western blot 中试剂的用途和配制
Western Blot使用技术手册
生物医药基地western blot技术手册1.western blot 主要试剂的配方1.1 5×电泳缓冲液配方(1L)注意事项：a.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。
b.配制好的溶液放于4度冰箱保存，使用时用纯水稀释至1×使用。
1.2 1×转膜液配方（1L）注意事项：a.加入适量的纯水，用磁力转子将各组分溶解后加入甲醇溶液，最后用纯水定容至1L（甲醇气味大，通风厨内配制，并注意戴口罩）。
b.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。
1.3 10×TBS配方（1L）注意事项：a.加入适量的纯水溶解各组分后，使用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调节溶液的PH至7.6（一般溶解后溶液是偏碱的，所以选用浓盐酸调节PH至7.6即可）。
b.使用PH计调节溶液的PH前，要按照说明书校准PH计。
c.PH调节至7.6后，用纯水定容至1L，使用时稀释10倍至1×使用。
d.配制TBST时，在1×TBS中按照1:1000的比例加入吐温20充分混匀即可。
1.4 30%丙烯酰胺单体储存液配方（100ml）注意事项：a. 将各组分溶于总体积为60ml的纯水中，加热至37℃完全溶解，用纯水定容至100ml。
b. 用装0.45µm膜的滤器过滤，置于棕色瓶中保存于4℃冰箱保存。
c. 丙烯酰胺有神经毒性，操作时戴手套，并注意不要造成实验台面等的污染。
1.5 上液（1M Tris-HCl PH=6.8）配方（50ml）注意事项：用浓盐酸调节PH至6.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。
1.6下液（1M Tris-HCl, pH8.8 ）（50ml）注意事项：用浓盐酸调节PH至8.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。
2. Western Blot 主要流程2.1蛋白样品的提取2.1.1常用裂解液及其特点2.1.2 医药基地常用蛋白质提取方法⑴RIPA强裂解法：a. 取适量胰酶消化细胞（针对对贴壁细胞，悬浮细胞可省略此步），收取细胞，PBS洗两遍，600g离心5min，尽量去除PBS，向细胞沉淀中加入适量的预加了蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA强裂解液（80ul ——200ul不等，根据自己细胞量的多少定）。
Western_blot_试剂配制及操作流程
Western-Blot操作流程试剂配制1.RIPA裂解液：10mM Tris（MW121.14，PH7.5）1%NP400.5%TritonX-1000.2%脱氧胆酸钠2 mM EDTA1 mM PMSF20%甘油调pH值至7.5。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。
使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
制胶用（1-6）：1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8）Tris (MW121.14) 12.114g蒸馏水 100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。
2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 18.671g蒸馏水 100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。
3.10％SDSSDS 10g蒸馏水至 100ml如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
4.10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4︒C保存。
6．30%丙稀酰胺： 4︒C保存。
10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml30%丙烯酰胺 5ml1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml10%SDS 150μl10%AP 150μlTEMED 6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
灌胶后加异丙醇（1ml）消泡5%上层胶（两块胶，6ml）：依次加入去离子水 4.1ml30%丙烯酰胺 1ml1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml10%SDS 60μl10%AP 60μlTEMED 6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
western blot各种液体配制
一、所需试剂的配制1、丙烯酰胺贮存液（30%Acr/Bic）丙烯酰胺（Acr）29.2gN，N-甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g超纯水至100ml37度溶解，4度避光保存一个月，使用时恢复至室温且无沉淀。
2、分离胶缓冲液（4×）（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：Tris（MW121.14）18.15g超纯水90ml用HCl调pH值至8.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
3、浓缩胶缓冲液（4×）（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）:Tris（MW121.14）12.1g超纯水90ml用HCl调pH值至6.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
4、10%十二烷基硫酸钠（SDS）SDS 10g蒸馏水至100ml50度水浴溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶解后仍可使用。
