第八章酶免疫技术
《酶免疫分析技术》课件
酶免疫分析技术在生物工程中广泛应用，如蛋 白质表达、酶催化反应和抗体筛选等。
优点与局限
1 优点
酶免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性、 广泛适应性和操作简便等优点。
2 局限
酶免疫分析技术的局限主要包括影响因素较 多、标记物抗原性和稳定性的要求高等限制。
总结
《酶免疫分析技术》是一种重要的生物分析方法，其原理和应用领域广泛。通过本课件的学习，我们对酶免疫 分析技术有了更深入的了解，并了解到其优点和局限。谢谢大家的聆听！
为什么选择酶作为标记物？
酶具有活性强、稳定性好、催化效率高等特点，可以产生放大效应，大幅提高测定的灵敏度。
酶免疫分析技术的发展历程
酶免疫分析技术自20世纪70年代初提出以来，经过不断创新和发展，已成为生物医学和环 境检测领域的重要分析方法。
酶免疫分析技术的原理
酶底物反应原理
酶标记的免疫试剂与待检测物结 合后，通过酶底物的催化反应产 生可检测的信号，如颜色、发光 或电流。
《酶免疫分析技术》PPT 课件
这是一份《酶免疫分析技术》的PPT课件，通过本课件，我们将深入介绍酶 免疫分析技术的原理、主要实现步骤、应用、优点与局限等内容。让我们开 始学习吧！
绪论
什么是酶免疫分析技术？
酶免疫分析技术是一种高灵敏度、高特异性的生物分析方法，通过酶标记的免疫试剂与待检 测物发生特异性反应，再利用酶对底物的催化作用产生信号。
3
信号产生
通过酶底物反应或其他方式，产生与待检测物浓度相关的可检测信号。
酶免疫分析技术的应用
医学诊断
酶免疫分析技术在临床医学中广泛应用，如血 液病、感染性疾病和肿瘤标志物的检测。
环境监测
酶免疫分析技术可用于水质、土壤和空气中有 害物质的监测，对环境污染的快速筛查具有重 要意义。
酶免疫技术
酶免疫技术（Enzyme Immunoassay，EIA）了解：1.酶免疫技术中相关技术环节2.酶免疫测定的应用理解：1.酶免疫技术的分类、测定原理及主要类型2.酶免疫技术的特点掌握：ELISA的基本原理、主要类型、方法、步骤、结果判断一、酶免疫技术概述（一）基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。
EIA：抗原抗体反应的特异性、酶高效催化的专一性（二）基本特点：1.①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性2.②酶促反应专一性，保证特异性3.③底物反应放大作用，提高敏感性4.④酶标试剂保存稳定5.⑤操作简便，安全易行（三）主要试剂的制备与要求：1.酶与酶作用底物(1)用于标记酶的要求：①酶活性高②标记后酶活性稳定,不影响抗原抗体的免疫反应性③酶催化底物后信号易判定或测定④酶活性不受样品中其他成分的影响⑤酶、辅因子及底物理化性质稳定,安全无害、价廉2.酶标记抗体或抗原(1)通过化学反应或者免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或酶结合物。
(2)酶结合物（conjugate）：①酶免疫技术的核心组成部分②直接影响酶免疫技术的应用效果③它的制备是酶免疫技术中非常关键的一个环节①戊二醛交联法②改良过碘酸钠法（直接法）3.固相载体目的：分离游离和结合的酶标志物(1)基本要求①结合容量高，结合稳定②可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合③生物大分子固化后仍保持活性④固化方法简便易行、快捷经济(2)固相载体的种类与选择1)塑料制品（聚苯乙烯）：材料经济，操作简便，易于自动化，最常用2)微颗粒（免疫磁珠）：结合容量大，反应迅速，普遍用于自动化分析3)膜载体（western-blot）：硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定量的斑点ELISA (3)包被与封闭1)包被（coating）：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程，一般采用偏碱（pH 9.6）的碳酸盐溶液2)封闭（blocking）：1％-5％牛血清白蛋白或5％-20％小牛血清，再包被以消除固相载体未覆盖位点产生的非特异干扰二、酶免疫技术的分类（一）均相酶免疫测定基本原理利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。
酶免疫技术原理
