植物细胞的大规模培养
第七章植物细胞和次生物质生产详解
（三）成功的悬浮细胞培养体系必须满足 三个条件：
• 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般 在30～50个细胞以下
• 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。
• 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3 天甚至更短时间便可增加一倍。
• 1悬浮培养体系的建立
①材料
• 愈伤组织
• 外植体：幼苗、胚轴、子叶。
如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太 长，则会引起细胞的大量死亡和解体。因此，当 细胞悬浮液达到最大干重产量之后，即在刚进入 静止期的时候，须尽快进行继代。
• （2）连续培养
指在培养过程中，不断注入新鲜培养基， 排掉用过的培养基，保持培养物的容积恒 定，使培养液中的营养物质得到不断补充。 类型分为封闭型和开放型两种
例如： 麻醉药物：莨菪碱 健身药品：人参皂苷、人参三醇 心血管系统方面：芸香苷、槲皮素 天然色素：叶黄素、类胡萝卜素 香水香料类：挥发油
• 3、植物细胞大规模培养是生产植物次生产 物的理想途径 保护生态环境 提高生产效率 发展新型生物技术产业
植物次生代谢产物市场潜能
产品成分 用途
年销售额（亿美元）
• 例如：新疆紫草愈伤组织的诱导
• 种子 消毒 萌发 根、胚轴、子叶（作 为外植体） 接种到含2.4-D和KT的MS培养基 上诱导愈伤组织。
② 筛选方法
• 愈伤组织外观为大小均一的小颗粒，疏 松易碎、外观湿润、，细胞色泽呈鲜艳 的乳白或淡黄色。
• 挑出愈伤组织培养于高有机质、高激素、 低糖的培养基中培养，诱导出更多得到 愈伤组织。
平板培养技术
二、植物细胞的悬浮培养
• （一）定义： • 细胞悬浮培养（cell suspension culture）：
植物细胞培养
细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚 至更短时间便可增加一倍。
6、影响悬浮细胞生长的因素：
起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再 生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。
Culture
1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细 胞群体，适于大规模培养；
2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研 究细胞的生长、分化创造方法和条件。
细胞悬浮培养的应 用
植物
细胞悬浮
人工种子
原生质体分离
突变筛选
Secondary products
三.细胞悬浮培养的方法
1、培养基 对于用愈伤组织制备的悬浮细胞培养的 培养基以原愈伤组织继代时的培养基除 去琼脂为好。为了提高细胞的分散度， 对于生长素和细胞分裂素的比例需要进
接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使 延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在 0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则 会使细胞生长延迟。
培养条件：方式、温度、继代周期
四、悬浮细胞的同步化
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的 分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化， 所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一 培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生 理学状态，工作中常用的处理方法： 1、物理方法 1）分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处 于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的 细胞继代培养于同一培养体系中。