5、10%过硫酸铵（Aps）Aps 0.1g超纯水1ml溶解后4度避光保存，保存时间为一周，现用现配，也可-20度保存6、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）：避光保存。
7、2×上样缓冲液（2×Loading Buffer）：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.8ml10%SDS（电泳级）2ml溴酚蓝0.5mg甘油0.8ml2-巯基乙醇0.2ml蒸馏水 1.2ml总量为5ml，可在4度存放数周，-20存放数月。
（其中2-巯基乙醇可保护二硫键，并使蛋白下沉用利于电泳的进行。
）8、电泳缓冲液（pH8.3）Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4gSDS 1g或10%SDS 10ml蒸馏水至1L无需调pH值（8.2~8.3），可在4度存放数周，次溶液可重复使用3~5次。
9、转移缓冲液：Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4g甲醇200ml蒸馏水至1L先用蒸馏水溶解甘氨酸和Tris，然后再加入甲醇，最后补足液体。
无需调pH值（8.1~8.4），可在4度存放数周。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
western-blot-相关试剂及步骤
western-blot-相关试剂及步骤western-blot-相关试剂及步骤Western Blot蛋白测定步骤三蒸水制备后需要高压消毒一、组织的采集（一）器材和试剂准备：镊子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL 离心管、液氮（二）步骤（以心脏为例）:1、脱颈椎处死小鼠，读取小鼠编号2、乙醇消毒胸部，剪开胸腔，剪下心脏（一颗心脏约100mg），排除血液，放入离心管，投入液氮中3、组织于-80摄氏度冻存二、组织蛋白的提取：（一）器材和试剂准备：4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay，详见下载的网页）（碧云天公司）、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟，详见下载的网页prod号36978，Thermo Scientific）、70%乙醇、三蒸水（二）步骤1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水；取出RIPA和PMSF 解冻2、按照1mLPIRA ：10uLPMSF ：100mg组织的比例，加试剂和组织于4mL离心管3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头（每管5秒），再研磨组织，上下且圆周运动离心管。
每管研磨的转速和时间保持一致。
当出现大量泡沫时即可停止4、静置于冰盒30分钟5、12000rpm，4摄氏度，30分钟6、先取100uL上清于离心管，再取300uL上清于离心管。
前者用于测试，后者备用。
-80摄氏度冻存。
注意：购置的RIPA不宜反复冻融，需分装-80摄氏度保存；PMSF为晶体状，购置后按照说明书溶于异丙醇，分装-80摄氏度保存三、蛋白上样量定量采用BCA法测蛋白（BCA protein assay kit，Prod号23225，详见下载的网页，Thermo Scientific）：（一）器材和试剂准备：1.5mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液（二）步骤1、详见BCA Protein Assay Kit.pdf 使用说明书，配制溶液，制作标准曲线，测定蛋白浓度。
western-blot实验报告
一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
Westernblot试剂配制及操作步骤(最新整理)
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
westernblot中试剂的用途和配制解析
westernblot中试剂的用途和配制解析Western blot是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断中的实验技术，用于检测和分析蛋白质在样品中的存在和表达水平。
Western blot分析依赖于抗体的选择性结合蛋白质的特异性，通过多个试剂的配制和反应，使目标蛋白质能够被有效地检测和定量。
Western blot的试剂主要包括以下几个方面的组分：2. 蛋白质定量试剂盒：用于准确测定提取的蛋白质浓度，以确保在Western blot分析中加载适量的样品。
主要有比色法和荧光法两种方法，如BCA法和 Bradford法。
3. SDS-凝胶缓冲液：SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是Western blot分析的核心步骤，它通过蛋白质的分子大小和电荷进行分离。
凝胶缓冲液主要包括聚丙烯酰胺凝胶缓冲液（Tris-HCl）、离子缓冲液（glycine）和非离子表面活性剂（SDS）。
4. 转膜缓冲液：用于将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
转膜缓冲液一般包含离子缓冲物（Tris/glycine）、甘露醇和界面活性剂（SDS或Triton X-100）。
5. 膜抗坏血酸：用于防止转膜过程中蛋白质的氧化降解。
膜抗坏血酸（methanol）可降低氧气接触并稳定蛋白质。
6.阻断缓冲液：用于抵消非特异性结合和降低背景信号。
主要有含有蛋白酶抑制剂（BSA或奶粉）的TBST或PBST缓冲液。
7.第一抗体：选择性地结合目标蛋白质的抗体。
第一抗体种类繁多，可以是多克隆或单克隆的，并且需要根据研究目的选择合适的抗体。
8.第二抗体：结合第一抗体的抗体。
第一抗体一般经过免疫动物而产生，第二抗体可通过选择性地结合第一抗体并标记荧光素或酶来进行检测和可视化。
9.显色剂：用于可视化目标蛋白质。
显色剂有不同的选择，如酶联免疫吸附法（ECL）或硫脲铵法。
10. 胶片或成像设备：用于获取Western blot结果的图像。
胶片可以通过X射线或激光扫描仪进行扫描和分析，也可以使用成像设备进行直接图像采集。
westernblot中试剂的用途和配制
