酶免疫技术

oriented antibody
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第九章 酶免疫技术
The higher direct binding efficiency of inovational ELISA plates can result in assays with greater sensitivity and increased signal dynamic range compared to conventional plates
4.抗体的用量
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第九章 酶免疫技术
（三）确定最佳工作浓度
抗体最佳浓度分析： 1.剂量曲线是否符合要求
2.非特异性结合较弱，本底低
3.最大OD值是否在2.0左右
4.抗体的用量
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第九章 酶免疫技术
第四节 酶免疫印迹试验
免疫印迹试验 原理 1.分离蛋白质：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴
方法学评价：
优点：适合各种酶蛋白标记。标记反应温和 缺点：标记产率低，且酶和抗体易出现自联，抗体 的活性可能有所降低
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第九章 酶免疫技术
（二）酶标记物的纯化与鉴定 1．酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游 离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，
避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)
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第九章 酶免疫技术
3. 封闭
封闭
blocking 用1%～5%的牛血清白蛋白或 5%～20%小牛血清消除固相载体 表面未结合的位点，消除非特 异性吸附的过程
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（二）抗体匹配
抗体匹配分析： 1.剂量曲线是否符合要求
2.非特异性结合较弱，本底低
3.标准品与质控品相吻合性
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第九章 酶免疫技术
2．戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，作为“桥 梁”，可分别与酶和抗体（抗原）分子上的氨基 结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率
比一步法高，酶标记物质量较均一。
Amino group
间标
NH2
Aldehyde group
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第九章 酶免疫技术
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第三节 酶联免疫吸附试验
Enzyme linked Immunosorbent assay (ELISA)
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第九章 酶免疫技术
一、基本原理
酶联：制备酶标记的抗原或抗体
免疫吸附：将抗原或抗体预先结合到固相载体表面
技术特点：
1.酶反应的高敏感性。
2.只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物
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（二）碱性磷酸酶
（alkaline phosphatase，AP)
是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取
AP的 底物 对-硝基苯磷酸 酯（ pNPP ） 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
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三、酶标抗体(抗原)的制备
阳性 阴性 空白
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双位点一步法 1．原理 即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子 上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗 体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同 时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温 育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。
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聚合物
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1．过碘酸钠氧化法 常用于HRP的标记。过碘酸钠将多糖羟基氧 化为醛基，可与抗体蛋白的游离氨基结合，形成 HRP-CH2-NH-IgG。
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方法学评价：
优点：此法酶标记物产率较高，常用HRP标记。 缺点：只适合含多糖的酶，具有局限性；
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HRP催化的反应式为：
DH2十H2O2—D十2H20
DH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体 HRP对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。
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HRP常用的供氢体底物及其特性
供氢体(DH2) 邻苯二胺(OPD)
产物特性 黄色，可溶性
（二）间接法检测抗体 1．原理 将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中 相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，
再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，
形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底 物后的显色程度确定待检抗体含量。
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间接法测抗体
E
E
E
E
E
E
E
E
E
（+）
（-）
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（三）竞争法 1．原理
酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有
相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。 免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中 待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗 原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反
之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含
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（一）辣根过氧化物酶
（horseradish peroxidase ,HRP）
1.ELISA中应用最为广泛的标记用酶 2.糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 3.酶纯度(RZ值)： 403nm(辅基)与275nm(主酶)OD值之比。 HRP RZ>3 4.酶活性单位(U): 在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，1分钟将 1微摩底物转化为产物所需的酶量。 HRP >250U/mg 5.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要
是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF
（IgM类）能与固相抗人IgM抗体结合，并可与
随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导
致假阳性反应。
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三、技术要点
（一）包被技术
包被 coating 将抗原或抗体结合于固相载体的过程。
1.固相吸附好，不易脱落
2.原有免疫活性稳定 这是酶联免疫吸附试验的基础
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双位点一步法测抗原
E E E
E
E
E
（+）
（ -）
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2．注意事项 如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成 “钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，
