISA一步法测定标本中待测抗原时，抗原浓度过（），实测值偏（）的现象，极易造成假阴性A、低，高B、高，高C、高，低D、低，低E、高，不变3、ELISA试验中最常用的标记酶是（）。
A、ASTB、HRPC、ACPD、LDHE、ALT4、酶增强免疫测定技术是最早取得实际应用的（）。
A、均相酶免疫测定B、异相酶免疫测定C、固相酶免疫测定D、液相酶免疫测定E、固相-液相酶免疫测定5、利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体的方法，通常称为（）。
A、双抗体夹心法B、双位点一步法C、间接法D、竞争法E、捕获法6、ELISA中最常用的固相载体是（）。
A、聚氯乙烯B、聚苯乙烯C、三聚氧胺D、琼脂糖E、尼龙膜7、均相酶免疫测定不具有的特点是（）。
A、常用于半抗原和小分子的检测B、操作简便，易于自动化C、不易受样品中的内源性酶的干扰D、酶与抗原结合后仍保留酶和抗原的活性E、灵敏度不及异相酶免测定8、酶增强免疫测定技术（EMIT）是一种（）。
A、非均相酶免疫测定技术B、均相酶免疫测定技术C、酶免疫组织化学技术D、酶免疫测定与电泳相结合的技术E、电泳技术9、ELISA板包被后，最常用的封闭物质是（）。
A、人白蛋白B、人球蛋白C、牛血清白蛋白D、牛血清球蛋白E、鼠白蛋白10、可用免疫渗滤试验和免疫层析试验检测的项目没有（）。
A、抗HCV B、HIV C、HCG D、HBsAg E、HAV11、制备抗体酶结合物的方法通常采用（）。
A、戊二醛交联法B、糖原染色法C、免疫印迹法D、酶耦联测定法E、捕获竞争法12、下列不属于ELISA测定方法中所必需的试剂（）。
A、固相的抗原或抗体B、酶标记的抗原或抗体C、酶作用的底物D、戊二醛交联剂E、稀释的血清13、斑点免疫层析试验最常用的载体材料是（）。
第八章酶免疫技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶免疫技术名词解释
酶免疫技术名词解释酶免疫技术是一种广泛应用于生命科学、生物技术和医学领域的技术。
它是利用酶作为探针，实现分子分析和检测的一种方法。
酶免疫技术拥有许多独特的优点，如高度灵敏、特异性强、操作简便等，因此被广泛应用于临床诊断、生物医学研究、环境监测和食品安全等领域。
下面是一些关于酶免疫技术相关的名词解释。
1. 酶标记：酶标记是指在酶免疫技术实验中，通过对探针分子进行修饰，使其与酶结合并形成稳定的复合物。
这种复合物可以作为信号源，在检测过程中被检测出来。
2. 性能参数：在酶免疫技术实验中，用来评估探针的性能的参数。
包括特异性，敏感性，可重复性等。
这些参数决定了实验的可靠性和准确性。
3. 单抗：单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是一种特殊的抗体，可与目标分子的特定区域（表位）结合。
在酶免疫技术实验中，单抗被广泛应用于酶标记和检测分析。
4. 酶免疫法（ELISA）：酶免疫法是一种利用酶做为标记物，通过对抗体与抗原之间的特异性结合来检测抗原或抗体的方法。
这种方法广泛应用于多种疾病的诊断和治疗。
5. 酶反应体积：在酶免疫技术实验中，所需的反应体积越小，检测灵敏度越高。
然而，不同反应最优的体积需要通过实验来确定。
6. 活化酶底物：活化酶底物是一种反应物，被酶催化后可以产生可检测的信号，如荧光、发光、吸收光谱等。
在酶免疫技术实验中，活化酶底物被广泛应用于酶标记和检测分析。
7. 酶聚合素链反应（EPCR）：酶聚合素链反应是一种利用DNA聚合酶复制DNA分子的技术。
在酶免疫技术中，EPCR被广泛应用于检测遗传学分析。
8. 分子探针：分子探针是一种有机分子，在酶免疫技术中用于特定分子的检测。
它们可以与互补的DNA或RNA 配对，并用作免疫试剂或标记物。
分子探针在分子诊断学中起着至关重要的作用。
9. 酶抑制剂：酶抑制剂是一种分子化合物，可以抑制酶的活性。
在酶免疫技术中，酶抑制剂被广泛应用于检测分析中，以增加检测灵敏度和准确性。
酶免疫技术
酶免疫技术：加速疾病检测的显微镜
酶免疫技术是一种高灵敏度、高特异性的检测方法，被广泛应用于医疗、食品安全、环境检测等领域。
该技术基于酶和抗原或抗体的特异性结合，利用化学反应转化出光、色或荧光信号，进而检测目标物质。
酶免疫技术的优势在于其对微量物质的检测能力，这使得其在疾病早期检测、病毒感染的筛查、癌症标志物的检测等方面具有广泛的应用前景。
同时，其简单快速、操作灵活、适应性强等特点也使其成为一个备受关注的研究热点。
一般而言，酶免疫技术包括ELISA、Western blot、免疫电泳等多种形式，不同的应用场景需要选择不同的技术。
其中，ELISA技术是最常见、最常用的酶免疫技术，其原理是将检测目标物质在固相载体上捕获，然后通过酶标记的抗体进行检测。
该技术被广泛应用于疾病检测、环境污染物的检测等领域。
虽然酶免疫技术在很短的时间内已经成为了最常用的检测方法之一，但仍有一些问题需要解决。
其中，对标准样品的控制、抗体的质量保证、检测灵敏度的提高等问题需要进一步改进和完善。
总之，作为一种成熟的检测技术，酶免疫技术在医疗、环保等领域的应用前景广阔，而其不断的技术创新和改进也将进一步提高其检测灵敏度和特异性，促进医疗诊断和环保监测的发展。