western blot 中试剂的用途和配制western blot 中试剂的用途和配制一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后40C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O 中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
Western Blot protocol实验步骤
Western Blot protocol主要试剂及缓冲液的配制1). 30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为100ml的水中。
搅拌器帮助溶解，滤纸过滤除杂质，避光保存于4度冰箱。
2). 10% SDS：称量10g十二烷基硫酸钠，加入80ml超纯水中，加热搅拌溶解，加水至100ml室温保存备用。
3).10x蛋白电泳缓冲液：30.2gTris、188g甘氨酸、10gSDS、加水至1000ml4).20×转膜缓冲液：Tris 29g，Glycine 144g，SDS 2g 加水定容至1000ml配制1×转膜缓冲液200ml (甲醇 40ml，20×transfer buffer 10ml，H2O 150ml)5).1.5M Tris 8.8：（注意温度对tris PH值的影响）18.15 g Tris 溶于80ml超纯水中，加浓盐酸调PH值8.8，定容至100ml。
高温灭菌后室温保存。
6).1M Tris 6.8：12.11g Tris 溶于80ml 超纯水，加浓盐酸调PH值6.8，定容至100ml。
高温灭菌后室温保存。
7). 10×PBS：NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4.12H2O 35.85g，KH2PO4 2.4g，用盐酸调PH至7.4，加水定容至1000ml8). 1xPBST(0.05% Tween 20)：10×PBS 100ml，H2O 900ml， Tween 20 50ul9).10%（W/V）过硫酸铵：临时配，0.1g过硫酸铵溶于1ml 超纯水，4度冰箱保存3天10). 丽春红染液储存液(0.1%（W/V）丽春红，5%（V/V）乙酸)：，丽春红0.04g，冰醋酸2ml，超纯水 38ml11). 封闭液：5%（W/V）脱脂奶粉溶于1X PBST 中，使用时现配。
12) Stripping buffer (BME 800ul，SDS 2g，TRIS 0.756g，HCl调pH 至6.7，加水定容至100ml)操作步骤1.蛋白制备：10CM细胞平板，90%满度。
Western blot一抗稀释液
Beijing Leagene Biotechnology Co., Ltd.
版本：A7 修改日期：2023.12.12 Western blot 一抗稀释液
产品简介：
Western blot 一抗稀释液(Primary Antibody Dilution Buffer)可以用于免疫印迹中的一抗的稀释和配制，使用Leagene Western blot 一抗稀释液配制的一抗，可以在4℃保存6个月，并且可以反复多次使用。
该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。
产品组成：
操作步骤(仅供参考）：
1、 根据一抗的使用说明，以及样品中目的蛋白含量，按照适当比例(例1:1000、1:500等
比例)稀释一抗。
2、 直接用于Western 孵育膜，一次Western 结束后，可以回收稀释的一抗4℃保存，用
于下次Western 实验。
注意事项：
1、 为了能使抗体可以反复多次使用，建议尽量在4℃条件下进行一抗和蛋白膜的结合反应，
以减缓一抗的衰减速度。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
3、 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
有效期：12个月有效。
低温运输，4℃保存。
编号 名称 PW0040 PW0040 Storage Primary Antibody Dilution Buffer 50ml 100ml 4℃ 使用说明书
1份。
western blot溶液和试剂
称取一定量的钒酸钠置于水中，用盐酸调pH至10.0，加热沸腾至完全溶解，且溶液无色，待溶液冷却至室温后再调pH至10.0，加热至溶液变无色，再调pH至10.0，如此反复至室温下pH稳定在10.0即可，最后定容至浓度为1M。
1×PBS（7.4）
1×SDS（20ml）裂解液：
15ml的0.1%TBST洗膜3次，每次摇5min（60rpm）；
加入8ml一抗稀释缓冲液，室温2h或者4℃平缓摇动过夜（对于磷酸化抗体一般情况都要4℃过夜，因为磷酸化蛋白多数丰度较低），回收一抗，按1:1000加入叠氮化纳，4℃保存。
15ml的0.1%TBST洗膜3次，每次摇5min（60rpm）；
1.5M Tris-HCl（pH8.8）
18.16g Tris，调pH至8.8冷却至室温后再调至8.8，最后加水至100ml。
0.5M Tris-HCl（pH6.8）
6.06g Tris，调pH至6.8冷却至室温后再调至6.8，最后加水至100ml。
10%SDS：
10g SDS溶于水中，室温保存。
TEMED
1.悬浮细胞：离心收集，PBS洗涤3次，最后一次转移至1.5ml管中，并计算细胞数。按比例加入1×SDS裂解液，一般为 细胞加入至少100μl裂解液（6孔板加120μl），95℃煮5-10min，期间振荡一次，至用10μl枪吸取不感觉有粘稠则可。
贴壁细胞：去掉培养基，PBS洗涤3次，每个孔（12孔板）加入适量的1×SDS裂解液。以Hep3B为例（检测磷酸化蛋白），一般为 细胞（70%的confluence）加入75μl裂解液，迅速用细胞刮刮下细胞并转移至1.5ml管中，用95℃煮5-10min，期间振荡一次，至用10μl枪吸取不感觉有粘稠则可。
Westernblot常用试剂配制
Westernblot常用试剂配制Western blot 常用试剂配制1.5 mol/L Tris (PH8.8)1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．用浓盐酸调节pH值至8.8。
4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的p H 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
（参照kara公司Catalog-N1）1 mol/L Tris (PH6.8)1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。
