Western blot 常用试剂配制
western blot各种液体配制
一、所需试剂的配制1、丙烯酰胺贮存液（30%Acr/Bic）丙烯酰胺（Acr）29.2gN，N-甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g超纯水至100ml37度溶解，4度避光保存一个月，使用时恢复至室温且无沉淀。
2、分离胶缓冲液（4×）（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：Tris（MW121.14）18.15g超纯水90ml用HCl调pH值至8.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
3、浓缩胶缓冲液（4×）（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）:Tris（MW121.14）12.1g超纯水90ml用HCl调pH值至6.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
4、10%十二烷基硫酸钠（SDS）SDS 10g蒸馏水至100ml50度水浴溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶解后仍可使用。
5、10%过硫酸铵（Aps）Aps 0.1g超纯水1ml溶解后4度避光保存，保存时间为一周，现用现配，也可-20度保存6、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）：避光保存。
7、2×上样缓冲液（2×Loading Buffer）：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.8ml10%SDS（电泳级）2ml溴酚蓝0.5mg甘油0.8ml2-巯基乙醇0.2ml蒸馏水 1.2ml总量为5ml，可在4度存放数周，-20存放数月。
（其中2-巯基乙醇可保护二硫键，并使蛋白下沉用利于电泳的进行。
）8、电泳缓冲液（pH8.3）Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4gSDS 1g或10%SDS 10ml蒸馏水至1L无需调pH值（8.2~8.3），可在4度存放数周，次溶液可重复使用3~5次。
9、转移缓冲液：Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4g甲醇200ml蒸馏水至1L先用蒸馏水溶解甘氨酸和Tris，然后再加入甲醇，最后补足液体。
无需调pH值（8.1~8.4），可在4度存放数周。
Westernblot所需溶液的配制
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer）5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15。
1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L,pH值为8.3。
使用前,将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液(Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置,因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310％SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50—68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存.4Tris.HCl的配置注：Tris的分子量是121。
4。
4度储存。
5 10% APS （Ammonium persulfate ；过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1。
5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用,短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完.6 10×TBS (Tris-buffered saline）的配置加HCl调pH到7.6，室温储存.7TBST （Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液(loading buffer)的配置SDS—PAGE加样缓冲液：pH6。
8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml,甘油6。
4ml,10%SDS 12。
8ml,巯基乙醇3。
2ml，0.05％溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用.按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20-25ul,总蛋白量100μg。
9 stacking gel buffer (4×）10 5×Sample buffer (10ml）11封闭液的配置Blocking solution 要用TBST配制牛奶5% （w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA0。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
Western blot试剂配制及操作步骤
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
western-blot 通用配方
1.Western Blotting 相关溶液及抗体1)转膜缓冲液（running buffer）(10×)(1L)Tris 30.3g甘氨酸144g不调pH转膜工作液（1×)(1L)（现配现用）(10×)转膜缓冲液（running buffer）100ml无水乙醇100ml水800ml2)TBS 缓冲液(5×)（1L）Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-20 0.1%（1ml for 1L）3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine)4）Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5）Western Blotting 第二抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE 电泳分离蛋白质：(浓缩胶70V，30-40min；分离胶120V，1h)5×loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油1ml 10%（w/v）SDS 0.8mlß-巯基乙醇0.2ml（2）将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1×)转膜工作液(10×)转膜缓冲液（running buffer）80ml无水乙醇80ml水640ml800ml（4）将胶泡在（1×)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1×)转膜工作液中。