主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第九章 酶免疫技术
第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。
它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保留了抗体或抗原的免疫学活性，同时又保留了酶对底物的催化活性。
在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。
它通过利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高了抗原抗体反应的敏感性。
它具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好、酶标记试剂能够较长时间保持稳定、操作简便、对环境没有污染等优点，而且容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。
一、酶和酶作用底物（一）酶的要求1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。
2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。
3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。
4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。
5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
（二）常用的酶1.辣根过氧化物酶（HRP）2.碱性磷酸酶（AP）3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）（三）常用的底物1.辣根过氧化物酶的底物（1）邻苯二胺（OPD）0PD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液中。
（2）四甲基联苯胺（TMB） ELISA中应用最广泛的底物。
（3）其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）也是HRP常用的底物。
2.碱性磷酸酶（AP）的底物3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）常用对-硝基苯磷酸脂（p-NPP），p-NPP经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。
常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。
免疫学检验中的酶免疫技术
免疫学检验中的酶免疫技术20世纪中期，以放射免疫技术为代表的标记免疫技术相继问世，它将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少。
这些将标记技术与抗原抗体反应结合起来的免疫学检测技术以其敏感性高、准确性好、操作简便、易于商品化和自动化等特点逐渐替代了凝集、沉淀等经典的免疫学检验技术，不仅用于抗原、抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等免疫相关物质的检测，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等体液中各种微量物质的检查，可以说一切具有抗原性或半抗原性的物质原则上均可利用现代免疫检验技术进行检测，使免疫学检验渗透到医学的各个领域。
目前，免疫学检验中的标记技术主要包括酶免疫技术、荧光免疫技术、放射免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术等。
其中酶免疫技术是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。
作为经典的三大标记技术之一，酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新。
一、常用的酶及显色底物在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强；与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点，目前常用的酶及底物见表1。
表1 常用酶及底二、标记物的制备在酶免疫技术中制备标记物的抗原应纯度高、抗原性完整；制备标记物的抗体应特异性好、效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产和易于分离纯化。
制备酶标记物的方法应符合简单、产量高；避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物；标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。