pH值浓HCl 6.87.4 约70 ml7.6 约60 ml8.0 约42 ml4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。
注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。
（参照kara公司Catalog-N1）30％丙稀酰胺（100ml）1．称量下列试剂置于烧杯中。
丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g双丙烯酰胺(BIS) 1 g2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．定容至100 ml, 用0.45 μm滤膜滤去杂质。
5．于棕色瓶中4 oC保存。
注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）30％SDS1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。
WesternBlot配方和方法
Western Blot 配方和方法Western Blot配液：1.10% SDS 溶液(m/v)：SDS 0.1gDDH O 1ml2加热溶解，室温保存，用后马上拧紧瓶盖。
2.10% 过硫酸铵:APS 0.1gDDH O 1ml2由于过硫胺酸会缓慢分解，最好颖配制，或隔周配制〔也可每 200 微升 EP 分装，4℃保存 4W，-20℃保存 1 月〕3.1× 电泳缓冲液Tris base 3.028gGlycine 14.4gSDS 1.0g用蒸馏水溶解至 1000ml，调整PH 8.3。
冰箱内可保存数月。
4.10 ×转膜液〔储存液〕甘氨酸72.07gTris base 15.14gDDH O 400ml2加水至 500ml，储存液不加甲醇，4℃保存。
1 × 转膜液 1L 配制：10 × 转膜液储存液 100ml，150ml 甲醇，加 DDH O2 750ml，PH 8.5，定容至总量 1L5.1×转膜液〔现配现用〕：Tris base 3.03gGlycine 14.42g甲醇150ml加水定容至 1000ml6.10 × TBS：Tris base 12.1gNaCl 40g加水，用浓盐酸调整 PH 至 7.6 后定容至500ml 7.TBST：1 × TBS/吐温 = 1000/18.封闭液：脱脂奶粉2gTBST 40ml温度适当调整〕〔pH6.8〕配胶：先配分别胶，再配积层胶。
一般两者同时配制，只是最终分别胶先加TEMED 混合后马上灌胶，而积层胶放4℃，等分别胶凝固后再加TEMED 混匀后灌胶。
TEMED 量加大，一般加至原来的2-3倍，依据试验当时的2ml 3ml 5ml 5ml 10% 5ml 5% 5% 8% 10% 两 15% 积 积 分 分 块 分 层 胶 层 胶 离 胶 离 胶胶 离胶超纯水1.42.1 2.3 1.9 2.8 1.1530％Acr/Bic0.3 0.4 1.3 1.7 2.5 2.539551.5mol/L1.3 1.3 0.9 1.3Tris · HCl5 〔pH8.8〕1mol/L 0.2 0.3Tris · HCl 5 75〔为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和10％SDS 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0235575 5 10%APS〔过硫胺0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 酸〕235575 5TEMED 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.002 03 03 02 03 02 双丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比1：29 配制时，SDS- 有效分别范围凝胶浓度〔％〕线性分离范围〔KD)15 12-4310 16-687.5 36-945.0 57-212按所需分别的蛋白质分子大小选择适宜的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于 60～200kDa 的 SDS变性蛋白质分子的分别，10%用于 16～70kDa，15%用于12～45kDa。
western blot 试剂配制
1 制胶材料（试剂配制）（1）浓缩胶缓冲液：称取 6 g Tris溶于40 mL双蒸水中，用l moL /L HCI调至pH 6.8，再加水稀释到100 mL的终体积，即成pH 6.8，0.5 moL/L tris-HCL缓冲液。
过滤后于4℃保存。
（2）分离胶缓冲液：称取36.6 g的Tris和48 mL l mol/L HCL混合，加水稀释至100 mL的终体积。
即成pH 8.8，3 moL/L tris-HCL缓冲液。
过滤后于4℃保存。
（3）5*SDS-PAGE缓冲液储液：称取15.1 g Tris（0.125M），94 g甘氨酸（1.25M），10 g SDS（0.5M），用蒸馏水溶解至800 mL，加水至1L，即成0.125 moL/L Tris-1.2 5 moL/L甘氨酸-0.5M SDS电泳缓冲储液，室温保存。
临用前稀释5倍。
（4）10% SDS溶液：称取l g SDS溶于10 mL双蒸水中，即成10% SDS溶液。
（5）10% 过硫酸胺：l mL双蒸水加入0.1 g过硫酸胺，宜当天配制，最多不超过一周。
（6）TEMED原溶液。
（7）(样品缓冲液)按下方配制：①pH 6.8，0.5 moL/L Tris-HCL缓冲液液8 mL；②甘油 6.4mL；③10% SDS溶液液12.8 mL；④二疏基乙醇3.2 mL；⑤0.05% 溴酚蓝1.6mL；⑥蒸馏水32 mL，混匀备用。
（8）转膜缓冲液：3 g Tris碱、1g SDS和14.48 g甘氨酸，再加200 mL甲醇，补充蒸馏水定容至1 L。
（9）封闭缓冲液：含5%脱脂奶粉、0.025% NaN3溶于TBS-T缓冲液。
（10）5×TBS缓冲液：12.1 g Tris碱，40 g NaCL溶于双蒸水中，用浓HCL调H 值至7.6后，用双蒸水定容至1 L。
（11）TBS-T漂洗液：含0.1% Tween-20的TBS。
（12）30%丙烯酞胺溶液：称取30g丙烯酞胺，溶解于100 mL双蒸水中, 即成30%丙烯酞胺溶液。
