流式常用试剂配制

一、流式细胞术常用试剂

1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。

2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10％的NaN3。

3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA•Na2•2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。

4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4，使用前新鲜配制。

5、消化液：0.25％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的混合液。

6、红细胞裂解液：NH4Cl 4.16g，KHCO3 0.5g，EDTA•2Na 0.02g，溶于100ml水中，调PH 至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。

7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3。

8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH 7.4）＋1％FBS（或BSA）＋0.1％NaN3＋0.1％saponin（Sigma 的效果不错）。

9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。

10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。应用时，10倍稀释，每管加0.3ml～0.5ml PI染液。

11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）

原液A

NaCl 160g

MgSO4•7H2O 2g

KCl 8g

MgCl•6H2O 2g

CaCl2 2.8g

溶于1000ml双蒸水

原液B

1）Na2HPO4•12H2O 3.04g

KH2PO4 1.2g

葡萄糖20.0g

溶于800ml双蒸水

2）0.4％酚红溶液：取酚红0.4g置玻璃研钵中，逐滴加入0.1N NaOH并研磨，直至完全溶

解，约加入0.1N NaOH 10ml。将溶解的酚红吸入100ml量瓶中，用双蒸水洗下研钵中残留的酚红液，并入量瓶中，最后补加双蒸水至100ml。

将1）液和2）液混合，补加双蒸水至1000ml即为原液B。

应用液：

原液A 1份

原液B 1份

双蒸水18份

混合后，分装于200ml小瓶中，高压灭菌。临用前用无菌的5.6％NaHCO3调PH至7.2～7.6。

12、磷酸盐缓冲液的配制（PB）

A液（0.2mol/L NaH2PO4水溶液）：

NaH2PO4•H2O 27.6g，溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。

B液（0.2mol/L Na2HPO4水溶液）：

Na2HPO4•7H2O 53.6g 加蒸馏水溶解，加水至1000ml。

不同PH值PB的配制：

A液xml（参照下表）中，加入B液yml，为0.2mol/L的PB。若再加蒸馏水至200ml，则成0.1mol/L PB。

PH x/ml y/ml

5.7 93.5

6.5

5.8 92.0 8.0

5.9 90.0 10.0

6.0 8

7.7 12.3

6.1 85.0 15.0

6.2 81.5 18.5

6.3 7

7.5 22.5

6.4 73.5 26.5

6.5 68.5 31.5

6.6 62.5 3

7.5

6.7 56.5 43.5

6.8 51.0 49.0

6.9 45.0 55.0

7.0 39.0 61.0

7.1 33.0 67.0

7.2 28.0 72.0

7.3 23.0 77.0

7.4 19.0 81.0

7.5 16.0 84.0

7.6 13.0 87.0

7.7 10.0 90.0

7.8 8.50 91.0

7.9 7.00 93.0

8.0 5.30 94.7

13、PBS的配制

配制PBS，只要在相应的PB基液中加入8.5g/L NaCl即可。

二、常用激活剂

1、激活剂PMA：用DMSO配制成0.1mg/ml，分装20ul/管，－20度保存。勿反复融冻。实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液，终浓度为20ng/ml。

2、激活剂离子霉素：用乙醇配制成浓度为0.5mg/ml的储存液，－20度保存。实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液，终浓度为1ug/ml。

3、Staphylococcal enterotoxin B(SEB) ：用无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL，4℃储存，SEB终浓度10ug/mL。

4、CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞。

5、CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml。

6、阻断剂Bregeldin A：用DMSO配制成浓度为5mg/ml的储存液，分装20ul/管，－20度保存。勿反复融冻。实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液，在激活过程最后4～5小时使用BFA，终浓度为10ug/ml。

7、阻断剂莫能菌素：用DMSO配制成浓度为1mg/ml的储存液，4℃储存至少4个月，实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液，终浓度为2umol/L。

三、常用抗体标记荧光染料的特性及其应用

1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；

2）在流式细胞仪的FL1通道检测；

3）可用于荧光显微镜技术

4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。

2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；

2）在流式细胞仪的FL1通道检测；

3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术；

4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。

3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；

2）在流式细胞仪的FL2通道检测；