酶免疫技术主题医学知识
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（三）包被与封闭
将抗原或抗体固相化结合在固相载体 上的过程称为包被（coating)。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为 例说明免疫吸附的过程：
抗原（抗体）→用PH9.6的碳酸盐溶 液稀释 → 4ºC过夜 → 用10%的小 牛血清再包被一次，以消除固相载体表 面未吸附的位点，此过程叫做封闭。
➢固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用 方法
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（一）固相载体的要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性 •利于反应充分进行 •固相方法简便易行，快速经济
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RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶）OD 值之比
酶的纯度并不代表 酶的活力
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
HRP催化的反应式为：
HR DH2+H2OP2→ → → D+2H2O H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性 很高 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多 种
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
2.酶标记物的鉴定 （1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩 散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有 免疫活性。 （2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合 物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算 其标记率。
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三、固相载体
➢固相抗体或抗原:就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面
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（二）酶标记物的纯化与鉴定 1．酶标记物的纯化
标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游 离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物， 避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原) 的竞争作用。
常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和 硫酸铵沉淀法等。
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结合物
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（一）酶标记抗体或抗原的制备
技术方法简单、产率高，重复性 好
标记方法要求
标记反应不影响酶和抗原或抗体 的活性
酶标记物稳定 ，不易发生解离
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制备方法
1.戊二醛交联法
适合各种酶蛋白的标记。
2.过碘酸钠氧化法
常用于HRP标记抗体或抗原
（alkaline phosphatase，AP)
是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取
AP的 底物
对-硝基苯磷酸 酯（ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
敏感性高于HRP,但不易获得高纯度的制品、 稳定性差，价格贵
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（三）β-半乳糖苷酶
HRP常用底物
邻苯二胺 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应 后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致 癌性。 四甲基联苯胺 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止 反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致 癌性，ELISA中应用最广泛的底物。
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（二）碱性磷酸酶
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教学目的要求： 1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或
抗原；熟练掌握固相载体。 2.熟练掌握酶免疫技术的分类 3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及
原理 4.掌握酶免疫测定的应用
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三大三经大典经标记典技标术记技术
荧
放
酶
光
射
免
免
免
疫
疫
疫
技
技
技
术
术
术
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第一节 酶免疫技术的特点
基本原理
• 酶标抗体（抗原） 与抗原（抗体）的 特异性反应
• 酶对底物的显色反 应
• 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
酶高效催化反 应的专一性
+
抗原抗体反应 的特异性
（二）固相载体的种类
1．塑料制品 由聚苯 乙烯、聚氯乙烯制成。 形状。主要有微量反应
板、小试管和小珠三种。
微量反应板
2．微颗粒 微颗粒是由 高分子单体聚合成的微
球或颗粒。
3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤 维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。
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（β-galactosidase，β-Gal）
源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D半乳糖苷 （ 4MUG ）
酶作用后，生成高强度荧 光物 ，用荧光计测量。
资料仅供参考Fra Baidu bibliotek不当之处，请联系改正。
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
酶结合物 酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的
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第一节 酶免疫技术的特点
基本原理
• 酶标抗体（抗原）
抗原
底物
与抗原（抗体）的 特异性反应
酶标抗体
E
E
E
• 酶对底物的显色反
应
• 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
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一、酶和酶作用底物
（一）标记酶的要求： ①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得
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一、均相酶免疫测定法
酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。 未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。 与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。
（一）常用的酶
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1、辣根过氧化物酶
（horseradish peroxidase ,HRP）
国内以辣根过氧化酶最为常用
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
纯度数（RZ）值与 酶活性无关，酶活 性单位（U）比RZ 值更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
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第二节 酶免疫技术的分类
酶免疫组织化学技术 组织切片或其它标本中抗原的定位分析
酶免疫分析技术
酶免疫测定技术 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