（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7）将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干)：白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜（靠正极）--胶（靠负极）（用小试管排气泡）--两层滤纸—海绵（用小试管排气泡）--夹住—放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）--在胶槽中加入转子—倒入（1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V～100V 恒压，60min(该条件可以转移25kD～90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4℃静置过夜。
常用western blot 试剂配方
Western blot常用试剂配方1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml）丙烯酰胺29 g双丙烯酰胺1g加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。
2. 10% SDS：（10ml）电泳级SDS 1 g蒸馏水9 ml初始PH约为7.85，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至7.2，定容至10ml。
3.TEMED（四甲基乙二胺）（成品）4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH 8.8）：50mlTris-base 9.085 g蒸馏水45 ml加浓盐酸（约0.4ml）调PH至8.8后定容至50ml，4℃保存。
5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH6.8）：50mlTris-base 6.055 g蒸馏水44 ml加3.5ml浓盐酸调PH至6.8后定容至50ml，4℃保存。
6. 10%过硫酸铵（10% AP）：0.5ml 新鲜配制称取0.05g AP于1.5ml EP管中，储存于-20℃，用时溶于0.5ml蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50mlupper buffer 0.312 ml 15.6ml甘油（丙三醇）0.5 ml 25mlSDS 0.1 g 5gDTT 0.0385 g溴酚蓝0.005g 0.25g加蒸馏水溶解后定容至1ml。
取0.2ml加0.8ml蒸馏水配成工作液。
8. 5 × running buffer：（1000ml）Tris-base 15.1 g甘氨酸（Glycine）94 gSDS 5 g加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
用时加4000 ml蒸馏水。
9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用）甲醇30 ml冰乙酸10 ml蒸馏水60 ml考马斯亮-250 0.05 g10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配乙酸（10%）50ml甲醇（30%）150ml加蒸馏水定容至500ml。
Westernblot所需溶液的配制
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×Tris base 15.14gGlycine(甘氨酸) 72.0gSDS 5.0g蒸馏水溶解至1000ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）1000 ml 1500 mlGlycine(甘氨酸) 14.413 g 21.6 g1.0 M Tris.HCl (pH8.3) 25 ml 37.5ml10% SDS 1 ml 1.5 ml甲醇(methanol) 200 ml 300 ml蒸馏水溶解至1000 ml 溶解至1500 ml必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
4Tris.HCl的配置1.0M Tris.HCl (pH8.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.5 M Tris.HCl (pH8.8) Tris 45.43 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.0 M Tris.HCl (pH6.8) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到6.81.0 M Tris.HCl (pH8.3) Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.3，需要大约8毫升。
注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
western-blot
一、试剂配置：1、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris+48ml 1mol/L HCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4℃保存。
2、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40ml水中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4℃保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
3、胶配置：加入TEMED后，立即混匀即可灌胶。
4、封闭液：（含5％脱脂奶粉的TBST 缓冲液）脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g+TBST 100ml溶解后4℃保存。
使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
5、抗体:用TBST 稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml。
二、SDS－PAGE 电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml 枪吸取5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4、按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
