酶免疫技术主题医学知识
《酶免疫分析技术》课件
酶免疫分析技术在生物工程中广泛应用，如蛋 白质表达、酶催化反应和抗体筛选等。
优点与局限
1 优点
酶免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性、 广泛适应性和操作简便等优点。
2 局限
酶免疫分析技术的局限主要包括影响因素较 多、标记物抗原性和稳定性的要求高等限制。
总结
《酶免疫分析技术》是一种重要的生物分析方法，其原理和应用领域广泛。通过本课件的学习，我们对酶免疫 分析技术有了更深入的了解，并了解到其优点和局限。谢谢大家的聆听！
为什么选择酶作为标记物？
酶具有活性强、稳定性好、催化效率高等特点，可以产生放大效应，大幅提高测定的灵敏度。
酶免疫分析技术的发展历程
酶免疫分析技术自20世纪70年代初提出以来，经过不断创新和发展，已成为生物医学和环 境检测领域的重要分析方法。
酶免疫分析技术的原理
酶底物反应原理
酶标记的免疫试剂与待检测物结 合后，通过酶底物的催化反应产 生可检测的信号，如颜色、发光 或电流。
《酶免疫分析技术》PPT 课件
这是一份《酶免疫分析技术》的PPT课件，通过本课件，我们将深入介绍酶 免疫分析技术的原理、主要实现步骤、应用、优点与局限等内容。让我们开 始学习吧！
绪论
什么是酶免疫分析技术？
酶免疫分析技术是一种高灵敏度、高特异性的生物分析方法，通过酶标记的免疫试剂与待检 测物发生特异性反应，再利用酶对底物的催化作用产生信号。
3
信号产生
通过酶底物反应或其他方式，产生与待检测物浓度相关的可检测信号。
酶免疫分析技术的应用
医学诊断
酶免疫分析技术在临床医学中广泛应用，如血 液病、感染性疾病和肿瘤标志物的检测。
环境监测
酶免疫分析技术可用于水质、土壤和空气中有 害物质的监测，对环境污染的快速筛查具有重 要意义。
免疫酶技术的原理及应用
免疫酶技术的原理及应用免疫酶技术是一种通过使用特定的抗体与抗原相互作用，然后利用酶的活性来检测和分析目标分子的方法。
其原理主要涉及到两个关键步骤：抗原-抗体结合和酶的活性检测。
首先，免疫酶技术的第一步是抗原-抗体结合。
抗原是指引起机体免疫反应的分子，抗体则是由机体产生的对特定抗原具有高度特异性的蛋白质。
在免疫酶技术中，抗原和抗体通过它们之间的亲和性结合在一起。
这一步通常称为“抗原-抗体反应”。
通过特定的反应条件和各种试剂，可以使抗原和抗体结合形成抗原-抗体复合物。
接下来的关键步骤是酶的活性检测。
在免疫酶技术中，通常选择一种酶来标记或连接到抗体上。
当抗原-抗体复合物形成后，酶会与复合物结合。
最常用的酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
一旦复合物与酶结合，就可以加入特定的底物，使酶开始催化底物的转化。
这种底物通常是可以产生颜色变化或发光的物质。
通过对底物的催化反应，酶会产生可测量的信号。
这种信号包括吸光光度、荧光或发光强度等。
这种信号与目标分子的存在呈正相关关系。
因此，可以通过测量信号的强度来确定目标分子的存在和相对数量。
免疫酶技术具有广泛的应用。
其中包括：1. 疾病诊断：免疫酶技术可用于检测和诊断多种疾病，如感染性疾病、肿瘤标志物、自身免疫性疾病等。
通过测量特定标志物的存在和浓度，可以实现早期疾病检测和诊断。
2. 药物研发：免疫酶技术可用于筛选和评估新药物的活性和效果。
通过测量目标分子在药物处理后的变化，可以评估药物的疗效和毒副作用。
3. 环境监测：免疫酶技术可用于环境监测和污染物检测。
通过检测水体、土壤、空气中的污染物，可以评估环境污染的程度和影响。
4. 食品安全：免疫酶技术可用于食品安全监测和检测食品中的有害物质、过敏原等。
这对于确保食品质量和保护消费者的健康至关重要。
总之，免疫酶技术通过结合特异性抗体和酶活性，能够准确、快速地检测和分析目标分子。
它在医学、生物学、环境科学等领域具有广泛的应用价值。
第八章+酶免疫技术-88页PPT精选文档
第四节 酶免疫测定的应用
• 1．病原体及其抗体测定 广泛应用于传染病的诊 断。
• 2．蛋白质测定 各种免疫球蛋白、补体组分、肿 瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。
• 3．非肽类激素测定 如T3、T4、雌激素、绒毛膜 促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状 腺素等。
• 4．药物和毒品测定 如地高辛、苯巴比妥、庆大 霉素、吗啡等。
酶放大免疫测定技术
克隆酶供体免疫测定 固相酶免疫测定：
酶联免疫吸附试验(ELISA)
液相酶免疫测定
24
一、均相酶免疫测定法
酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。 未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。 与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。
Ag+ Ab-E AgAb-E+ Ab-E （以标记Ab检测Ag为例）
双位点一步法检测抗原
固相抗体
标本（含抗原）
底物
E
E
E
酶标抗体
• 在包被时使用一种单抗，酶标记时使用一种单抗
双位点一步法测抗原
E
E
E
பைடு நூலகம்
E
（+）
E
E
（-）
注意事项