酶免疫技术原理酶免疫技术是一种常用的实验技术，其原理是将酶标记的抗体与待检测物相互作用，通过检测酶标记的反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
酶免疫技术可以用于检测抗体、蛋白质、核酸等生物分子，也可以用于定量或半定量分析。
酶免疫技术的步骤通常包括以下几个步骤：1.抗原或抗体的加样和固定将待检测物加入到试剂盒中的孔洞中，然后使其在盒子表面固定。
2.疫苗抗体的反应将已知的疫苗抗体加入到试剂盒孔洞中，使其与待检测物结合。
3.标记酶的加入将用于标记酶的物质加入到试剂盒孔洞中，使其可以与疫苗抗体结合。
4.洗涤用冷凝水或其他方式，将未结合的物质从孔洞中提取出来，以保证准确性。
5.色素反应加入染料或颜料，使得待检测物和标记酶协同反应，产生色素反应。
6.结果的读取和分析根据产生的颜色和染料的浓度，来分析待检测物的浓度和质量。
酶免疫技术通常有两种形式：1.间接ELISA间接ELISA是酶免疫技术中最常用的一种方法。
它利用酶标记的二抗与待检测物的一抗结合，通过检测酶标记反应产物来间接检测待检测物的存在或浓度。
间接ELISA具有灵敏度高、特异性好、反应快、操作简便等特点。
2.竞争ELISA竞争ELISA是利用酶标记的抗体与水相抗原或待测物相竞争结合的一种方法。
当待测物或水相抗原与标记抗体竞争时，标记抗体附着在固定物上的数量姗姗而后，细胞内的信号会变弱或消失。
通过测定标记抗体的数量，可以计算出被测物质的含量。
酶免疫技术是一种有效的生物分析技术，其通过简单的实验流程和基于酶反应的原理，可以快速准确地检测分析生物分子的存在和浓度。
酶免疫技术在生物医学、环境科学、食品质量检测等领域有广泛的应用。
1.免疫学研究酶免疫技术在免疫学研究中有着重要的作用。
利用酶免疫技术，可以检测和定量各种免疫球蛋白、细胞因子和细胞表面标志物，研究它们在疾病状态和治疗方案中的作用。
2.临床诊断酶免疫技术在临床诊断中也有很重要的应用。
可以用于检测肿瘤标志物、气道标志物和血液蛋白等，帮助诊断癌症、哮喘和重症肌无力等疾病。
酶免疫技术思维导图
捕获法
用于血清中IgM类抗病原体抗体，测定特异性抗体亚型，类风湿因子
原理：先用抗人IgM（抗人μ链抗体）包被固相载体，以捕获标本中所有IgM，洗涤去除未结合物，加入已知抗原与相对应 的待测IgM结合形成免疫复合物，再加入针对已知抗原的酶标抗体，形成抗人IgM抗体-IgM-抗原-酶标抗体复合物
自动化酶联免疫分析系统
多任务，多通道，平行过程处理
用于小分子抗原或半抗原的测定，属于竞争性结合分析模式
酶放大免疫测定（EMIT）
原理：半抗原与酶结合形成酶标半抗原，保留半抗原与酶的生物活性，当酶标半抗原与抗体结合后，半抗原分子上的酶蛋白与 抗体密切接触，导致酶的活性受到抑制
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫测定
待测标本中半抗原浓度低，与抗体结合的酶标半抗原的比例就高，游离酶标半抗原少，反应显色就越浅，即显色的深浅与样本中待测半抗原的浓度呈正相关。
同一张膜条可以检测多种抗体，检测自身抗体谱
斑点酶免疫吸附实验（dot-ELISA）
实质上是双抗体夹心法
用于单个B细胞分泌抗体的功能检测，从单细胞水平检测细胞分泌的细胞因子或抗体 包被单克隆抗体，成正比
酶联免疫斑点实验
每一个斑点代表一个分泌细胞因子的细胞，PPD（结核菌素）、CEF（T细胞表位肽）
应用于抗原组分及免疫活性测定，艾滋病感染确诊
双抗原夹心法
原理
方法类型与原理
间接法
测抗体，也可以测抗原（少见）
通用性强，但易出现假阳性，时间长，针对免疫球蛋白分子同种型抗原表位，一种酶标二抗检测同一种属中各种与抗 原相对应的抗体，非竞争性结合试验。
原理：先将定量的特异性抗体包被在固相载体表面，待测抗原与定量的酶标抗原竞争性结合固相抗体，结合于固相 的酶标抗原量与待测抗原浓度呈负相关
酶免技术
洗涤液与稀释液
在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐 温-20磷酸缓冲盐水（PBS,pH7.4）。
终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸。 常用的AP反应终止液为碳酸钠。
四、固相酶免疫测定仪（酶标仪） 比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速 度、震板功能、温度控制、定性和定量的软 件，自动洗板、温育、加样 450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、 405nm