植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4 份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀 的平铺在培养皿中，其厚度为1-2mm。 待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或
植物细胞的大规模培养
影响悬浮细胞生长的因素：
起始愈伤组织的质量
接种细胞密度 培养条件：方式、温度 继代周期
细胞生长情况分析测定方法：
1、细胞计数：单位体积细胞浓度；
2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积； 3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重 4、有丝分裂指数：有丝分裂细胞占总细胞的百分数
细胞活力测定
质不断补充，细胞保持在增值最快的对数生长期
封闭式：回收流出的细胞于培养系统中，细胞数目增加 开放式：流出的细胞不回收于培养系统中，但进行细胞收获 半连续培养：新鲜培养液每隔一段时间添加，用过的培养液平衡排 出，营养物质不断补充
细胞培养同步化：
1、物理法
1）体积分选 2）冷处理法 2、化学法
1）饥饿法
植物细胞固定化的技术
按其支持物可分为两大类： 1.包埋式： 琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺
维
悬浮培养
悬浮培养优点：
增加培养细胞与培养液的接触面积，改善营
养供应
避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而
对细胞自身产生毒害
保证氧气的充分供应等。
悬浮细胞培养的类型有：
成批培养：只有一定的气体交换，营养物质耗尽，细胞和产物一次 性收获。
连续培养：新鲜培养液连续添加，用过的培养液平衡排出，营养物
特点：细胞固定，而培养液循环流动
细胞固定化意义（优点）：
1）细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。
2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。 3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。 4）有利于进行连续培养和生物转化。
三、大规模细胞培养技术
三、大规模细胞培养技术这里所说的细胞培养包括微生物和动植物细胞的培养；所谓大规模培养是指有别于实验室的培养而言。
在实验室中进行细胞培养主要是掌握细胞的生长、殖、生理、生化等规律，所采用方法和仪器要求精密，但处理量很小，如在好气菌的液体培养时，一般采用扁瓶或摇瓶，靠瓶口的棉塞进行供氧。
在生产中，培养细胞的目的是为了收集大量的细胞（如面包酵母、非分泌型重组大肠杆菌）通过细胞的催化作用大量生产代谢产物（如氨基酸和抗生素）或进行生物转化笛体化合物的转化、污水处理）。
由于细胞培养量大，所采用的容器也必然很大，但单位液体体积所占有的液体表面却比小型容器少得多，不可能再采用表面通气或震荡的方法来供氧了。
带有通气和搅拌装置的生物反应器正是为了适应大规模细胞培养才产生的。
此外，在工业生产中，还需考虑经济有效、方便可行和可进行人为控制等因素。
为此，环绕大规模细胞培养有不少带有共性的工程技术问题，如氧的供需、物质传递、细胞生长和产物形成动力学、生物反应器的结构和操作、过程检测与控制等。
这些问题有的将在以后诸节中介绍，本节将着重介绍各类细胞培养的特点、氧的供需和各种培养方式三个问题。
1 •各类细胞的培养特点在微生物范围内，细菌、放线菌、酵母、霉菌中的不少菌株常用来进行发酵、微生物转化或作为基因工程的宿主。
在动物细胞中，哺乳动物的某些淋巴细胞、表皮（包括皮肤以及器官、体腔的表层组织）细胞、成纤维细胞的细胞系以及某些鱼、昆虫细胞系可以用来进行传代培养。
其中淋巴细胞常用来与骨髓癌细胞经原生质体融合形成各种杂交瘤以生产单克隆抗体，或通过病毒的刺激生产干扰素；表皮及成纤维细胞中某些细胞系可用来进一步培养病毒以生产疫苗，有的可作为基因工程的宿主。
由于动物细胞属结构和功能齐全的真核细胞，因此对外源基因的表达更为完整和正确，且可以获得结合蛋白产品。
在植物界中，几乎所有的双子叶、单子叶、裸子植物以及蕨、鋅都能进行细胞培养。
某些植物细胞系可以用来生产次级代谢产物。
动植物细胞大规模培养
动物细胞大规模培养技术-培养基组成
二、动物细胞培养基组成及制备
1、培养基组成
天然培养基
使用最早，营养成分高，也最为有效。 成分复杂，个体差异大，来源也缺乏，因而使用受到限制。 动物血清是细胞培养中用量最大的天然培养基