Westernblot实验所需试剂配制方法
Westernblot实验所需试剂配制⽅法⼀．Western blot实验所需试剂配制⽅法制胶试剂：1.30％（W/V）丙烯酰胺溶液：名称⽤量备注Acrylamide 29g1g 充分搅拌溶解N-甲叉双丙烯酰胺(N，N-methylene-bisacylamide，BIS)去离⼦⽔80ml 定容⾄100ml，0.45µm滤膜过滤除杂，置于棕⾊瓶中4℃保存，（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，通过⽪肤吸收并具有累积性，配制时应戴⼿套操作）2.10％（W/V）过硫酸铵：名称⽤量备注过硫酸铵0.1g去离⼦⽔1ml 现配现⽤（注意：10％过硫酸铵溶液在4℃保存能使⽤两周左右，过期会失去催化效果）3. 1M Tris-HCL, pH=6.8 (36%的浓盐酸) ：名称⽤量备注Tris 12.1去离⼦⽔80ml浓盐酸8.8-9ml 预实验已确定去离⼦⽔加⼊去离⼦⽔定容⾄100ml后，室温保存4. 1.5M Tris-HCL, pH=8.8 (36%的浓盐酸) ：名称⽤量备注Tris 18.17去离⼦⽔80ml浓盐酸 2.8-3ml 预实验已确定去离⼦⽔加⼊去离⼦⽔定容⾄100ml后，室温保存5. 10%SDS：名称⽤量备注SDS 10g去离⼦⽔80ml 加⼊去离⼦⽔定容⾄100ml后，室温保存缓冲液配置：6. 5ⅹTris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)名称⽤量备注pH=8.3Tris 15.1gGlycine 94.0gSDS 5.0g去离⼦⽔800ml 加⼊去离⼦⽔定容⾄1L后，室温保存7. 1ⅹ膜转移缓冲液：名称⽤量备注Glycine 2.9g 2.9gTris 5.8g 5.8gSDS 0g 0.37g甲醇⽤前加200ml甲醇⽤前加200ml甲醇去离⼦⽔定容到1000ml 定容到1000ml 室温保存8. 1ⅹ膜转移缓冲液：名称⽤量备注Glycine 2.9g 2.9gTris 5.8g 5.8gSDS 0g 0.37g甲醇⽤前加200ml甲醇⽤前加200ml甲醇去离⼦⽔定容到1000ml 定容到1000ml 室温保存9. 5×SDS-PAGE Loading Buffer：名称⽤量备注1MTris-HCL, pH=6.8 1.25ml 2.5mlSDS 0.5g 1g⽢油 2.5ml 5mlBPB（溴酚蓝）25mg 50mg超纯⽔⾄5ml 10ml 分装200ul/管50℃充分溶解，30min，离⼼取上清，0.45uM过滤2ME 10ul/200ul 使⽤前添加，添加后可室温保存⼀个⽉10. 封闭缓冲液：名称⽤量备注脱脂奶粉5gTBST 100ml 充分溶解后，4 ℃保存其它：（备⽤）11. 考马斯亮蓝R-250染⾊液：名称⽤量备注考马斯亮蓝R-250 0.1g异丙醇25ml 搅拌溶解冰醋酸10ml 搅拌均匀去离⼦⽔65ml 搅拌均匀，滤纸除去颗粒物，室温保存12. 考马斯亮蓝染⾊脱⾊液：名称⽤量备注冰醋酸100ml甲醇100ml去离⼦⽔800ml 充分混匀后使⽤13. 2%的丽春红贮备液(20mL)：名称⽤量备注丽春红5g三氯⼄酸0.4g磺基⽔杨酸6g 充分溶解，定容20ml 制胶：14、分离胶的制备（pH 8.8）15、浓缩胶的制备（5%Acrylamide）。
Western blot 常用试剂配置
Western blot 常用试剂配置1.（1）10 X SDS 电泳缓冲液（储备）Tris-base（FW 121.1，0.25M）30.3gGlycine （FW 75.1,1.92M）144.0gSDS （1% ，w/v）10.0g （SDS有毒且分子量小，易飞，称量时动作要轻柔，并带口罩）加适量去离子水磁力搅拌下溶解（不调pH），定容至1000ml，棕色瓶室温储存可以用6个月。
（2） 1 X SDS 电泳缓冲液取10 x SDS 100ml，加蒸馏水定容至1000ml，混匀备用。
2.（1）10 x 转膜缓冲液（solarbio）不含SDS可自配，配方与10 x SDS 电泳缓冲液（储备）相似，不加SDS。
Tris-base（FW 121.1，0.25M）30.3gGlycine （FW 75.1,1.92M）144.0g加适量去离子水磁力搅拌下溶解（不调pH），定容至1000ml，棕色瓶4℃储存。
（2）1 x 转膜缓冲液：10 x 转膜缓冲液100ml ＋甲醇200ml 加DW （700ml）定容至1000ml。
（可重复使用1-2次，适当补充少量甲醇）3. 20 x TBS1 x TBS-T 配置：取20 x TBS 25ml，Tween-20 500ul，去离子水定容至500ml，混匀备用。
4℃储存。
4. 10% 过硫酸铵（Ammonium Persulfate，APS，FW228.2）配置APS 0.1g +DW 1ml，混匀，分装160ul 管，4℃保存一周。
（-20℃保存时间长）5.10%封闭液配置：脱脂奶粉2.5g，加1x TBS-T 25ml,磁力搅拌20-30分钟至完全溶解，4℃短期保存。
6. 5% BSA （贵）封闭液配置：BSA（淡黄色颗粒）4℃储存，2g，加TBS-T 40ml，磁力搅拌20-30min至完全溶解，4℃短期保存。
7.β-actin 配置，1:1500，分子量大约438. 叠氮钠，1:1000稀释一抗，延缓其腐败，稀释后4℃储存，一周内用完（一般用2-3次，膜最多用2次。
Westernblot试剂配制及操作步骤(最新整理)
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
western blot试剂配方
20％Tween20
1.65ml
TBS
700ml
混匀后即可使用，最好现用现配
（10）电转缓冲液
Tris（MW121.14）
3.03g
甘氨酸（MW75.07）
18.77g
SDS
1g
蒸馏水至
1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
4、样品
5、上样缓冲液、电转缓冲液、Fermentas、蛋白Maker
6、PVDF膜
7、脱脂奶粉
8、一抗
9、二抗
试剂配制：
（1）30%Acr/Bic(29：1)
丙烯酰胺（Acr）
29g
甲叉双丙烯酰胺（Bic）
1g
超纯水至
100ml
溶解后4℃保存，使用时恢复至室温且无沉淀。
（2）1.5mol/L Tris.Hcl(Ph=8.8)
（4）1.0mol/L Tris.Hcl
Tris (MW121.14)
30.29g
蒸馏水
200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
Ph
Hcl
7.4
约17ml
7.5
约16ml
7.6
约15ml
8.0
约10ml
（5）10%SDS
SDS
10g
蒸馏水至
5.8g*10
SDS
0.37g*10
甲醇
200ml*10
蒸馏水至
1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（8）TBS缓冲液
westernblotting试剂配制