可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当
稀释后重新测定。
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终止剂 0.5M H2SO4 0.5M H2SO4 3M NaOH
测定波长 492nm 450nm 550nm
特点 灵敏度高、稳定性差、 致癌性 分辨性好、无致癌性、 非水溶性、避光 用于免疫组化 敏感性较差
四甲基联苯胺(TMB) 蓝色(黄色)， 可溶性 二氨基联苯胺(DAB) 棕色，不溶性 5-氨基水杨酸 棕色，可溶性
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酶标记多 抗体 克隆抗体
酶
1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合 为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗体，则结合 为抗体-抗原-酶标记抗体复合 物。 4.酶催化底物并显色。
抗原
单抗
+
-
固相载体
双抗体夹心法
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ELISA结果：
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酶免疫技术的特点
灵敏度高、特异性强、准确性好
酶标记试剂能够较长时间保持稳定
操作简便、对环境没有污染。
易与其它技术偶联，衍生出适用范围更广的新方法。
影响被标记物天然构象
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二、技术分类
酶 免 疫 技 术
酶免疫组化 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定
是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试 剂，将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催 化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术
三大经典标记技术之一
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Ab-E(Ag-E ) + Ag (Ab)
基 本 原 理
Ag -Ab-E (Ag-E -Ab)
S
显色反应
检测颜色变 化光学仪器
Ag (Ab)定性、定量 、定位分析
酶免疫测定
固 相 酶 免 疫 测 定
液 相 酶 免 疫 测 定
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第二节、酶标记物的制备
（一）标记酶的要求：
1.活性高
2.性质稳定 3.专一性强 4.酶催化底物的显色信号易于判断和测量 5.方法敏感，重复性好，简单易行
6.酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉
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制备要求： 抗原要求纯度高、抗原性强。 抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、 易于分离纯化和批量生产。
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（一）常用的标记方法
标记方法要求：
①方法简单，产率高 ②不影响酶和抗体(抗原)的生物活性
源自文库
③所得酶结合物稳定，本身不发生聚合
④较少形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的
特异抗原与固相抗体捕获的IgM类抗体结合，
再加入抗原特异的酶标抗体，形成固相抗人
IgM-IgM-抗原-酶标抗体复合物。最后根据加
底物后的显色程度确定待检IgM抗体的含量。
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捕获法
E
E
E
E
E
E
（+）
（ -）
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3．注意事项
采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的
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1. 固相载体的要求
①结合抗体(抗原)的容量大，结合稳定； ②固相材料具有良好可塑性、透明性高
③固相化后分子仍应保持活性；
④固相化方法应简便、快速；材料成本低。
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固相载体的种类 1．塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状
主要有微量反应板、小试管和小珠三种。
②间接法：
亲和素-生物素化抗体或抗原模式 SPA-抗体模式
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Question: Answer: 通过技术革新，人为控制抗原或者抗体吸附固相上的过 传统的包被使抗原或者抗体吸附固相上的过程 是低效及随机的。 程，提高检测敏感性和准确性。
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量呈反比。
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竞争法测抗原
E E
E
E
E
E
E
E
E
E
（ +）
（ -）
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竞争法检测抗体
E E E E E
E
E
E
E
（ +）
（ -）
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（四）捕获法检测抗体 1．原理 将抗人IgM抗体吸附于固相载体上，待检 标本中的IgM类抗体多被固相抗体捕获。加入
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在这些测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体 ②酶标记的抗原或抗体 ③酶作用的底物
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（一）双抗体夹心法检测抗原 1.原理 将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相
应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合
成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成 固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后 的显色确定是否含有相应抗原或依据显色程度确 定待检抗原的含量。
的竞争作用。 常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和 硫酸铵沉淀法等。
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酶 标记蛋白
聚合、损
游离酶
伤物
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2.酶标记物的鉴定 （1）活性鉴定：免疫活性常用免疫电泳或双向免
疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)
具有免疫活性。酶活性用DAB显示反应 （2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合 物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算 其标记率。
第九章
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第九章 酶免疫技术
掌握
目
1.酶免疫技术的基本原理 2.ELISA的原理及常用方法类型 与原理
的
要 求
熟悉
1.酶免疫印迹技术 2.酶免疫技术的方法学评价
了解
1.酶免疫技术常用酶及底物 2.酶免疫测定的应用
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第九章 酶免疫技术
第一节 概 述
一、酶免疫技术：
质的分离，大大简化了操作步骤。
酶联免疫吸附法是一种非均相免疫测定技术。成为目
前临床检验中应用较广的免疫测定方法。
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一、基本原理
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第九章 酶免疫技术
二、方法类型和检测原理
1.直 双抗体夹心法 接 法 方法类型 2.间 接 法 3.补 竞 体 争 法
4.双标记法 捕获法
2．微颗粒 或颗粒。 3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸 微颗粒是由高分子单体聚合成的微球
纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。
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第九章 酶免疫技术
2. 包被方法 ①直接法：
将抗体或抗原分子直接被动吸附固相材料表面。
常用包被缓冲液 pH9.6碳酸盐溶液,pH7.4磷酸盐溶液。 抗原或抗体浓度影响包被效率