合成培养基
合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合 成的，具有一定的组成。 它给细胞提供了一个近似体内生存环境，又便于控制和标 准化的体外生存环境。 合成培养基的种类虽多，但一般都含有氨基酸、维生素、 碳水化合物、无机盐和一些其它辅助性成分。
营养成分 尽管植物细胞能在简单的合成培养基生长，但营养成
分对植物细胞培养和次生代谢产物的生成仍有很大的影响。营养 成分一方面要满足植物细胞的生生长所需，另一方面要使每个细 胞都能合成和积累次生代谢产物。普通的培养基主要是为了促进 细胞生长而设计的，它对次生代谢产物的产生并不一定最合适。
植物细胞大规模培养技术-培养因素
从培养方式来看，动物细胞无论是贴壁培养或是悬浮培养， 均可采用分批式、分批补料式、半连续式、连续式等多种培 养方式。从培养系统来看，主要采用中空纤维培养系统和微 载体系统，且以灌注式连续培养方式为佳。
动物细胞大规模培养技术-培养方法
三、动物细胞培养方法和环境要求
2、动物细胞培养的环境要求
影响动物细胞生长、繁殖的环境因素很多，主要有细胞生长 的支持物、气体交换、培养温度、pH、渗透压及其它因素等 方面。
一、植物细胞培养基组成及制备
植物细胞培养，不同培养阶段必需采用不同培养基。培养基 主要由碳源、有机氮源、无机盐、植物生长激素、有机酸和一些 复合物质组成。
碳源
蔗糖或葡萄糖是常用的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可 增加培养细胞的次生代谢产物量。
第六章 动植物细胞培养
第一节
动植物细胞培养的特性
一、动物细胞培养的特性
技术发展历史：
1907年，美国，Harrison首次将蛙的神经组织在试管内培养 成功。 1950年，Enders及同事发表第一篇在培养细胞中生长病毒的 报告。 1972年，Knazek等创立中空纤维细胞培养技术，使细胞体外 培养扩展为大规模培养。 1986年，Demo生物公司用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞 生产单克隆抗体获得成功。 随后，动物细胞培养技术日趋完善。
维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，它 们在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶，对细胞的代 谢有重大的影响。 糖类：多数合成培养基都含有葡萄糖，它主要由糖 酵解作用代谢形成丙酮酸，并可转化乳酸或乙酰乙 酸进入柠檬酸循环形成CO2。对胚胎细胞和转化细胞， 乳酸在培养基中的积累特别明显。 无机离子：是细胞的重要组成部分之一，参与了细 胞的代谢活动。培养基中的无机离子除K+、Na+等外， 还含有Fe2+、Zn2+、Cu2+等微量离子。
生物反应工程原理
李艳 教授
生物科学与工程学院 lymdh5885@ ly5885@
第六章 动植物细胞培养
动植物细胞培养技术：将动植物组织、器官在适当 的培养基上进行离体培养的技术。 组织：指由结构和功能相似的细胞和细胞间质组成， 具有一定形态和生理功能的聚集体。 器官：指机体中具有特殊结构和完成特殊功能的分 化部分。 组织与器官培养：在人工条件下，使它们得以继续 生存或发展的一种培养方法。
1、动物细胞培养的环境要求 2、培养基组成 3、常用的合成培养基 4、培养基制备应考虑的因素
植物细胞培养
分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所 培养的细胞使其分裂和生长； 将饲养细胞与靶细胞混合于液体培养基中. 有四种： 共同混合与琼脂糖培养基中 饲养层位于下层，靶细胞位于上层 一起培养与液体培养基中 双层滤纸植板培养：
看护培养：
Muir于1953年创立 用一块活跃生长的愈伤
组织来看护单细胞使之 持续分裂生长和增殖的 培养方法。这个愈伤组 织块称为看护愈伤组织 简便、成功率高 不能在显微镜下直接观 察
容易放大实现规模化；
三、植物细胞的培养基
培养基组成 无机盐 碳源 植物生长激素 有机氮源：蛋白质水解产物、谷氨酰胺或氨基
酸混合物，对初级培养的早期生长阶段有利。 有机酸：丙酮酸等 复合物质:椰子汁 MS、 B5、N6
四、植物单细胞培养
单细胞制备方法 单细胞培养方法 悬浮细胞的同步化方法 细胞保存 植物细胞培养的意义与应用举例
B．按震荡与否分为
a．静置培养；b震荡培养（摇床、转 床悬浮培养）
C．是否加Leabharlann 他细胞培养：a．饲养层培养：将饲养细胞与靶细 胞混合于液体培养基中.