如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成 “钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时， 可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当 稀释后重新测定。
竞争法测抗原
E
E
E
E
（+）
E EE
E EE
（-）
（二）检测抗体的方法
1.间接法
将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中 相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物， 再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合， 形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底 物后的显色程度确定待检抗体含量。
第八章酶免疫技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
临床医学检验临床免疫技术：酶免疫技术必看题库知识点
临床医学检验临床免疫技术：酶免疫技术必看题库知识点1、单选制备酶标记物的交联剂的反应基团至少应有（）A.5个B.4个C.3个D.2个E.1个正确答案：D2、单选ELISA双抗体夹心法（）A.将（江南博哥）酶标记特异抗体用于检测抗原B.先将待测抗原包被于固相载体C.标记一种抗体可检测多种抗原D.能用于半抗原的测定E.将酶标记抗抗体用于抗原检测正确答案：A3、单选为消除非特异性显色导致的本底偏高，酶免疫技术中将抗原抗体包被后需再进行封闭的是（）A.15％～25％牛血清白蛋白B.10％～15％牛血清白蛋白C.10％牛血清白蛋白D.1％～10％牛血清白蛋白E.1％～5％牛血清白蛋白正确答案：E4、单选下述哪一种酶联免疫吸附实验方法最常用于抗原测定（）A.间接法ELISAB.反向间接法ELISAC.竞争法ELISAD.双抗体夹心法ELISAE.捕获法正确答案：D5、单选以下哪一种复合物的形成属于间接法ELISA免疫反应结果（）A.固相抗原-抗体-酶标二抗B.固相抗体-抗原-酶标抗体C.固相二抗-IgM抗原-酶标抗体D.固相抗体-酶标抗原E.固相抗体-抗原-抗体-酶标抗体正确答案：A参考解析：间接法是检测抗体常用的方法。
其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
6、单选酶免疫技术中的酶结合物指的是（）A.酶标记抗体B.酶标记抗原C.酶标记抗原或抗体D.结合在固相载体上的酶E.酶与底物的结合正确答案：C7、单选酶联免疫吸附试验（ELISA）中应用最多的底物是（）A.邻苯二胺（OPD.B.四甲基联苯胺（TMB.C.ABTSD.对硝基苯磷酸酯（p-NPP）E.以上都不是正确答案：B参考解析：邻苯二胺灵敏度高，比色方便，是ELISA中应用最早的底物，但稳定性差，反应过程需要避光，还具有致癌性；四甲基联苯胺稳定性好，反应无需避光，没有致突变作用，是目前应用最广泛的底物，但是水溶性差。
酶免疫技术
酶免疫技术
酶免疫技术：加速疾病检测的显微镜
酶免疫技术是一种高灵敏度、高特异性的检测方法，被广泛应用于医疗、食品安全、环境检测等领域。
该技术基于酶和抗原或抗体的特异性结合，利用化学反应转化出光、色或荧光信号，进而检测目标物质。
酶免疫技术的优势在于其对微量物质的检测能力，这使得其在疾病早期检测、病毒感染的筛查、癌症标志物的检测等方面具有广泛的应用前景。
同时，其简单快速、操作灵活、适应性强等特点也使其成为一个备受关注的研究热点。
一般而言，酶免疫技术包括ELISA、Western blot、免疫电泳等多种形式，不同的应用场景需要选择不同的技术。
其中，ELISA技术是最常见、最常用的酶免疫技术，其原理是将检测目标物质在固相载体上捕获，然后通过酶标记的抗体进行检测。
该技术被广泛应用于疾病检测、环境污染物的检测等领域。
虽然酶免疫技术在很短的时间内已经成为了最常用的检测方法之一，但仍有一些问题需要解决。
其中，对标准样品的控制、抗体的质量保证、检测灵敏度的提高等问题需要进一步改进和完善。
总之，作为一种成熟的检测技术，酶免疫技术在医疗、环保等领域的应用前景广阔，而其不断的技术创新和改进也将进一步提高其检测灵敏度和特异性，促进医疗诊断和环保监测的发展。
免疫学--酶免疫技术
Enzyme Immunoassay
❖ 酶免疫技术：
是用酶作标记物标记抗原或抗体，将抗 原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专 一性结合在一起的一种免疫检测技术。
本章主要内容
1.酶 标记物的制备 2.酶联免疫吸附试验 3. 酶免疫印迹试验 4. 生物素放大酶免疫技术
第一节 概述
一、技术原理 二、酶免疫技术的类型
是一种以膜为载体的酶免疫技术，以膜为载 体吸附抗原，加入抗体和酶标二抗，反应后 在膜表面形成免疫复合物，加底物显色进行 检测。
类型： 斑点酶免疫试验
（dot immunoenzyme filtration assay） 免疫印迹试验
（immuno-blotting test）
（一）斑点-酶联免疫吸附试验
❖ 生物素亲和素系统酶联免疫吸附试验 Biotin-Avidin System ELISA
一、生物素-亲和素系统
❖ 生物素： Biotin ❖ 亲和素： Avidin