标记物制备的方法基本属于两类：（一）交联法交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶-戊二醛-抗体（抗原）（二）直接法直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。
酶免疫分析技术
物后的显色程度确定待检抗体含量。
第七章
酶免疫分析技术
间接法检测抗体
酶标二抗 标本（含抗体） 固相抗原 E
E
底物
E
第七章
酶免疫分析技术
2．技术要点
（1）将特异性抗原包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加稀释的受检血清，洗涤。 （3）加酶标二抗，洗涤。
（4）加底物显色，颜色深度代表标本中待检抗体
的量。
稀释后重新测定。
第七章
酶免疫分析技术
（三）竞争法检测抗原 1．原理
酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有
相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。 免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中 待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗 原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反
之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含
目
1 2 3
录
概述 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验的应用和注意事项 其他酶标记免疫测定技术
返回总目录
4
第七章
酶免疫分析技术
酶免疫分析技术的分类
酶免疫组织化学技术 酶放大免疫测定技术 酶免疫分析技术 酶免疫测定技术 非均相酶免疫测定 液相酶免疫测定 均相酶免疫测定 克隆酶供体免疫测定 固相酶免疫测定
第七章
酶免疫分析技术
（三）β-半乳糖苷酶
（β-galactosidase，β-Gal）
源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基βD半-乳糖苷 （ 4MUG ）
酶作用后，生成高强度荧 光物 ，用荧光计测量。
第七章
酶免疫分析技术
（四）其他酶 在商品试剂中，经常应用的酶还有葡萄糖
酶免疫技术
酶免疫技术酶免疫技术是一种广泛应用于生物科学领域的技术，可以用于检测、诊断、研究和治疗各种疾病。
它利用酶作为标记分子，结合抗原-抗体反应原理，通过酶的催化作用来检测、测定或定位目标物质。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高稳定性的特点，在医学、生物学和生物化学等领域有着广泛的应用。
酶免疫技术的基本原理是利用抗原与抗体的特异性结合，将抗原或抗体与酶标记物结合形成复合物，再通过酶的催化作用来检测目标物质的存在或浓度。
常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）和β-半乳糖苷酶（β-gal）等。
这些酶标记物可以与底物反应产生可测定的信号，如光、发光、颜色等。
酶免疫技术在临床诊断中起到了重要的作用。
例如，酶免疫分析技术（ELISA）可以用于检测人体内的抗体或抗原，用于诊断某些传染性疾病，如艾滋病、乙肝等。
ELISA技术的灵敏度高，特异性强，成本低，操作简单，因此被广泛应用于临床实验室中。
此外，酶免疫技术还可以用于检测药物、毒素、激素等物质的浓度，提供了临床药物监测和药物治疗的重要手段。
在生物学和生物化学研究中，酶免疫技术也发挥着重要的作用。
例如，免疫组织化学染色技术可以用于检测组织或细胞中特定蛋白的表达情况，从而研究蛋白的功能和相互作用。
此外，酶免疫技术还可以用于检测基因表达水平、蛋白质相互作用、酶动力学研究等领域。
酶免疫技术在生物科学领域的广泛应用离不开其优势和特点。
首先，酶免疫技术具有高灵敏度和高特异性，可以检测目标物质的极低浓度。
其次，酶免疫技术的结果可定量测定，可以提供准确的数据。
此外，酶免疫技术的操作简单，结果可视化，易于分析和解释。
最重要的是，酶免疫技术具有较好的重复性和稳定性，可以用于大规模的实验和临床检测。
酶免疫技术是一种重要的生物学和医学研究工具，具有广泛的应用前景。
它在临床诊断、生物学研究和药物研发等领域发挥着重要作用。
随着科学技术的不断发展，酶免疫技术将不断完善和创新，为人类的健康和生命科学研究提供更多的支持和帮助。
酶免疫组化技术的原理
酶免疫组化技术的原理引言酶免疫组化技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析蛋白质、抗体或其他生物分子在生物样本中的存在和浓度。
它基于抗原-抗体反应的原理，通过酶标记的二抗或底物使产生的信号与待检测分子的浓度呈正相关，从而实现对目标物质的检测和定量。