1.抗原或抗体的固相化 ； 2.抗原或抗体的酶标记 ； 3.受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗 原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗 体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或 抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量 与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后， 底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的 量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
OPD反应后显橙黄色， 加酸终止反应后呈 棕黄色，测定波长 492nm。不稳定，致 癌性。
酶和酶作用底物
常用底物
AP的 底物 对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ） 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
另：葡萄糖氧化酶、糖化酶、乙酰胆碱酯酶等
酶和酶作用底物
底物选择：
1.底物应该是无色，经酶催化后有明显颜色变化； 2.所显色泽易于洗脱； 3.显色后的产物要稳定，定量检测时所产生的有
色物质应是可溶的； 4.价廉、易得、无毒。
酶和酶作用底物
常用底物
HRP的底物
酶免疫技术的特点方法原理
酶免疫技术的特点方法原理酶免疫技术的特点方法原理免疫酶技术是指在一定的生物反应器内,利用酶的催化作用,进行物质转化的技术.其应用范围已遍及工业、医药、农业、化学分析、环境保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面。
下面是店铺给大家酶免疫技术的特点方法原理，希望能帮到大家!酶免疫技术的特点(1)酶和酶作用的底物：①辣根过氧化酶(HRP)：是一种糖蛋白，含糖量约18%;分子量为44kD;是一种复合酶，由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成的一种卟啉蛋白质。
主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰;辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。
在反应中H2O2是受氢体底物，DH2无色的供氢体底物，在HRP的催化下脱氢而显色，此即HRP作为示踪物的原理。
②碱性磷酸酶(AP)：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。
从大肠杆菌提取的最适pH为8.0;用小牛肠粘膜提取的AP最适pH为9.6。
③其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。
(2)酶标记的抗体或抗原：称为结合物。
制备方法通常有戊二醛交联法(包括有一步法和二步法)和过碘酸盐氧化法。
标记抗体的最佳用量：通常采用棋盘滴定法进行滴定。
(3)固相载体：主要试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。
可作固相载体物质最常用的是聚苯乙烯。
与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。
聚苯乙烯作为ELISA固相载体，载体还包括微孔滤膜和含铁磁性微粒。
聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。
聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。
(4)免疫吸附剂：固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。
将抗原或抗体固相化的过程称为包被。
如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。
这一过程称为封闭。
包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。