生物素
➢维生素H ➢动、植物组织中广泛分布,
卵黄和肝含量高,现可人工合成 ➢MW 244.31kD ➢结构：咪唑酮环＋噻吩环（图）
PAP:
过氧化物酶(P)-抗过氧化物酶(AP)复合物
Ag-Ab1-桥Ab2-PAP-桥Ab2B-ABC-S
第六节均相酶免疫测定
❖ 酶放大免疫测定技术 ❖ 克隆酶供体免疫测定技术
第七节 酶免疫测定的应用
1. 病原体及其抗体测定 2. 蛋白质测定 3. 非肽类激素测定 4. 药物和毒品测定
思考题： 1. 酶免疫技术的类型。 2.ELISA的基本原理。
二、技术类型
（一）酶免疫测定技术与酶免疫组化技术 1. 酶免疫组织化学技术:
酶免疫技术
酶免疫技术酶免疫技术是一种广泛应用于生物科学领域的技术，可以用于检测、诊断、研究和治疗各种疾病。
它利用酶作为标记分子，结合抗原-抗体反应原理，通过酶的催化作用来检测、测定或定位目标物质。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高稳定性的特点，在医学、生物学和生物化学等领域有着广泛的应用。
酶免疫技术的基本原理是利用抗原与抗体的特异性结合，将抗原或抗体与酶标记物结合形成复合物，再通过酶的催化作用来检测目标物质的存在或浓度。
常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）和β-半乳糖苷酶（β-gal）等。
这些酶标记物可以与底物反应产生可测定的信号，如光、发光、颜色等。
酶免疫技术在临床诊断中起到了重要的作用。
例如，酶免疫分析技术（ELISA）可以用于检测人体内的抗体或抗原，用于诊断某些传染性疾病，如艾滋病、乙肝等。
ELISA技术的灵敏度高，特异性强，成本低，操作简单，因此被广泛应用于临床实验室中。
此外，酶免疫技术还可以用于检测药物、毒素、激素等物质的浓度，提供了临床药物监测和药物治疗的重要手段。
在生物学和生物化学研究中，酶免疫技术也发挥着重要的作用。
例如，免疫组织化学染色技术可以用于检测组织或细胞中特定蛋白的表达情况，从而研究蛋白的功能和相互作用。
此外，酶免疫技术还可以用于检测基因表达水平、蛋白质相互作用、酶动力学研究等领域。
酶免疫技术在生物科学领域的广泛应用离不开其优势和特点。
首先，酶免疫技术具有高灵敏度和高特异性，可以检测目标物质的极低浓度。
其次，酶免疫技术的结果可定量测定，可以提供准确的数据。
此外，酶免疫技术的操作简单，结果可视化，易于分析和解释。
最重要的是，酶免疫技术具有较好的重复性和稳定性，可以用于大规模的实验和临床检测。
酶免疫技术是一种重要的生物学和医学研究工具，具有广泛的应用前景。
它在临床诊断、生物学研究和药物研发等领域发挥着重要作用。
随着科学技术的不断发展，酶免疫技术将不断完善和创新，为人类的健康和生命科学研究提供更多的支持和帮助。
酶免疫技术
酶免疫技术
酶免疫技术是一种常用的生物技术，它利用酶作为标记物来检测特定的生物分子，如蛋白质、抗体、细胞等。
酶免疫技术具有高灵敏度、高特异性、简便易行、快速、经济等优点，因此在医学、生物学、环境监测等领域得到广泛应用。
酶免疫技术的基本原理是将酶标记在抗体或其他生物分子上，形成酶标记物。
当酶标记物与待检测的生物分子结合时，酶标记物的酶活性会发生变化，从而可以通过测定酶活性的变化来检测待检测的生物分子。
酶免疫技术有多种类型，其中最常用的是酶联免疫吸附试验（ELISA）。
ELISA是一种基于酶标记物的免疫学检测方法，它可以检测抗体或抗原的存在和浓度。
ELISA的基本原理是将待检测的生物分子固定在试验板上，然后加入酶标记的抗体或抗原，使其与待检测的生物分子结合。
随后加入底物，酶标记物会催化底物的反应，产生可测量的信号。
ELISA可以用于检测多种生物分子，如蛋白质、抗体、细胞等，因此在医学、生物学、环境监测等领域得到广泛应用。
除了ELISA外，还有其他酶免疫技术，如免疫印迹（Western blotting）、免疫组化（immunohistochemistry）等。
这些技术都利用酶标记物来检测生物分子，具有高灵敏度、高特异性、简便易行、快速、经济等优点，因此在生物学研究和临床诊断中得到广泛应用。
酶免疫技术是一种重要的生物技术，它利用酶作为标记物来检测特定的生物分子，具有高灵敏度、高特异性、简便易行、快速、经济等优点，因此在医学、生物学、环境监测等领域得到广泛应用。
临床检验免疫学酶免疫技术课件
色，应避光，致癌性 四甲基联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）:
反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差 ABTS (2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)
反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的 酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记 Ag（Ab）的浓度成反比
四）捕获法(capture ELISA )：
主要用于 血清中某种抗体亚型成分的测定 检测IgM抗体最常用方法
原理：
（三) 结果分析：
1、定性
• 间接法与夹心法：正相关 竞争法：反相关
4℃过夜
弃包被液，PBS清洗
保存备用。
三）封闭(blocking)