ELISA的原理ELISA技术主要包括间接ELISA、直接ELISA、竞争ELISA和抗体夹心ELISA等几种类型。
下面分别介绍每种类型的原理。
间接ELISA1.固相吸附：将待检测抗原分子溶液加入酶标板的孔中，经过一定条件下的孵育，使抗原分子与酶标板表面的特异性抗体结合。
孔中未结合的抗原分子将被洗去，以去除非特异性结合。
2.抗原结合：孔中的抗原结合的特异性抗体与待检测抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
这个特异性抗体是用于检测待检测抗原的抗体。
3.二抗结合：加入酶标记的次抗体，如HRP标记的抗人IgG二抗，在孔中与第二抗体结合。
这一步增强了免疫反应的信号，提高了ELISA的敏感性。
4.底物反应：加入底物溶液，在酶的作用下，底物发生染色反应或发光反应。
反应的颜色或荧光强度与待检测抗原的浓度成正比。
5.读取结果：通过光谱仪或酶标仪测定底物反应的信号强度，进而计算出待检测抗原的浓度。
直接ELISA1.固相吸附：将待检测抗原分子溶液加入酶标板的孔中，经过一定条件下的孵育，使抗原分子与酶标板表面的特异性抗体结合。
2.抗原结合：孔中的抗原结合的特异性抗体与待检测抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
3.酶标记抗原结合：加入酶标记的特异性抗体，该抗体与待检测抗原上的非特异性抗体结合。
这个酶标记的特异性抗体用于检测待检测抗原的抗体。
4.底物反应：加入底物溶液，在酶的作用下，底物发生染色反应或发光反应。
反应的颜色或荧光强度与待检测抗原的浓度成正比。
5.读取结果：通过光谱仪或酶标仪测定底物反应的信号强度，进而计算出待检测抗原的浓度。
简述酶免疫技术的分类
酶免疫技术：分类及应用
酶免疫技术是许多生化分析和医学诊断中重要的一种工具。
它基于抗原与抗体间的特异性反应，将酶标记的抗体或抗原作为探针，通过检测其酶反应产物来检测并定量目标分子。
酶免疫技术种类繁多，主要分为以下几类：
1.酶联免疫吸附测定法(ELISA)
这是一种常用于诊断感染性疾病、肿瘤和免疫相关疾病的方法。
它利用酶标记的抗体或抗原作为探针，检测血清、尿液、唾液等生物样品中的分子。
ELISA可以快速、准确地检测出细菌和病毒感染的抗体和抗原，是一种常见的诊断方法。
2.免疫斑点法
由于其简单和方便的特点，这种技术常用于检测微透镜膜穴、肺结核和疱疹病毒的感染。
免疫斑点法也可用于检测各种细胞因子，如白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）-γ等。
3.免疫层析技术
免疫层析技术也称为免疫固相卡，利用固相化学材料吸附抗体或抗原，将它们与待测分子结合，从而完成检测。
该技术可以快速完成检测，广泛用于检测激素、蛋白质等分子结构查询。
4.F快速诊断技术
该技术可用于基于解离测试的负压移位检测，可检测多种微生物、各种传染病以及不同种类的癌症。
快速诊断技术可以快速、准确地检测出更多感染疾病的标记分子，是一种非常灵敏的定量技术。
酶免疫技术已经广泛应用于医学诊断、药物开发和基因工程。
通过不同的酶免疫技术，可以检测、分析和探索多种分子的生物学特性，有助于促进科学研究和临床医学的进步和发展。
第三版免疫学检验技术第章中级试题及答案
第九章酶免疫技术 一、A1 1、下图所示的为哪一种ELISA 技术的反应原理示意图（）。
A 、双抗原夹心法B 、双位点一步法C 、间接法测抗体D 、竞争法E 、捕获法 2、钩状效应是指用ELISA 一步法测定标本中待测抗原时，抗原浓度过（），实测值偏（）的现象，极易造成假阴性A 、低，高B 、高，高C 、高，低D 、低，低E 、高，不变3、ELISA 试验中最常用的标记酶是（）。
A 、AST B 、HRPC 、ACPD 、LDHE 、ALT 4、酶增强免疫测定技术是最早取得实际应用的（）。
A 、均相酶免疫测定B 、异相酶免疫测定C 、固相酶免疫测定D 、液相酶免疫测定E 、固相-液相酶免疫测定 5、利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体的方法，通常称为（）。
A 、双抗体夹心法B 、双位点一步法C 、间接法D 、竞争法E 、捕获法6、ELISA 中最常用的固相载体是（）。
A 、聚氯乙烯B 、聚苯乙烯C 、三聚氧胺D 、琼脂糖E 、尼龙膜 7、均相酶免疫测定不具有的特点是（）。
A 、常用于半抗原和小分子的检测B 、操作简便，易于自动化C 、不易受样品中的内源性酶的干扰D 、酶与抗原结合后仍保留酶和抗原的活性E 、灵敏度不及异相酶免测定 8、酶增强免疫测定技术（EMIT ）是一种（）。
A 、非均相酶免疫测定技术B 、均相酶免疫测定技术C 、酶免疫组织化学技术D 、酶免疫测定与电泳相结合的技术 E 、电泳技术9、ELISA 板包被后，最常用的封闭物质是（）。
A 、人白蛋白B 、人球蛋白C 、牛血清白蛋白 D 、牛血清球蛋白 E 、鼠白蛋白10、可用免疫渗滤试验和免疫层析试验检测的项目没有（）。
A 、抗HCV B 、HIV C 、HCG D 、HBsAg E 、HAV11、制备抗体酶结合物的方法通常采用（）。