酶免疫技术的方法ACA(抗心磷脂抗体)主要通过抑制血管内皮细胞合成PGI2，干扰血栓调节素、纤溶酶原激活剂和蛋白质C系统的活性，抑制抗凝血酶III的活化等而致凝血前高凝状态，与复发性动静脉血栓形成、反复自然流产及血小板减少症关系密切。
酶免疫技术
酶免疫技术：加速疾病检测的显微镜
酶免疫技术是一种高灵敏度、高特异性的检测方法，被广泛应用于医疗、食品安全、环境检测等领域。
该技术基于酶和抗原或抗体的特异性结合，利用化学反应转化出光、色或荧光信号，进而检测目标物质。
酶免疫技术的优势在于其对微量物质的检测能力，这使得其在疾病早期检测、病毒感染的筛查、癌症标志物的检测等方面具有广泛的应用前景。
同时，其简单快速、操作灵活、适应性强等特点也使其成为一个备受关注的研究热点。
一般而言，酶免疫技术包括ELISA、Western blot、免疫电泳等多种形式，不同的应用场景需要选择不同的技术。
其中，ELISA技术是最常见、最常用的酶免疫技术，其原理是将检测目标物质在固相载体上捕获，然后通过酶标记的抗体进行检测。
该技术被广泛应用于疾病检测、环境污染物的检测等领域。
虽然酶免疫技术在很短的时间内已经成为了最常用的检测方法之一，但仍有一些问题需要解决。
其中，对标准样品的控制、抗体的质量保证、检测灵敏度的提高等问题需要进一步改进和完善。
总之，作为一种成熟的检测技术，酶免疫技术在医疗、环保等领域的应用前景广阔，而其不断的技术创新和改进也将进一步提高其检测灵敏度和特异性，促进医疗诊断和环保监测的发展。
酶免疫技术
酶免疫技术酶免疫技术是一种广泛应用于生物科学领域的技术，可以用于检测、诊断、研究和治疗各种疾病。
它利用酶作为标记分子，结合抗原-抗体反应原理，通过酶的催化作用来检测、测定或定位目标物质。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高稳定性的特点，在医学、生物学和生物化学等领域有着广泛的应用。
酶免疫技术的基本原理是利用抗原与抗体的特异性结合，将抗原或抗体与酶标记物结合形成复合物，再通过酶的催化作用来检测目标物质的存在或浓度。
常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）和β-半乳糖苷酶（β-gal）等。
这些酶标记物可以与底物反应产生可测定的信号，如光、发光、颜色等。
酶免疫技术在临床诊断中起到了重要的作用。
例如，酶免疫分析技术（ELISA）可以用于检测人体内的抗体或抗原，用于诊断某些传染性疾病，如艾滋病、乙肝等。
ELISA技术的灵敏度高，特异性强，成本低，操作简单，因此被广泛应用于临床实验室中。
此外，酶免疫技术还可以用于检测药物、毒素、激素等物质的浓度，提供了临床药物监测和药物治疗的重要手段。
在生物学和生物化学研究中，酶免疫技术也发挥着重要的作用。
例如，免疫组织化学染色技术可以用于检测组织或细胞中特定蛋白的表达情况，从而研究蛋白的功能和相互作用。
此外，酶免疫技术还可以用于检测基因表达水平、蛋白质相互作用、酶动力学研究等领域。
酶免疫技术在生物科学领域的广泛应用离不开其优势和特点。
首先，酶免疫技术具有高灵敏度和高特异性，可以检测目标物质的极低浓度。
其次，酶免疫技术的结果可定量测定，可以提供准确的数据。
此外，酶免疫技术的操作简单，结果可视化，易于分析和解释。
最重要的是，酶免疫技术具有较好的重复性和稳定性，可以用于大规模的实验和临床检测。
酶免疫技术是一种重要的生物学和医学研究工具，具有广泛的应用前景。
它在临床诊断、生物学研究和药物研发等领域发挥着重要作用。
随着科学技术的不断发展，酶免疫技术将不断完善和创新，为人类的健康和生命科学研究提供更多的支持和帮助。
酶免疫技术
酶免疫技术
酶免疫技术是一种常用的生物技术，它利用酶作为标记物来检测特定的生物分子，如蛋白质、抗体、细胞等。
酶免疫技术具有高灵敏度、高特异性、简便易行、快速、经济等优点，因此在医学、生物学、环境监测等领域得到广泛应用。
酶免疫技术的基本原理是将酶标记在抗体或其他生物分子上，形成酶标记物。
当酶标记物与待检测的生物分子结合时，酶标记物的酶活性会发生变化，从而可以通过测定酶活性的变化来检测待检测的生物分子。
酶免疫技术有多种类型，其中最常用的是酶联免疫吸附试验（ELISA）。
ELISA是一种基于酶标记物的免疫学检测方法，它可以检测抗体或抗原的存在和浓度。
ELISA的基本原理是将待检测的生物分子固定在试验板上，然后加入酶标记的抗体或抗原，使其与待检测的生物分子结合。
随后加入底物，酶标记物会催化底物的反应，产生可测量的信号。
