Western blot 常用试剂配制
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Western blot 常用试剂配制
1.5 mol/L Tris (PH8.8)
1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．用浓盐酸调节pH值至8.8。
4．定容至1L.
5．高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的p H值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。（参照kara公司Catalog-N1）
1 mol/L Tris (PH6.8)
1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。
pH值浓HCl 6.8
7.4 约70 ml
7.6 约60 ml
8.0 约42 ml
4．定容至1L.
5．高压灭菌后，室温保存。
注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH
值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。
（参照kara公司Catalog-N1）
30％丙稀酰胺（100ml）
1．称量下列试剂置于烧杯中。
丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g
双丙烯酰胺(BIS) 1 g
2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．定容至100 ml, 用0.45 µm滤膜滤去杂质。
5．于棕色瓶中4 oC保存。
注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
30％SDS
1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。
3．滴加数滴浓盐酸调节pH值至7.2。
4．定容至100 ml，室温保存。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
10％过硫酸铵
1．称量1 g过硫酸铵。
2．加入约10 ml去离子水后搅拌溶解。
3．储存于4oC。
注意：10％过硫酸铵溶液在4oC保存时可使用两周左右，超过期限会失去催化作用。
（参照Takara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）
1×SDS凝胶加样缓冲液
50 mmol/L Tris•Cl (pH 6.8)
100 mmol/L DTT
2% SDS （电泳级）
0.1% 溴酚蓝
10% 甘油
不含DTT的1×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前必须从1 mol/L DTT储存液中现用现加于上述缓冲液中。
（参照《分子克隆》二版P884）
本人将参照此配方，配成5×或6×，各成分浓度均扩大5倍。
另:Takara公司Catalog-N5上的5×SDS－PAGE Loading Buffer配方：
组分浓度：
250 mmol/L Tris•Cl (pH 6.8)
10% (W/V) SDS （电泳级）
0.5% (W/V) 溴酚蓝（BPB）
50% (V/V) 甘油
5% (W/V) β-巯基乙醇（2-ME）
配制量 5 ml
配制方法
1．称量下列试剂置于10ml 塑料离心管中。
1 M Tris•Cl (pH 6.8) 1.25 ml
SDS （电泳级） 0.5 g
溴酚蓝（BPB） 25 mg
甘油 2.5 ml
2．加去离子水溶解后定容至5 ml。
3．小份（500 ul/份）分装后于室温保存。
4．使用前将25 ul的2-ME加到每小份中。
5．加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。
1 mol/L DTT (20 ml)
1．称取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料离心管中。
2．加20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2)，溶解后使用0.22μm 滤器过滤除菌。
3．分装后－20oC保存。
（参照《分子克隆》二版P884）
3 M 醋酸钠（NaOAc）（100 ml）
1．称取40.8 g NaOAc•3H2O置于100～200ml烧杯中，加入约40ml的去离子水后搅拌溶解。
2．加冰醋酸调节pH值至5.2。
3．定容至100 ml，高压灭菌后室温保存。
（参照《分子克隆》二版P884）
0.01 M NaOAc (pH5.2) 参照此配方配制。
5×Tris-Glycine Buffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）
组分浓度：0.125 M Tris, 1.25 M Glycine, 0.5%(W/V) SDS 1．称量下列试剂置于烧杯中。
Tris 15.1 g
Glycine 94 g
10%(W/V) SDS（电泳级） 50 ml
2．加入约900 ml去离子水搅拌溶解。3．定容至1L，室温保存。