b．看护培养：将一块生长活跃的愈 伤组织（或组织）放入培养基中，再在 上放置一层滤纸，滤纸上加上靶细胞进 行培养。
饲养层培养法
看护培养
用一块活跃生长的愈伤组织 来看护单细胞使之持续分 裂生长和增殖的培养方法。
（四）细胞的保存
1.继代保存 常温，每1~2周换一次液体，植物和海藻多用此法 低温保存：5~10°C下培养，10天换一次培养液，对
于微生物可保存几个月，使用时要活化，防止水分蒸 发（用石蜡封口，或加液体石蜡。） 冰冻保存：-20°C保存，可保存一到两年，仍有活力。 如优良的植物细胞系、动物细胞也可保存在液氮或70°C的冰箱中，一般用5%、10%或15%的甘油及 10%的二甲基亚砜（DMSO）冻存或传代细胞。细胞 数量为2~6x106，用90%培养液+10%DMSO冻存 在2ml的安培瓶中。
第八章——植物细胞培养
4、PH和二氧化碳浓度
在悬浮培养时，PH变动相当大。加入EDTA使铁和其他金属离 子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作 为稳定PH的一种方法。
二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中， 二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用。
植物细胞生长和活力的测定
一、悬浮培养中细胞生长的测定 1、细胞计数：把1份培养液加入到2份8%三氯化铬溶液中，在 70℃下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震荡10分钟，用 血球计数板进行细胞计数。 2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个15ml刻 度离心管中，在2000g下离心5min，得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积（PCV）：以每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。
第八章-植物细胞培养
植物细胞培养简介
• 概念： 在培养基中培养彼此分离的细胞、使之生长、 增殖或分化。 包括固体培养和液体培养2种形式。
固体培养(solid culture)
• 在固体培养基中培养细胞=静止培养。细胞被固定、 不能移动；单细胞分裂后形成细胞团。
优缺点: 1）所得到的各个细胞团均为单细胞形成，遗传成分和 生理特性具有一致性； 2）细胞生长速度较慢； 3）不能长期、连续、大规模培养细胞。
烟草细胞接种密度和植板率
影响植板率的因素
(4) 培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条 件化培养基，植板率高。 (5) 培养方式：采用看护培养（nurse culture） 是可以提高植板率。 平板培养是分离、筛选单细胞无性系的有效方法
看护培养（nurse culture）
植物细胞大规模培养生产次生代谢物质
如某个或某种类型的植物细胞是怎样生长、分裂和分化 的？化学物质（激素等）或者物理因素（重力、压力）等是 怎样影响这些过程的？
第十二章植物细胞大规模培养
目前应用最广的基础培养基主要有MS、B5、E1以及 6培养基。表12-2列出了 、 以及N 培养基。 目前应用最广的基础培养基主要有 列出了 这几种常用的植物细胞培养基。 这几种常用的植物细胞培养基。
问题
1、植物细胞培养基组成包括 、 2、植物生长素、细胞激动素、赤霉素对植物细胞培养上有何作用？ 、植物生长素、细胞激动素、赤霉素对植物细胞培养上有何作用？ 等。
Reinhard等（ 1968）首先将这种设想转变成现实 ，生产出了 哈尔碱 等 哈尔碱(harmine)。 ） 首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱 。 紧接着Kaul等（ 1969）、 Furrya等(1972)和Teuscher等（ 1973）分别培养植物细胞 紧接着 等 ） 等 和 等 ） 获取了其中的薯蓣 山药）皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（ 薯蓣(yu山药 获取了其中的薯蓣 山药）皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）。现在一些 ） 发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。 发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。 目前世界最大批量工业化培养细胞（烟草细胞）已达2万升 万升（ 吨 我国在“ 目前世界最大批量工业化培养细胞 （烟草细胞） 已达 万升（20吨）。 我国在 “八 九五” 计划” 红豆杉细胞生产 五” 、“ 九五 ”和 “863计划”中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞 生产抗肿瘤 计划 中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤 药物紫杉醇的研究 目前已达到60mg/L的世界先进水平。 的研究， 的世界先进水平。 药物紫杉醇的研究，目前已达到 的世界先进水平
表12-1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较 12生产方式 完整植物 植物细胞培养 收获时间 2-3a 21d 紫草宁浓度（% 紫草宁浓度（%干重） 1-2 14
植物细胞培养的概念及意义
7 CELL SUSPENSION CULTURE
7.1 植物细胞培养的概念及意义 7.1.1 定义
植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易 分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散 成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得 大量的细胞群体的一种技术。小规模的悬浮培养可在培养 瓶中进行。大规模的需要利用生物反应器生产。
7 植CE物LL细SU胞S培PE养NSION CULTURE
7.1 植物细胞培养的概念及意义 7.1.2 植物细胞培养的方法
根据培养对象，植物细胞培养主要有单细胞培养、单倍体培养、原 生质体培养等。根据培养系统可分为悬浮培养、液体培养、固体培养、 固定化培养等。
固体培养
琼脂培养
固定化培养
细胞培养
液体培养
产品成分 长春花碱
阿吗灵 奎宁
致热素 毛地黄
用途 治疗白血病 循环系统障碍药
治疗疟疾 杀虫剂
心脏病药
年销售额（亿美元） 18-20（美国） 5-25（全世界） 5-10（美国） 20（全世界） 20-55（美国）
三 七
中 草 药地
黄
红 花
石 刁 柏
7 植CE物LL细SU胞S培PE养NSION CULTURE
植物细胞培养是在植物组织培养技术基础之上发展起来 的。理论基础是植物细胞的单个细胞内存在生命体的全部 能力（全能性）。
7 CELL SUSPENSION CULTURE
What is a bioreactor?