ELISA可以用于检测多种生物分子，如蛋白质、抗体、细胞等，因此在医学、生物学、环境监测等领域得到广泛应用。
除了ELISA外，还有其他酶免疫技术，如免疫印迹（Western blotting）、免疫组化（immunohistochemistry）等。
这些技术都利用酶标记物来检测生物分子，具有高灵敏度、高特异性、简便易行、快速、经济等优点，因此在生物学研究和临床诊断中得到广泛应用。
酶免疫技术是一种重要的生物技术，它利用酶作为标记物来检测特定的生物分子，具有高灵敏度、高特异性、简便易行、快速、经济等优点，因此在医学、生物学、环境监测等领域得到广泛应用。
临床检验免疫学酶免疫技术课件
色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）:
反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的 酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记 Ag（Ab）的浓度成反比
四）捕获法(capture ELISA )：
主要用于 血清中某种抗体亚型成分的测定 检测IgM抗体最常用方法
原理：
（三) 结果分析：
1、定性
• 间接法与夹心法：正相关 竞争法：反相关
4℃过夜
弃包被液，PBS清洗
保存备用。
三）封闭(blocking)
1、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程
2、常用的封闭剂：1％～5％牛血清白蛋白
二、酶免疫技术分类
Ag-E + Ab E-Ag Ab + Ag-E
EE
E
E
三、酶联免疫吸附试验
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
待测抗原或抗体量与产物量呈负相关
基本原理
测定抗原:
测定抗体
特点：
用于抗原和半抗原的定性、定量测定，也可对 抗体进行测定
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是 固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与 非标记Ag（Ab）的分子数量和
酶免疫技术讲义
激素等）
ELISA检测抗体的方法
间接法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人
IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。
双抗原夹心法（也可采用一步法）：用已知抗原包
被，加入待测血清，再加酶标抗原，加底物显色。应用：乙 型肝炎表面抗体
竞争法：用已知抗原包被，加入待测血清同时加酶标抗体，
2．双位点一步法
• 在双抗体夹心法基础上，进一步发展了 双位点一步法。该法使用针对抗原分子 上两个不同且空间距离较远的决定簇的 两种单克隆抗体，即包被使用一种单抗 ，酶标记使用另一种单抗。测定时将含 待测抗原标本和酶标抗体同时加入进行 反应，两种抗体互不干扰，经过一次温 育和洗涤后，即可加入底物进行显色测 定。
比色结果的表达以往通用光密度（optical density，OD），现按规定用吸光度 （absorbence，A），两者含义相同。
通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的 右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法 为"A492nm"或"OD492nm"。
How we will detect: read absorbance at 450 nm
第三节、酶联免疫吸附试验
( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
ELISA understanding the acronym
• EL
Enzyme-linked
– An enzyme’s activity is used as a “reporter” to test for the presence/amount of a proteis already adsorbed added to the wells and a second antibody with our enzyme will be added in the type of ELISA we will perform today.