A 、戊二醛交联法 B 、糖原染色法 C 、免疫印迹法 D 、酶耦联测定法 E 、捕获竞争法12、下列不属于ELISA 测定方法中所必需的试剂（）。
酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用
酶免疫分析的优点与局限性
优点
高灵敏度、高特异性、操作简便、适用于大量样本检测等。
局限性
对某些结构相似的物质可能存在交叉反应，对某些小分子物质检测效果不佳，以及易受非特异性背景干扰等。
03 酶免疫分析技术在生物药 物分析中的应用实例
生物药物中蛋白质的分析
蛋白质的定量分析
酶免疫分析技术可以用于蛋白质的定量分析，通过标记酶和抗体结合，利用酶催化底物反应产生光信 号或电信号，实现对蛋白质的定量检测。
02
通过酶免疫分析技术，可以快 速、准确地检测生物药物中的 有效成分和杂质，为药物质量 控制提供了有力支持。
03
酶免疫分析技术的应用，还推 动了相关领域的技术创新和产 业升级，为生物医药产业的可 持续发展做出了重要贡献。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
酶免疫分析技术可以用于各 种不同类型的生物药物分析， 包括小分子和大分子药物、 蛋白质、细胞因子等。
酶免疫分析技术可以与自动 化仪器相结合，实现高通量、 自动化的药物分析，提高了 分析效率。
酶免疫分析技术的挑战
交叉反应
尽管酶免疫分析技术的特异性较高，但仍有可能出现交叉反应， 影响检测结果的准确性。
样品处理
生物样品的处理和前处理对酶免疫分析技术的结果有很大影响，需 要严格控制样品的质量和处理方法。
成本较高
酶免疫分析技术需要使用昂贵的试剂和仪器，导致分析成本较高。
酶免疫分析技术的发展前景
新技术的应用
随着新技术的发展，如纳米技术、微流 控技术等，酶免疫分析技术有望实现更 快速、更灵敏、更简便的药物分析。
蛋白质的定性分析
通过酶免疫分析技术，可以检测蛋白质的特异性抗原或抗体，从而对蛋白质进行定性分析，有助于确 定蛋白质的来源和功能。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
克隆酶供体免疫分析 CEDIA
cloned enzyme donor immunoassay
EMIT 示意图
CEDIA 示意图
二、非均相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
? 分类： 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
?固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面
?固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用 方法
固相载体
要求
?结合抗体或抗原的容量大 ?抗体或抗原牢固地固定在其表面 ?不影响免疫反应性 ?利于反应充分进行 ?固相方法简便易行，快速经济
种类
?塑料制品 ?微颗粒 ?膜载体
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计 测 量。
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
酶结合物 （conjugate ）
酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的
结合物
酶标记抗体或抗原
制备方法要求
?抗原要求纯度高，抗原性完整 ?抗体需要特异性好、效价高、亲 合力强以及比活性较高，能批量生 产，易纯化。
酶 免 技 术
第一节 酶免疫技术的特点
原理及特点
抗原抗体反应的特异性
+
酶高效催化反应的专一性
? 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原
? 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
原理及特点
原理：
?酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应
?酶对底物的显色反应
?对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析
以聚苯乙烯等材料作为固相载体免 疫测定
第三节 酶联免疫吸附试验
一、基本原理
原理 包被
1
洗涤
3
使结合在固相上
的抗原抗体复合物
与未结合的分离
2
反应
加入待测抗体或
抗原和酶标抗原
或抗体
4 底物显色
定性或定量的分析
二、方法类型及反应原理
三个必要试剂
包被与封闭
包被 coating
将抗原或抗体结合于固相载体
封闭 blocking
用1% ～5% 的牛血清白蛋白或 5% ～20% 小 牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消 除非特异性吸附
第二节 酶免疫技术分类
酶
酶免疫组化 组织切片或其它标本中抗原的定位
免
疫
均相
技
术 酶免疫测定