It is a culture vessel generally of a large volume which has provisions for aeration, stirring to achieve medium and cell mixing , contamination control, replacement of used medium and or cells
第十二章植物细胞大规模培养
第十二章植物细胞大规模培养第十二章植物细胞大规模培养1）、了解植物细胞培养基2）、掌握植物细胞培养方法3）、掌握植物细胞的大规模培养技术4）、了解影响植物细胞培养的因素5）、了解植物细胞培养反应器通过本章节的学习，学生能掌握植物细胞培养方法及其工艺。
1植物可含有数量极为可观的次代谢物质。
据保守的估计，目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种，而且还在以每年新发现1600种的速度递增。
我们祖先在与疾病的抗争中已各积累了丰富的利用植物中的生物活性物质治病强身的经验。
李时珍（1953）编纂的巨著《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物。
目前仍哦约25%的法定药品来自植物。
然而植物生长缦慢，自然灾害频繁。
即使是大规模人工栽培仍然不能从根本上满足人类对经济植物日益增长的需求。
因此早在1956年，Routier和Nickell就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。
Reinhard等（1968）首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(harmine)。
紧接着Kaul等（1969）、Furrya等(1972)和Teuscher等（1973）分别培养植物细胞获取了其中的薯蓣皂苷、人参皂角苷和维1斯纳精（visnagin）。
现在一些发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。
目前世界最大批量工业化培养细胞（烟草细胞）已达2万升（20吨）。
我国在“八五”、“九五”和“863计划”中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。
工业化植物细胞培养系统主要有两大类：悬浮细胞培养系统和固定化细胞培养系统。
前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者则相反，细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。
21953年Muir成功地对烟草和直立万寿菊的愈伤组织进行了悬浮培养。
继之Tulecke和Nickell（1959）推出了一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统。
细胞大规模培养技术流程
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在进行细胞大规模培养之前，需要进行一系列的准备工作，以确保培养过程的顺利进行。
植物细胞培养
植物细胞培养植物细胞培养是一项重要的生物学研究技术，通过将植物细胞放入适宜的培养基中，提供适宜的养分和生长条件，使其在无菌条件下进行繁殖和生长。
这项技术在植物生物技术和植物育种研究中有着广泛的应用，可以用于植物组织培养、植物再生、基因工程、植物病毒研究等方面。
接下来，我将详细介绍植物细胞培养的原理、步骤、方法及其应用。
一、植物细胞培养的原理植物细胞培养的原理是利用植物细胞的分裂和再生能力，在培养基上形成功能完整的植株。
培养基中提供的养分和生长因子可以满足植物细胞的营养需求，而适宜的温度和光照条件则有利于细胞分裂和再生。
在无菌条件下进行培养，可以避免外界的微生物污染和干扰，保证细胞培养的成功率。
二、植物细胞培养的步骤植物细胞培养主要包括材料准备、杀菌、建立无菌培养条件、组织处理、细胞培养和植株再生等步骤。
1.材料准备：选择适宜的植物材料，如幼苗的茎尖、子叶、胚乳、花药等作为外植体。
同时准备培养基、培养器具和培养条件所需的试剂和设备。
2.杀菌：将外植体浸泡在含有杀菌剂的溶液中，进行表面消毒，以去除外植体表面的细菌和真菌。
3.建立无菌培养条件：在无菌操作台上进行操作，使用无菌培养器具和培养基，保持操作环境的无菌状态。
4.组织处理：将外植体切割成适当的大小，要求每个组织片段都含有足够的细胞和组织分化能力。
5.细胞培养：将组织片段放置在含有适宜濃度的培养基中，提供适宜的养分和生长因子，调节温度和光照条件，使细胞进一步分裂和分化。
6.植株再生：当细胞分裂和分化达到一定程度时，可以通过调节培养基的成分和添加适宜的激素来诱导细胞形成胚乳、芽和愈伤组织，最终形成功能完整的植株。
三、植物细胞培养的方法植物细胞培养可以通过不同的方法来实现，包括愈伤组织培养、悬浮细胞培养、胚愈伤组织培养等。
1.愈伤组织培养：将外植体的某些部位培养在含有适宜生长因子的培养基上，刺激组织的分裂和分化，形成愈伤组织，进而形成植株。
2.悬浮细胞培养：将植物细胞分散在液体培养基中，进行无瓶培养。
植物细胞培养及次生产物代谢生产
细胞固定化培养技术按照其支持物不 同可以分为两大类：