westernblotting试剂配制Western Blot试剂配制Lower buffer（PH8.8）Tris base 18.15g⽤1mol/LHCl 调PH⾄8.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100mlUpper buffer （PH6.8）Tris base 12.1g⽤1mol/LHCl 调PH⾄6.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%SDS SDS 粉末10g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%AP(4℃保存)过硫酸铵固体0.1g1ml ddH2O30%Acr/Bic: 丙烯酰胺29g甲叉双丙烯酰胺1g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml5%脱脂奶粉（封闭液）脱脂奶粉5g加TBST完全溶解后定容⾄100ml5×电泳缓冲液 Tris Base 15.1g⽢氨酸94gSDS 5g加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×电泳缓冲液5×电泳缓冲液100ml400ml ddH2O1×转移缓冲液Tris 5.8g（半⼲转）⽢氨酸2.9gSDS 0.37g---可以少加甲醇200ml(有毒，最后加)----可以200-250之间，⽤途是固定作⽤加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×TBS缓冲液 TBS缓冲液粉末⼀包加ddH2O完全溶解后定容⾄2LTBST缓冲液500ml 1×TBS缓冲液250ul Tween20显影液⼤包5.2g⼩包0.6g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml定影液⼤包6.6g⼩包1.9g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml脱⾊液甲醇30mlddH2O60ml冰⼄酸10ml六楼(湿转技术) 10X转移缓冲液：Tris 30.26克⽢氨酸151克1000ml双蒸⽔湿转技术; 1X转移缓冲液：10X转移缓冲液100ml⽆⽔甲醇200ml 1000ml双蒸⽔SDS-PAGE蛋⽩电泳胶配制Reagents Separating GEL(12%) Stacking GEL(4%) Distilled water 3.2 ml 2.4mlLower buffer 2.6ml(1.5m PH8.8) ----Upper buffer10% SDS Acrylamide/Bis(30%) 10%Ap(fresh)TEMED----100ul4.0ml100ul5ul1ml(PH6.8)40ul0.536ml20ul4ulTotal 10ml 4ml注意：Acrylamide/Bis(30%)是调节配制胶的浓度，据柳鹏讲10ml体系中1.5mol PH8.8的Lower buffer固定在2.5ml，⽽Distilled water 和Acrylamide/Bis(30%)之和等于7.3ml。
配制Westernblot试剂配方
`配制Western-Blot 所用相关试剂1. 30%聚丙烯酰胺 100ml （RT or 4°C避光保存）29g丙烯酰胺1g bis-亚甲双丙烯酰胺2.10%SDS 100ml RT10g SDS→100ml ddH2O 加热搅拌溶解3.Buffers RT or 4°C1.5M Tris (pH: 8.8) 500ml (加Tris 90.855g)1.0M Tris (pH: 6.8) 250ml (加Tris 30.285g)4. 10% 过硫酸胺（APS） 4°C 避光保质期一周0.1g APS →1ml ddH2O5. Tris-Glycine (Running Buffer) 1L RT or 4°C5× 10× 1×ddH2O 800ml 800ml 800mlTris 15g 30g 3gGlycine 94g 188g 18.8g10％SDS 50ml 100ml 10ml(1g)加ddH2O→1000ml6. 10× Tris-Glycine for Transferring 1L RT or 4°CTris : 30.26gGlycine: 144.1gddH2O: 1L1× Transferring buffer10× Tris-Glycine 100ml (或 Tris:3.026g Glycine:14.41g) Methanol 200mlddH2O 700ml7. TBS (washing buffer) RT or 4°C ( pH 7.6)20× 10× 1×Tris 48.4g 24.2g 2.42gNaCl 160g 80g 8gddH2O 1000ml 1000ml 1000ml8. Buffer A: 用超纯水配制250ml储存在4°C冰箱中终浓度母液所需用量20 mM Hepes (pH 7.4) 1M（25ml：25*10-3*FW g） 5ml2 mM EDTA 0.5M（5ml：2.5*10-3*FW g） 1ml50 mM -glycerophosphate FW：306.12 3.8265g1 mM dithiothreitol 1M (已分装，存于—20冰箱最低层铝盒) 0.25ml1 mM Na3VO41M（2ml：0.368g） 0.25ml1% Triton, 20％（70ml） 12.5ml10% glycerol 25ml备注：dithiothreitol(DTT)已经配制为1M，并储存于－20°C冰箱Na3VO4（sodiium orthovanadate）, 原装粉剂RT保存，在李志华最左边的抽屉里β－glycerophosphate粉剂在4°C冰箱李志华层托盘中9．Protein inhibitors (fresh making)取1片溶解于2ml ddH2O, 并分装为200ul一支，－20°C保存。
Westernblot常用试剂配制
Westernblot常用试剂配制Western blot 常用试剂配制1.5 mol/L Tris (PH8.8)1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．用浓盐酸调节pH值至8.8。
4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的p H 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
（参照kara公司Catalog-N1）1 mol/L Tris (PH6.8)1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。
pH值浓HCl 6.87.4 约70 ml7.6 约60 ml8.0 约42 ml4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。
注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。
（参照kara公司Catalog-N1）30％丙稀酰胺（100ml）1．称量下列试剂置于烧杯中。
丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g双丙烯酰胺(BIS) 1 g2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．定容至100 ml, 用0.45 μm滤膜滤去杂质。
5．于棕色瓶中4 oC保存。
注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）30％SDS1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。
western blot 试剂配制
1 制胶材料（试剂配制）（1）浓缩胶缓冲液：称取 6 g Tris溶于40 mL双蒸水中，用l moL /L HCI调至pH 6.8，再加水稀释到100 mL的终体积，即成pH 6.8，0.5 moL/L tris-HCL缓冲液。
过滤后于4℃保存。
（2）分离胶缓冲液：称取36.6 g的Tris和48 mL l mol/L HCL混合，加水稀释至100 mL的终体积。
即成pH 8.8，3 moL/L tris-HCL缓冲液。
过滤后于4℃保存。
（3）5*SDS-PAGE缓冲液储液：称取15.1 g Tris（0.125M），94 g甘氨酸（1.25M），10 g SDS（0.5M），用蒸馏水溶解至800 mL，加水至1L，即成0.125 moL/L Tris-1.2 5 moL/L甘氨酸-0.5M SDS电泳缓冲储液，室温保存。
临用前稀释5倍。
（4）10% SDS溶液：称取l g SDS溶于10 mL双蒸水中，即成10% SDS溶液。
（5）10% 过硫酸胺：l mL双蒸水加入0.1 g过硫酸胺，宜当天配制，最多不超过一周。
（6）TEMED原溶液。
（7）(样品缓冲液)按下方配制：①pH 6.8，0.5 moL/L Tris-HCL缓冲液液8 mL；②甘油 6.4mL；③10% SDS溶液液12.8 mL；④二疏基乙醇3.2 mL；⑤0.05% 溴酚蓝1.6mL；⑥蒸馏水32 mL，混匀备用。
（8）转膜缓冲液：3 g Tris碱、1g SDS和14.48 g甘氨酸，再加200 mL甲醇，补充蒸馏水定容至1 L。
（9）封闭缓冲液：含5%脱脂奶粉、0.025% NaN3溶于TBS-T缓冲液。
（10）5×TBS缓冲液：12.1 g Tris碱，40 g NaCL溶于双蒸水中，用浓HCL调H 值至7.6后，用双蒸水定容至1 L。
（11）TBS-T漂洗液：含0.1% Tween-20的TBS。
（12）30%丙烯酞胺溶液：称取30g丙烯酞胺，溶解于100 mL双蒸水中, 即成30%丙烯酞胺溶液。
Western blot 试剂配制及操作流程
Western-Blot操作流程试剂配制1.RIPA裂解液：10mM Tris（，）1%NP40%TritonX-100%脱氧胆酸钠2 mM EDTA1 mM PMSF20%甘油调pH值至。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。
使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
制胶用（1-6）：1.L Tris·HCl （）Tris 12.114g蒸馏水 100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至），室温下保存。
2.L Tris·HCl（）Tris 18.671g蒸馏水 100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至），室温下保存。
3.10％SDSSDS 10g蒸馏水至 100ml如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
4.10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺蒸馏水 1ml（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。
6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。
10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水30%丙烯酰胺 5ml1.5M Tris-HCl（）10%SDS 150μl10%AP 150μlTEMED 6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
灌胶后加异丙醇（1ml）消泡5%上层胶（两块胶，6ml）：依次加入去离子水30%丙烯酰胺 1ml1M Tris-HCl（）10%SDS 60μl10%AP 60μlTEMED 6μl每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。
7．5X电泳液缓冲液Tris（） 15.1g甘氨酸（） 94gSDS 5.00g蒸馏水至 1000ml溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。
Western blotting试剂配制
非离子表面活性剂T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。
30% Triton X-100的配制：试剂：Triton X-100 28.2ml0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4) 72.8ml配制方法：取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。
用前取该储备液稀释至所需浓度。
Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。
它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。
1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，配制BSA等。
名称：1.0mol/L Tris·HCl成分：Tris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200mlPH值：溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），体积：最后用蒸馏水定容至250ml，保存：高温灭菌后室温下保存。
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
10％SDSSDS 10g蒸馏水至100ml50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
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Western blot 常用试剂配制
1.5 mol/L Tris (PH8.8)
1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．用浓盐酸调节pH值至8.8。
4．定容至1L.