1、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程
2、常用的封闭剂：1％～5％牛血清白蛋白
二、酶免疫技术分类
Ag-E + Ab E-Ag Ab + Ag-E
EE
E
E
三、酶联免疫吸附试验
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
待测抗原或抗体量与产物量呈负相关
基本原理
测定抗原:
测定抗体
特点：
用于抗原和半抗原的定性、定量测定，也可对 抗体进行测定
酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力
反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是 固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与 非标记Ag（Ab）的分子数量和
医学免疫学 酶免疫技术
• 用于检测标本中抗原（抗体）定性或定量的检测 Ag -E + Ab E -Ag-Ab
反应结束后，免疫反应的进行与否及程度，通过反应体 系中的酶活性来体现 游离的抗原、抗原抗体复合物上都有酶分子 均相酶免疫测定
特殊设计的酶标物，使反应结束后，不需分离游离和结合状态的 酶标物，即可对反应作出判定
ELISA的技术类型
• 检测抗原 – 双抗体夹心法 – 双位点一步法 – 竞争法 – 双夹心法 – 桥联法 • 检测抗体 – 间接法 – 双抗原夹心法 – 竞争法 – 桥联法 – 捕获法
双抗体夹心法
原理
显色 底物 酶标抗体 无关抗原
Ag
Ag
Ag
洗涤液 固相抗体
如待测标本中有相应抗原最后形成固相抗体、待测抗原和酶标抗体复合 物，加底物显色，结果判定为阳性。显色深浅正比于待测抗原的浓度 用于大分子抗原的检测。例：HBsAg、HBeAg
非均相酶免疫测定
需分离游离和结合状态的酶标物，通过检测结合状态的酶活性，对反 应作出判定
ELISA
• 基本原理 – 将抗原（抗体）连接在固相载体上，保留免疫学活性 – 将抗原（抗体）与酶连接，形成酶标物，保留各自的活性 – 按一定的步骤在固相载体上，分别加入待测标本和酶标物 – 充分反应后，通过洗涤去除游离物质 – 在固相载体上加入底物，测定底物的显色情况（肉眼、酶 标仪）对待测物质作出定性或定量的判定
为检测抗体常用的方法
双抗原夹心法
• 原理
显色 底物
待测抗体 固相抗原
两对半检测中，抗-HBs用此法检测
竞争法
• 原理
抗原的固相化 无待测抗体 有待测抗体 显色 底物
Ag
酶免疫技术专题知识讲座
乙型肝炎病毒关键HBc-IgM抗体
酶免疫技术专题知识讲座
第44页
捕捉法
原理：
抗人IgMμ链抗体包被
捕捉待测标本中IgM类抗体
加入特异性抗原和酶标识特 异性抗原抗体
底物显色
酶免疫技术专题知识讲座
第45页
+ 酶免疫技术专题知识讲座
EE
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
种类
•塑料制品 •微颗粒 •膜载体
酶免疫技术专题知识讲座
第21页
包被与封闭
包被 coating
将抗原或抗体结合于固相载体
封闭 blocking
用1%～5%牛血清白蛋白或5%～20%小牛 血清消除固相载体表面未结合位点，消除非 特异性吸附
酶免疫技术专题知识讲座
第22页
第二节 酶免疫技术分类
酶免疫技术专题知识讲座
酶免疫技术专题知识讲座
第49页
小结
• 酶免疫技术是标识免疫技术一个，它是以酶标识抗原或 抗体作为主要试剂免疫检测方法，在抗原与抗体特异性 反应完成后，经过酶对底物作用深入提升敏感性。酶免 疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类, 后者依据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离酶标 识物而分为均相和非均相两种类型。
第三节 酶联免疫吸附试验
酶免疫技术专题知识讲座
第30页
一、基础原理
原理
1
包被
洗涤
3
使结合在固相上
抗原抗体复合物
与未结合分离
酶免疫技术专题知识讲座
2
反应
加入待测抗体或
抗原和酶标抗原
或抗体
--临床免疫学酶免疫技术
第十章酶免疫技术本章考点1.酶免疫技术的特点2.酶免疫技术分类3.酶联免疫吸附试验（ELISA）4.膜载体的酶免疫测定5.临床应用第一节酶免疫技术的特点酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性的一种标记免疫技术。
该技术所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。
最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。
另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。
一、酶和酶作用的底物1.辣根过氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。
它是一种糖蛋白，含糖量约l8%；分子量为44kD；是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。
主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。