包埋式固定化培养系统：支持物多采 用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等 ；
附着式固定化培养系统：支持物采用 尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。
（四）、利用细胞培养生产有用物质
第四章
植物细胞培养及次生产物代谢生产
一、悬浮培养
二、单细胞培养 三、植物细胞的规模化培养及有
用物质生产
一、悬浮培养（cell suspension culture）
悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个 游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖 的技术。
1、愈伤组织诱导
要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外 观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状， 松散易碎。
Circulation through an external loop
旋转式培养系统 一般用于产品中试或某些必需裂解细
胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制 精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。
②固定化培养系统
这一技术的优点在于： 可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研
究特定的代谢途径，并便于调节； 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所
平板培养中细胞密度和培养基成分是培养成功的关键，而细胞密度 和培养基成分互相依赖（负相关）。
2、看护培养
看护培养（nurse culture）：是由Muir1954年设计的。
操作方法： 在固体培养基上置入一块 活跃生长的愈组织，再在愈 伤组织上放一小片滤纸，待 滤纸湿润后将细胞接种于滤 纸上。当培养细胞长出微小 细胞团以后，将其直接转至 琼脂培养基上让其 迅速生长
第五章植物细胞培养及次级代谢产物制备
细胞的同步化培养
细胞工程
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同 时通过细胞周期的某一特定时期。
同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、 代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直 希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能 保持相对一致的细胞学和生理学状态。
细胞工程
①体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单细胞。 ②冷/低温处理法：4℃低温下处理几天使细胞同步化 后，再添加新的培养液培养。 ③饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达到同 步化，再添加营养液培养。 ④抑制法：使用抑制剂如尿苷、5-氟脱氧尿苷、秋水 仙素等使细胞达到同步化。
核。 • 细菌只有核糖体一种细胞器。 • 植物细胞比微生物细胞大。 • 生命活动与细胞分裂
细胞工程
第二节 植物细胞培养技术
1、植物细胞培养基
无机盐（大量、微量） 碳源（蔗糖） 有机氮源（水解酪蛋白） 有机酸、维生素 植物生长激素等
细胞工程
植物单细胞分离与小规模培养
（1）单细胞分离
细胞生长各个时期的特点： 滞后期（延迟期）: 细胞很少分裂，其长短与接种量、大小和 继代时原种细胞所处的生长期有关； 对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变 直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期 缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多， 氧气减少； 静止/平台期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚 至开始死亡。 衰亡期：细胞死亡速度加快，细胞开始快速自溶，死亡。
长期以来，植物一直是许多化学品的主要资源，特 别在制药和食品加工业中更是不可缺少； 据不完全统计，至少有20%左右的药物是由植物衍 生而来，而且每年都有发现许多植物来源的新化合物。
植物细胞大规模培养
因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动
需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，
所以必须设计通气装置； 为便于取样观察，一般
还设计有取样口。 可编辑版
13
生物反应器
可编辑版
14
气压式培养系统
考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以 避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使 培养物污染的部位，因此，发展出空气提升 式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。