酶免疫技术
1、酶标记抗体免疫组化技术类型： （1）直接法：■-Ag + Ab*E → ■-Ag-Ab*E
优点：简单、快速、特异 缺点：一种酶标抗体只能测一种抗原，敏感性较差
（2）间接法：■-Ag + Ab1 + Ab2*E → ■-Ag-Ab1-Ab2*E
优点：一种酶标抗体能测多种抗原，实用性敏感性 较直接法好 缺点：敏感性低于非标记抗体酶法与三步法
（一）斑点-酶联免疫吸附试验 （dot-ELISA ）
原理：似ELISA，但载体为硝酸纤维素 （NC）膜。更灵敏、节约、简便，易 保存 以检测抗体为例：
Ag
Ab1？
Ab2-E
底物
（二）斑点-酶免疫渗滤试验 Immunofiltration Assay，IFA
原理：以NC膜为载体，利用微孔滤膜 的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在 一特殊渗滤装置上以液体渗滤过膜的方 式迅速完成。以胶体金为标记物的金免 疫渗滤试验省却了酶对底物的反应，更 加简便快速。
（二）类
型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法 dot-ELISA BAS-ELISA
双抗体夹心法
此法常用于测定抗原，适用于多价大分 子抗原的检测，而不能用于测定半抗原 等小分子物质。
双抗体夹心法
间接法
此法是测定抗体最常用的方法。
酶免疫标记用于抗原检测
（一）基本原理
酶标记抗体或抗原： 抗体或抗原的免疫学反应特异性 ＋ 酶活性 酶是一种有机催化剂： 使底物基质水解而呈色 使供氢体由无色还原型变为有色氧化型 ∴ 可用呈色反应显示酶的存在。 很少量的酶即可导致大量的催化过程， 所以极为敏感。
第八章+酶免疫技术
E物
E
固相抗体
E
双抗体夹心法测抗原
EE E EE E
（+）
EE E
（-）
2.双位点一步法检测抗原
即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子 上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗 体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同 时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温 育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。
常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和 硫酸铵沉淀法等。
2.酶标记物的鉴定
（1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩 散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有 免疫活性。
（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合 物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算 其标记率。
三、固相载体
固相抗体或抗原:就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面
板、小试管和小珠三种。
微量反应板
2．微颗粒 微颗粒是由 高分子单体聚合成的微
球或颗粒。
3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤 维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。
（三）包被与封闭
将抗原或抗体固相化结合在固相载体 上的过程称为包被（coating)。
以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为 例说明免疫吸附的过程：
一、酶和酶作用底物
（一）标记酶的要求： ①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得
（一）常用的酶
1、辣根过氧化物酶
（horseradish peroxidase ,HRP）
国内以辣根过氧化酶最为常用
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
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酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶放大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
克隆酶供体免疫分析 CEDIA
注意事项：
思考题
1．酶免疫技术的要点？ 2．酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？ 3．竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？ 4．常用的底物有哪几类？特点？ 5．常用的酶有哪几类？特点？ 6．何谓包被与封闭？其作用？ 7．常用固相载体的种类和特点？ 8．举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。 9．ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？ 10．对酶免疫技术的应用评价如何？
1、取4孔 反应孔
待测 阳性对照 阴性对照 空白对照
待测血清 2、加入 反应试剂， 50ul+酶标 抗体50ul 混匀
阳性对照 液50ul+ 酶标抗体
阴性对照 液50ul+ 酶标抗体
50ul 3、置湿盒37℃反应30分钟。
50ul
4、取出，弃掉液体，用洗涤液加满重复洗 涤5次，每次3-5分钟，扣干。 5、加入显色液A、B各50ul ， 37 ℃反应15 分钟。 6、取出，加入终止液50ul ，观察颜色变化， 或用酶标仪读数。
（五）固相酶免疫测定仪（酶标仪）
• 比色 • 测定波长、吸光度范围、光学系统、检 测速度、震板功能、温度控制、定性和 定量的软件，自动洗板、温育、加样 • 450nm、492nm、620nm、630nm、 650nm、405nm
作业：
名词解释： 1.凝集反应 2.荧光免疫技术 3.包被 4.封闭 简答： 1.简述荧光免疫技术的临床应用。 2.试以双抗体夹心法测HBsAg为例，简述ELISA基 本原理。
碱性磷酸酶（ALP）
β–半乳糖苷酶（βGal）
大肠埃希菌，特异 性强，用于均相酶 免疫测定
酶和酶作用底物
常用底物
四甲基联苯胺 TMB
HRP作用下蓝色，终止反应后黄 色，最大吸收峰450nm 稳定性好，无需避光，无致癌性。
邻苯二胺 OPD
HRP作用下橙黄色， 终止反应后棕黄色， 最大吸收峰492nm 不稳定，致癌性。
酶和酶作用底物
常用酶
来源于蔬菜植物的辣根，分子量小 糖蛋白（主酶）+亚铁血红素（辅基） 辅基是酶的活性中心
辣根过氧化物酶（HRP）
ELISA中应用最为广泛的标记用酶 易于提取，价格低廉， 性质稳定，易于保存
酶和酶作用底物
常用酶
大肠杆菌源性ALP 小牛肠粘膜ALP 灵敏度高于HRP 较难获得高纯度制剂， 稳定性差，价格高