液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
供氢体DH 2 习惯上被称为底物，底物有多种
酶和酶作用底物
常用底物
邻苯二胺 OPD
四甲基联苯胺 TMB HRP 的常见底物
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′ -氨基-二(3-乙基-苯并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
酶和酶作用底物
HRP 的常见底物
OPD反应后显橙 黄色，加酸终止 反应后呈棕黄色， 测定波长492nm 。 不稳定，致癌性。
特点：
?灵敏度高、特异性强、 准确性好
?酶标记试剂能够较长时 间保持稳定
?操作简便、对环境没有 污染。
?易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的
新方法。
一、酶和酶作用底物
标记酶的要求：
活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
优点
? 容易提取 ? 价格低廉 ? 性质稳定，耐热，与抗原抗体偶联后活
性很少损失
酶和酶作用底物
常用酶
碱性磷酸酶（AP ）
菌源性AP 肠粘膜AP
β –半乳糖苷酶（β -Gal ）
用于均相酶 免疫测定
酶和酶作用底物
常用底物
HRP 的底物
HR DH2+H2O2P→ → → D+2H 2O
H2O2为受氢体，HRP 对受氢体的专一性很 高
酶标记抗体或抗原
制备方法要求
技术方法简单、产率高，重复性 好
标记反应不影响酶和抗原或抗体 的活性
酶标记物稳定 ，不形成聚合物
酶标记抗体或抗原
制备方法
过碘酸钠法（直接法）
常用于HRP 标记抗体或抗原
戊二醛交联法
酶标记抗体或抗原
戊二醛交联法
戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别 与HRP 和蛋白质分子中的氨基结合。该法 有一步法和二步法。二步法标记效率比一 步法高，酶标记物质量较均一。
固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物 ）
酶反应的底物
ELISA 检测抗原的方法
双抗体夹心法
? 方法： 用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶
标抗体，加底物显色
? 应用：
二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等
酶和酶作用底物
常用酶
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位U比RZ 值更为重要
辣根过氧化物酶（HRP ）
纯度用RZ( 纯度数)值： 403nm （辅基） 与275nm （主酶） OD( 吸光度) 值之比
ELISA 中应用最为广 泛的标记用酶
酶标记抗体或抗原
纯化及鉴定
标记完成后应除去反应液中的游离 酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以 及抗体或抗原聚合物，避免游离酶 增加非特异显色，以及游离抗体或 抗原起竞争作用而降低特异性染色 强度
常用的纯化方法： 葡聚糖凝胶G-200/G-150 过柱 层析纯化 50% 饱和硫酸铵沉淀提纯
三、固相载体
章酶免疫技术
节 酶免疫技术的特点 一、酶和酶作用底物 二、酶标记抗体或抗原 三、固相载体
第二节酶免疫技术的分类 一、均相酶免疫测定 二、非均相酶免疫测定 第三节 酶联免疫吸附试验 一、基本原理 二、方法类型及反应原理
思考题 小结
三大三经大典经标典记技标术记技术
放 射 免 技 术
发 光 免 技 术
TMB 反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA 中 应用最广泛的底物。
AP 的 底物
酶和酶作用底物
常用底物
对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ）
经AP 作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm 。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β -D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
固相酶免疫测定
非均相
液相酶免疫测定
一、均相酶免疫测定
用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定
原理 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标
记酶的活性会发生改变，不用分离结合和 游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的 改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶放大免疫测定技术EMIT