5．高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的p H值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
（参照kara公司Catalog-N1）
1 mol/L Tris (PH6.8)
1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。
pH值浓HCl 6.8
7.4 约70 ml
7.6 约60 ml
8.0 约42 ml
4．定容至1L.
5．高压灭菌后，室温保存。
注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH
值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。
（参照kara公司Catalog-N1）
30％丙稀酰胺（100ml）
1．称量下列试剂置于烧杯中。
丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g
双丙烯酰胺(BIS) 1 g
2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．定容至100 ml, 用0.45 µm滤膜滤去杂质。
5．于棕色瓶中4 oC保存。
注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
30％SDS
1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。
3．滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。
4．定容至100 ml，室温保存。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
10％过硫酸铵
1．称量1 g过硫酸铵。
2．加入约10 ml去离子水后搅拌溶解。
3．储存于4oC。
注意：10％过硫酸铵溶液在4oC保存时可使用两周左右，超过期限会失去催化作用。
（参照Takara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
1×SDS凝胶加样缓冲液
50 mmol/L Tris•Cl (pH 6.8)
100 mmol/L DTT
2% SDS （电泳级）
0.1% 溴酚蓝
10% 甘油
不含DTT的1×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前必须从1 mol/L DTT储存液中现用现加于上述缓冲液中。
（参照《分子克隆》二版P884）
本人将参照此配方，配成5×或6×，各成分浓度均扩大5倍。
另:Takara公司Catalog-N5上的5×SDS－PAGE Loading Buffer配方：
组分浓度：
250 mmol/L Tris•Cl (pH 6.8)
10% (W/V) SDS （电泳级）
0.5% (W/V) 溴酚蓝（BPB）
50% (V/V) 甘油
5% (W/V) β-巯基乙醇（2-ME）
配制量 5 ml
配制方法
1．称量下列试剂置于10ml 塑料离心管中。
1 M Tris•Cl (pH 6.8) 1.25 ml
SDS （电泳级） 0.5 g
溴酚蓝（BPB） 25 mg
甘油 2.5 ml
2．加去离子水溶解后定容至5 ml。
3．小份（500 ul/份）分装后于室温保存。
4．使用前将25 ul的2-ME加到每小份中。
5．加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。
1 mol/L DTT (20 ml)
1．称取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料离心管中。
2．加20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2)，溶解后使用0.22μm 滤器过滤除菌。
3．分装后－20oC保存。
（参照《分子克隆》二版P884）
3 M 醋酸钠（NaOAc）（100 ml）
1．称取40.8 g NaOAc•3H2O置于100～200ml烧杯中，加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。
2．加冰醋酸调节pH值至5.2。
3．定容至100 ml，高压灭菌后室温保存。
（参照《分子克隆》二版P884）
0.01 M NaOAc (pH5.2) 参照此配方配制。
5×Tris-Glycine Buffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）
组分浓度：0.125 M Tris, 1.25 M Glycine, 0.5%(W/V) SDS 1．称量下列试剂置于烧杯中。
Tris 15.1 g
Glycine 94 g
10%(W/V) SDS（电泳级） 50 ml
2．加入约900 ml去离子水搅拌溶解。
3．定容至1L，室温保存。