HRP对受氢体的专一性很高，除H202外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。
后者为固体，作为试剂较H202方便。
许多化合物可作为HRP的供氧体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS。
OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。
其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。
TMB无此缺点。
TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。
ABTS，虽然灵敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。
2.碱性磷酸酶（AP）：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。
从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠黏膜提取的AP分子量为l00kD，最适pH为9.6。
一般采用对硝基苯磷酸酯（p-NPP）作为底物。
它可制成片状试剂，使用方便。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
第二节 酶免疫技术的分类
酶免疫组织化学技术 组织切片或其它标本中抗原的定位分析
酶免疫分析技术
酶免疫测定技术 液体标本中抗原或 抗体的定性和定量
均相酶免疫测定 异相酶免疫测定
酶放大免疫测定技术
克隆酶供体免疫测定 固相酶免疫测定：
酶联免疫吸附试验(ELISA)
液相酶免疫测定
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶）OD 值之比
酶的纯度并不代表 酶的活力
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
HRP催化的反应式为：
HR DH2+H2OP2→ → → D+2H2O H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性 很高 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多 种
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
23
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
一、均相酶免疫测定法
酶蛋白与抗原或抗体结合形成酶标记物。 未与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为游离标记物。 与抗原（抗体）结合的标记抗体（抗原），称为结合标记物。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
教学目的要求： 1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或
抗原；熟练掌握固相载体。 2.熟练掌握酶免疫技术的分类 3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及
原理 4.掌握酶免疫测定的应用
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
三大三经大典经标记典技标术记技术
荧
放
酶
光
射
免
（二）固相载体的种类
1．塑料制品 由聚苯 乙烯、聚氯乙烯制成。 形状。主要有微量反应
板、小试管和小珠三种。
微量反应板
2．微颗粒 微颗粒是由 高分子单体聚合成的微
球或颗粒。
3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸纤 维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
2.酶标记物的鉴定 （1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩 散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有 免疫活性。 （2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合 物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算 其标记率。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
三、固相载体
➢固相抗体或抗原:就是把抗体或抗原结合 到固相载体的表面
免
免
疫
疫
疫
技
技
技
术
术
术
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
第一节 酶免疫技术的特点
基本原理
• 酶标抗体（抗原） 与抗原（抗体）的 特异性反应
• 酶对底物的显色反 应
• 对抗原或抗体进行 定位、定性或定量 的测定分析
酶高效催化反 应的专一性
+
抗原抗体反应 的特异性
