第八章酶免疫技术

底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
4、加酶标抗体 无抗原结合， 加底物不显色
捕获法原理
-
第四节 酶免疫测定的应用
均相酶免疫测定主要用于药物和小分 子物质的检测。非均相免疫测定中的 ELISA 应用更为广泛， ELISA 广泛用于 传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎 （甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗 体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病 毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如 结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一 些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、 补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚 抗原、前列腺特异性抗原等）。
应用：
二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等
+
双抗体夹心法测抗原
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E
E E
E E
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E
E
-
ELISA检测抗原的方法
竞争法
方法：用已知抗体包被，同时加入待测血清和酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药
以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫 吸附试验（ELISA） 是目前最为常用的固相酶免 疫测定。
三、固相载体
固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面
固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常 用方法
固相载体
要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性 •固相方法简便易行，快速经济
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
酶放大免疫测定技术EMIT
enzyme-mutiplied immunoassay technique
克隆酶供体免疫分析 CEDIA
碱性磷酸酶（ALP）
β–半乳糖苷酶（βGal）
大肠埃希菌，特异 性强，用于均相酶 免疫测定
酶和酶作用底物
常用底物
四甲基联苯胺 TMB
HRP作用下蓝色，终止反应后黄 色，最大吸收峰450nm 稳定性好，无需避光，无致癌性。
邻苯二胺 OPD
HRP作用下橙黄色， 终止反应后棕黄色， 最大吸收峰492nm 不稳定，致癌性。
优点
只需更换固相抗原，一种酶标二抗可以检测多种针对不同抗 原的抗体。
应用
常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定
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E
E
E
E
+
E E E E
间接法测抗体
-
ELISA检测抗体的方法
双抗原夹心法
原理：类似双抗体夹心法
操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体
ELISA检测抗体的方法
小 结
• 酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗 原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体 的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高 敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免 疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结 合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。 • 均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原的测定， 非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为 液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙 烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）, 其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。
酶和酶作用底物
常用酶
来源于蔬菜植物的辣根，分子量小 糖蛋白（主酶）+亚铁血红素（辅基） 辅基是酶的活性中心
辣根过氧化物酶（HRP）
ELISA中应用最为广泛的标记用酶 易于提取，价格低廉， 性质稳定，易于保存
酶和酶作用底物
常用酶
大肠杆菌源性ALP 小牛肠粘膜ALP 灵敏度高于HRP 较难获得高纯度制剂， 稳定性差，价格高
实验举例
【材料】
1、乙型肝炎病毒表面抗原两步夹心 剂盒 ELISA试
(包被HBsAb的预包被微孔板、HRP标记抗体、HBsAg 阳性对照、HBsAg阴性对照、浓缩PBS-T缓冲液、 底物、终止液、封板膜，自封袋 )
2、待检血清 3、微量加样器、37℃孵箱、酶标仪
ELISA法检测HBsAg操作方法
第三节
酶联免疫吸附试验
ELISA简介
一、基本原理
1 3
包被
2
反应
加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体
洗涤
使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离
4
底物显色
定性或定量的分析
加入酶标记的抗体
二、方法类型及反应原理
三个必要试剂
固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物）
酶反应的底物
竞争法
原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和
乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测
ELISA检测抗体的方法
捕获法
应用：
病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
捕获法
原理：
抗人IgMμ链抗体包被 捕获待测标本中IgM类抗体 加入特异性抗原和酶标记特 异性抗原的抗体
液相酶免疫测定 酶标抗体和待测抗原均为液体，免疫反 应在液相中进行，最后用分离剂将游离标记 物与结合酶标记物分离。 用于检测样品中极微量的短肽激素和某 些药物等小分子半抗原。
固相酶免疫测定
利用固相支持物作载体预先吸附抗原或抗体， 使测定时的免疫反应在其表面进行并形成抗原抗 体复合物，洗涤无关成分并加入底物，通过测定 固相载体上的有色产物确定样品中抗原或抗体的 含量。
注意事项：
思考题
1．酶免疫技术的要点？ 2．酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？ 3．竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？ 4．常用的底物有哪几类？特点？ 5．常用的酶有哪几类？特点？ 6．何谓包被与封闭？其作用？ 7．常用固相载体的种类和特点？ 8．举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。 9．ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？ 10．对酶免疫技术的应用评价如何？
（五）固相酶免疫测定仪（酶标仪）
• 比色 • 测定波长、吸光度范围、光学系统、检 测速度、震板功能、温度控制、定性和 定量的软件，自动洗板、温育、加样 • 450nm、492nm、620nm、630nm、 650nm、405nm
作业：
名词解释： 1.凝集反应 2.荧光免疫技术 3.包被 4.封闭 简答： 1.简述荧光免疫技术的临床应用。 2.试以双抗体夹心法测HBsAg为例，简述ELISA基 本原理。
酶免疫技术
酶免疫技术
酶免疫技术(enzyme immunoassay)： 是用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原 或抗体的一种免疫学标记技术。它将抗原 抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性 相结合，通过酶作用底物后显色的有无及 深浅来判断结果。
第一节 酶免疫技术的特点
原理及特点
抗原抗体反应的特异性
种类
•塑料制品 ：聚苯乙 烯 •微颗粒:高分子单体 •膜载体：NC,PVDF
包被与封闭
包被 coating 将抗原或抗体结合于固相载体上的过程。 抗原或抗体溶于缓冲液，加入孔中4℃ 过夜。
封闭 blocking 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小 牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消 除非特异性吸附。
二、方法类型及反应原理
根据测定抗原和抗体的不同采取不同的方法 ：
•测定抗原：蛋白大分子抗原-----双抗体夹心法 小分子抗原 ----竞争法
•测定抗体-----间接法、双抗原夹心法、竞争法 和捕 获法等。
ELISA检测抗原的方法
Βιβλιοθήκη Baidu
双抗体夹心法
方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶
标抗体，加底物显色
对抗原或抗体进行定位、 定性或定量的测定分析
一、酶和酶作用底物
标记酶的要求：
1. 纯度高，活性强，催化反应效率高。 2. 标记后性质稳定，不影响抗原抗体反应性。 3. 专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响。 4. 酶催化底物的显色信号易于判断和测量。方法敏感， 重复性好，简单易行。 5. 酶、辅助因子及其底物对人体和环境无害，酶的底 物易于配制保存，酶及底物价廉。
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计测量。
第二节
酶免疫技术的分类
酶 免 疫 技 术
酶免疫组
化
组织切片或其它标本中抗原的定位
均 相
酶免疫分
液体标本中抗原或 析
抗体的定性和定量
固相酶免疫测定
非均相
液相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
一、均相酶免疫测定
用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
HRP的常见底物
5-氨基水杨酸5ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
酶和酶作用底物
常用底物
ALP的 底物 对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ） 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
β-Gal 的底物
4-甲基伞形酮β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
cloned enzyme donor immunoassay
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
1、取4孔 反应孔
待测 阳性对照 阴性对照 空白对照
待测血清 2、加入 反应试剂， 50ul+酶标 抗体50ul 混匀
阳性对照 液50ul+ 酶标抗体
阴性对照 液50ul+ 酶标抗体
50ul 3、置湿盒37℃反应30分钟。
50ul
4、取出，弃掉液体，用洗涤液加满重复洗 涤5次，每次3-5分钟，扣干。 5、加入显色液A、B各50ul ， 37 ℃反应15 分钟。 6、取出，加入终止液50ul ，观察颜色变化， 或用酶标仪读数。
+
酶高效催化反应的专一性
• 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 • 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性
原理及特点
原理：
酶标抗体（抗原）与抗原 （抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应
特点：
灵敏度高、特异性强、 准确性好 酶标记试剂能够较长时 间保持稳定 操作简便、对环境没有 污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的 新方法。