产品成分 用途
年销售额（亿美元）
长春花碱 治疗白血病 18～20（美国）
奎宁
治疗疟疾
5～10（美国）
致热素 杀虫剂
20（全世界）
毛地黄 心脏病药
20～55（美国）
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植物细胞大规模培养的技术要求：
从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物
细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳
的控制和调节系统。
第十一章 植物细胞大规模培养
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（一）、概述
植物次生代谢产物：植物中一大类并 非植物生长发育所必需的小分子有机化 合物，其产生和分布通常有种属、器官 组织和生长发育期的特异性。次生产物 在植物中的合成与分解过程称为次生代 谢。
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植物产生代谢产物的类型
根据分子结构不同大致分为：
酚类化合物：黄酮类；醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）
从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件：
1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量
恒定的产物。
2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间
内能得到较高产量的终产物。
3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最
好能将其释放到培养基中。
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植物细胞固定化的技术
按其支持物可分为两大类： 1.包埋式： 琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺
2.吸附式：
尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维
植物细胞的大规模培养
植物细胞大规模培养方法
悬浮培养
固体化培养
悬浮培养
是一种使组织培养物分离成单细胞接种于液体培
养基中，在保持良好的分散状态下培养并不断扩增
的方法。
在进行细胞培养时，需要提供容易破裂的愈伤组织
进行液体振荡培养，愈伤组织经过悬浮培养可以产
生比较纯一的单细胞 , 而紧密不易碎的愈伤组织就 不能达到上述目的。
悬浮培养
悬浮培养优点：
增加培养细胞与培养液的接触面积，改善营
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
养供应
避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而
对细胞自身产生毒害
保证氧气的充分供应等。
悬浮细胞培养的类型有：
成批培养：只有一定的气体交换，营养物质耗尽，细胞和产物一次 性收获。
连续培养：新鲜培养液连续添加，用过的培养液平衡排出，营养物
特点：细胞固定，而培养液循环流动
细胞固定化意义（优点）：
1）细胞生长较慢，有利于次生代谢物的积累。
2）易控制化学环境、收获次生代谢产物。 3）细胞经包埋后受剪切力损伤小。 4）有利于进行连续培养和生物转化。
植物细胞培养的应用
植物细胞含有人类所需的成分，包括 初生代谢物 （蛋白 质、碳水化合物、脂肪等）和 次生代谢物 （多酚类、香 精油、生物碱、树脂等），传统提取分离这些物质由于 资源短缺和需求量的加大，难以满足需求，通过细胞培 养生产植物产品成为解决的有效途径。
1、相差显微镜观察法
细胞质环流，正常细胞核 2、FDA（荧光素双乙酸酯）染色法
由于荧光素不能自由的穿越细胞质膜，而能在活细胞中 积累，但死细胞、破损细胞不能积累。
3、伊凡蓝染色法
不被染色的为活细胞
固定化培养：
将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制 备成的网状支持物中，培养液呈流动状态， 进行无菌培养的一种技术。
质不断补充，细胞保持在增值最快的对数生长期
封闭式：回收流出的细胞于培养系统中，细胞数目增加 开放式：流出的细胞不回收于培养系统中，但进行细胞收获 半连续培养：新鲜培养液每隔一段时间添加，用过的培养液平衡排 出，营养物质不断补充
细胞培养同步化：
1、物理法
1）体积分选 2）冷处理法 2、化学法
1）饥饿法
2）抑制法
影响悬浮细胞生长的因素：
起始愈伤组织的质量
接种细胞密度 培养条件：方式、温度 继代周期
细胞生长情况分析测定方法：
1、细胞计数：单位体积细胞浓度；
2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积； 3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重 4、有丝分裂指数：有丝分裂细胞占总细胞的百分数
细胞活力测定