➢固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将 游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用 方法
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（一）固相载体的要求
•结合抗体或抗原的容量大 •抗体或抗原牢固地固定在其表面 •不影响免疫反应性 •利于反应充分进行 •固相方法简便易行，快速经济
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（二）酶标记物的纯化与鉴定 1．酶标记物的纯化
标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游 离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物， 避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原) 的竞争作用。
常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和 硫酸铵沉淀法等。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（一）常用的酶
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
1、辣根过氧化物酶
（horseradish peroxidase ,HRP）
国内以辣根过氧化酶最为常用
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心
纯度数（RZ）值与 酶活性无关，酶活 性单位（U）比RZ 值更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
HRP常用底物
邻苯二胺 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应 后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致 癌性。 四甲基联苯胺 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止 反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致 癌性，ELISA中应用最广泛的底物。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（二）碱性磷酸酶
（β-galactosidase，β-Gal）
源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D半乳糖苷 （ 4MUG ）
酶作用后，生成高强度荧 光物 ，用荧光计测量。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
二、酶标记抗体或抗原
酶免疫技术的核心组成部分
酶结合物 酶标记物
通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的
（三）包被与封闭
将抗原或抗体固相化结合在固相载体 上的过程称为包被（coating)。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为 例说明免疫吸附的过程：
抗原（抗体）→用PH9.6的碳酸盐溶 液稀释 → 4ºC过夜 → 用10%的小 牛血清再包被一次，以消除固相载体表 面未吸附的位点，此过程叫做封闭。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
第一节 酶免疫技术的特点
基本原理
• 酶标抗体（抗原）
抗原
底物
与抗原（抗体）的 特异性反应
酶标抗体
E
E
E
• 酶对底物的或定量 的测定分析
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
一、酶和酶作用底物
（一）标记酶的要求： ①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得
结合物
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（一）酶标记抗体或抗原的制备
技术方法简单、产率高，重复性 好
标记方法要求
标记反应不影响酶和抗原或抗体 的活性
酶标记物稳定 ，不易发生解离
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
制备方法
1.戊二醛交联法
适合各种酶蛋白的标记。
2.过碘酸钠氧化法
常用于HRP标记抗体或抗原
（alkaline phosphatase，AP)
是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取
AP的 底物
对-硝基苯磷酸 酯（ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
敏感性高于HRP,但不易获得高纯度的制品、 稳定性差，价格贵
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
（三）β-半乳糖苷酶