11、石蜡切片免疫组化实验

石蜡切片免疫组化实验

免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三种最常用。

即用型（Elivison）快速酶免疫组化二步法

实验方法原理：根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。

实验材料：石蜡切

试剂、试剂盒：PBS、柠檬酸盐缓冲液、蒸馏水、增强剂、酶标抗鼠、兔聚合物、苏木素、酒精、二甲苯、树胶、盐酸、二氨基联苯胺

仪器、耗材：烘箱、微波盒、塑料切片架、显微镜、胶头滴管

实验步骤：

1、石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。

2、取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）

3、每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS 冲洗3×3’。

4、除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。

5、PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。PBS 冲洗3×3’。

6、除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。

7、除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液（二氨基联苯胺），显微镜下观察5分钟。

8、苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

其他：特点

1. 在切片加上一抗后，第二抗体标记多聚螯合物酶（HRP）的复合物与一抗结合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信号有显著的放大，其敏感性较SABC、SP法高。

2. 由于多聚物在体内不存在，又不使用生物素，从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。

3.辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上，替代传统方法的二抗、三抗，减少了实验步骤，且试剂孵育时间短，只需15分钟，使得免疫组化方法更简单，实验时间比SABC、SP法大为缩短。

链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结SP法

实验方法原理：SP（streptavidin-perosidase）法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。SP法是最常使用的方法。

试剂、试剂盒：二甲苯、酒精、PBS、双氧水、枸橼酸缓冲液、羊血清工作液、辣根过氧化物酶、链霉素、卵白素、苏木素、DAB

仪器、耗材：冰箱、显微镜、烧杯、玻璃缸

实验步骤：

1. 烤片：68℃，20 min。

2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水：二甲苯I 20 min⇒二甲苯II 20 min⇒00%酒精10 min⇒100%酒精10 min⇒95%酒精5 min⇒80%酒精5 min⇒70%酒精5 min。

3. 阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10 min，PBS冲洗3X5 min。

4. 抗原修复：置0.01 M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20 min），自然冷却20 min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5 min。

5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗。

6. 滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5 min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗3X5 min。

7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS冲洗3X5 min。

8. DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。