western blot 中试剂的用途和配制解析
western blot 中试剂的用途和配制一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂 1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后40C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
(完整word版)Westernblot试剂配制及操作步骤
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1) pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
Western-blot实验所需试剂配制方法
名称 Tris 去离子水 浓盐酸 去离子水
用量 12.1 80ml 8.8-9ml
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
4. 1.5M Tris-HCL, pH=8.8 (36%的浓盐酸) ：
名称 Tris 去离子水 浓盐酸 去离子水
用量 18.17 80ml 2.8-3ml
--
色瓶中 4℃保存，
（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，通过皮肤吸收并具有累积性，配制时应戴手套操作）
2. 10％（W/V）过硫酸铵：
名称
用量 备注
过硫酸铵
0.1g
去离子水
1ml
现配现用
（注意：10％过硫酸铵溶液在 4℃保存能使用两周左右，过期会失去催化效果）
3. 1M Tris-HCL, pH=6.8 (36%的浓盐酸) ：
名称 1MTris-HCL, pH=6.8 SDS 甘油 BPB（溴酚蓝） 超纯水
2ME
用量
1.25ml 0.5g 2.5ml 25mg 至 5ml 50℃充分溶解， 30min，离心取上 清，0.45uM 过滤 10ul/200ul
2.5ml 1g 5ml 50mg 10ml
备注
分装 200ul/管 使用前添加，添加后可室温 保存一个月
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
5. 10%SDS：
名称 SDS 去离子水
用量 10g 80ml
备注 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
ห้องสมุดไป่ตู้--
--
缓冲液配置：
6. 5ⅹTris-Glycine Buffer(SDS-PAGE 电泳缓冲液)
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H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？
解答：260kd的蛋白不好做， 分离胶
2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。
4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、 过氧化物酶标记的第二抗体。
V. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？
解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般
1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。
（可以参看分子克隆）
四、主要步骤
生物秀为您搜集了现阶段几乎网上所有的Western Blot的中英文资料，仅供实验参考，可以根据自己实验的实际情况进行调整：
Western Blot PROTOCOL：
五、 实验常见的问题指南
根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：
上样体积来增大上样量。
Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、 丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
10、 脱脂奶粉5%(w/v)。
O. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
P. 有什么方法可以提高上样量？
解答：可以浓缩样品；增大
用6％， Stacking Gel 3.5％。
I. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的 comb。
N. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.
6、 SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？
解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
3. 抗体
T. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
二、分类
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂
western blot 中试剂的用途和配制
一、 原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
R. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
解答：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等， 如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超过0.3μg/mm2。
S. 一抗，二抗的比例是否重要？
解答：比较重
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、 转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris
L. 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．
M. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？