均相酶免疫测定 异相酶免疫测定
酶放大免疫测定技术
克隆酶供体免疫测定 固相酶免疫测定：
酶联免疫吸附试验(ELISA)
液相酶免疫测定
将抗原或抗体固相化结合在固相载体 上的过程称为包被（coating)。
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以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为 例说明免疫吸附的过程：
抗原（抗体）→用PH9.6的碳酸盐溶 液稀释 → 4ºC过夜 → 用10%的小 牛血清再包被一次，以消除固相载体表 面未吸附的位点，此过程叫做封闭。
➢固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用 方法
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（一）固相载体的要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性 •利于反应充分进行 •固相方法简便易行，快速经济
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RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶）OD 值之比
酶的纯度并不代表 酶的活力
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
HRP催化的反应式为：
HR DH2+H2OP2→ → → D+2H2O H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性 很高 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多 种
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
2.酶标记物的鉴定 （1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩 散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有 免疫活性。 （2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合 物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算 其标记率。
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三、固相载体
➢固相抗体或抗原:就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面
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（二）酶标记物的纯化与鉴定 1．酶标记物的纯化
标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游 离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物， 避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原) 的竞争作用。
常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和 硫酸铵沉淀法等。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
结合物
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（一）酶标记抗体或抗原的制备
技术方法简单、产率高，重复性 好
标记方法要求
标记反应不影响酶和抗原或抗体 的活性
酶标记物稳定 ，不易发生解离
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
制备方法
1.戊二醛交联法
适合各种酶蛋白的标记。
2.过碘酸钠氧化法
常用于HRP标记抗体或抗原
（alkaline phosphatase，AP)
是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取
AP的 底物
对-硝基苯磷酸 酯（ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
敏感性高于HRP,但不易获得高纯度的制品、 稳定性差，价格贵
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（三）β-半乳糖苷酶
HRP常用底物
邻苯二胺 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应 后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致 癌性。 四甲基联苯胺 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止 反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致 癌性，ELISA中应用最广泛的底物。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（二）碱性磷酸酶
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
教学目的要求： 1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或
抗原；熟练掌握固相载体。 2.熟练掌握酶免疫技术的分类 3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及
原理 4.掌握酶免疫测定的应用
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
三大三经大典经标记典技标术记技术
荧
放
酶
光
射
免
免
免
疫
疫
疫
技
技
技
术
术
术
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第一节 酶免疫技术的特点
基本原理
• 酶标抗体（抗原） 与抗原（抗体）的 特异性反应
• 酶对底物的显色反 应
• 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
酶高效催化反 应的专一性
+
抗原抗体反应 的特异性
（二）固相载体的种类
1．塑料制品 由聚苯 乙烯、聚氯乙烯制成。 形状。主要有微量反应
板、小试管和小珠三种。
微量反应板
2．微颗粒 微颗粒是由 高分子单体聚合成的微
球或颗粒。
3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤 维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（β-galactosidase，β-Gal）
源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D半乳糖苷 （ 4MUG ）
酶作用后，生成高强度荧 光物 ，用荧光计测量。
资料仅供参考Fra Baidu bibliotek不当之处，请联系改正。
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
酶结合物 酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
第一节 酶免疫技术的特点
基本原理
• 酶标抗体（抗原）
抗原
底物
与抗原（抗体）的 特异性反应
酶标抗体
E
E
E
• 酶对底物的显色反
应
• 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
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一、酶和酶作用底物
（一）标记酶的要求： ①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得
23
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一、均相酶免疫测定法
酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。 未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。 与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。
（一）常用的酶
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
1、辣根过氧化物酶
（horseradish peroxidase ,HRP）
国内以辣根过氧化酶最为常用
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
纯度数（RZ）值与 酶活性无关，酶活 性单位（U）比RZ 值更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
第二节 酶免疫技术的分类
酶免疫组织化学技术 组织切片或其它标本中抗原的定位分析
酶免疫分析技术
酶免疫测定技术 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
均相酶免疫测定 异相酶免疫测定
酶放大免疫测定技术
克隆酶供体免疫测定 固相酶免疫测定：
酶联免疫吸附试验(ELISA)
液相酶免疫测定