4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色
捕获法原理
-
第四节 酶免疫测定的应用
均相酶免疫测定主要用于药物和小分 子物质的检测。非均相免疫测定中的 ELISA 应用更为广泛， ELISA 广泛用于 传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎 （甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗 体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病 毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如 结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一 些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、 补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚 抗原、前列腺特异性抗原等）。
种类
•塑料制品 ：聚苯乙 烯 •微颗粒:高分子单体 •膜载体：NC,PVDF
包被与封闭
包被 coating 将抗原或抗体结合于固相载体上的过程。 抗原或抗体溶于缓冲液，加入孔中4℃ 过夜。
封闭 blocking 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小 牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消 除非特异性吸附。
实验举例
【材料】
1、乙型肝炎病毒表面抗原两步夹心 剂盒 ELISA试
(包被HBsAb的预包被微孔板、HRP标记抗体、HBsAg 阳性对照、HBsAg阴性对照、浓缩PBS-T缓冲液、 底物、终止液、封板膜，自封袋 )
2、待检血清 3、微量加样器、37℃孵箱、酶标仪
ELISA法检测HBsAg操作方法
第三节
酶联免疫吸附试验
ELISA简介
一、基本原理
1 3
包被
2
反应
加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体
洗涤
使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离
4
底物显色
定性或定量的分析
加入酶标记的抗体
二、方法类型及反应原理
三个必要试剂
固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
酶免疫技术
酶免疫技术
酶免疫技术(enzyme immunoassay)： 是用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原 或抗体的一种免疫学标记技术。它将抗原 抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性 相结合，通过酶作用底物后显色的有无及 深浅来判断结果。
第一节 酶免疫技术的特点
原理及特点
抗原抗体反应的特异性
液相酶免疫测定 酶标抗体和待测抗原均为液体，免疫反 应在液相中进行，最后用分离剂将游离标记 物与结合酶标记物分离。 用于检测样品中极微量的短肽激素和某 些药物等小分子半抗原。
固相酶免疫测定
利用固相支持物作载体预先吸附抗原或抗体， 使测定时的免疫反应在其表面进行并形成抗原抗 体复合物，洗涤无关成分并加入底物，通过测定 固相载体上的有色产物确定样品中抗原或抗体的 含量。
应用：
二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等
+
双抗体夹心法测抗原
E
E
E E
E E
E
E
E
-
ELISA检测抗原的方法
竞争法
方法：用已知抗体包被，同时加入待测血清和酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药
HRP的常见底物
5-氨基水杨酸5ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
酶和酶作用底物
常用底物
ALP的 底物 对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ） 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞形酮β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析
一、酶和酶作用底物
标记酶的要求：
1. 纯度高，活性强，催化反应效率高。 2. 标记后性质稳定，不影响抗原抗体反应性。 3. 专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响。 4. 酶催化底物的显色信号易于判断和测量。方法敏感， 重复性好，简单易行。 5. 酶、辅助因子及其底物对人体和环境无害，酶的底 物易于配制保存，酶及底物价廉。
+
酶高效催化反应的专一性
• 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 • 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
原理及特点
原理：
酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应
特点：
灵敏度高、特异性强、 准确性好 酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 操作简便、对环境没有 污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的 新方法。
以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫 吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免 疫测定。
三、固相载体
固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面
固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常 用方法
固相载体
要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性 •固相方法简便易行，快速经济
二、方法类型及反应原理
根据测定抗原和抗体的不同采取不同的方法 ：
•测定抗原：蛋白大分子抗原-----双抗体夹心法 小分子抗原 ----竞争法
•测定抗体-----间接法、双抗原夹心法、竞争法 和捕 获法等。
ELISA检测抗原的方法
双抗体夹心法
方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶
标抗体，加底物显色
优点
只需更换固相抗原，一种酶标二抗可以检测多种针对不同抗 原的抗体。
应用
常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定