流式常用试剂配制

流式常用试剂配制

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一、流式细胞术常用试剂ﻫ

１、1０％NａN3：将１0gNaＮ３溶解于100ml蒸馏水中,室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。

ﻫ2、3%BSA／PBS:１00ml PBS中加入３g BＳA，使之溶解，再加入0.２mｌ10%的NaN3。ﻫ

3、5００mmol／ＬEＤＴＡ:将186g EDＴA•Na2•2H2O溶解于40０ml蒸馏水中,用NaＯＨ

4、4%多聚甲醛:在磁将PＨ调至8.０，补充蒸馏水至500ｍｌ,分装,高压灭菌,室温保存。ﻫﻫ

力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴ＮａOH,在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4,使用前新鲜配制。

ﻫ5、消化液:0．２5%胰蛋白酶（用培养液或ＰBS配制)或0.25%胰蛋白酶与0.02％EDTＡ的混合液。6ﻫﻫ、红细胞裂解液:NH4Cl4．１6g,KHＣＯ3 0.5ｇ,EDTA•2Nａ0．02g，溶于10０ml水中，调PH至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。ﻫ

7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（ＰH 7.4)+１%BSA＋0.1％Na2N３。

ﻫ8、常用细胞破膜剂：PBS液(PH 7.4)＋1%FBＳ（或ＢSA)+0．１％ＮａN3+0．1％sapoｎi

9、流式细胞染色洗涤液:含2%的BＳA、0.１％ＮaN3的PＢＳｎ(Siｇｍa的效果不错)。ﻫﻫ

（PH 7.４)。

ﻫ1０、PＩ染液(保存液，10×,用于细胞周期和凋亡检测):10mｇPI溶于10ml PBS，加入2mg 无DＮＡ酶的RＮA酶，4度保存备用。应用时，10倍稀释，每管加０.３ml~０.5mlＰI 染液。

ﻫ1１、Hanks液的配制（ＢＳS,主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液,不能单独作为细胞、组织培养液)ﻫ原液AﻫＮaCl 1６０gﻫMgSO４•７Ｈ2Ｏ2g

KCｌ8ｇﻫMgCl•6H2O 2g

ＣaCl2 2．８ｇﻫ溶于１00０ml双蒸水ﻫ原液B1ﻫ)Na2ＨPO4•1２H2O 3.0４g

KH2PO4 1.2ｇﻫ葡萄糖2０．0ｇ

溶于800ｍｌ双蒸水

2）0.4％酚红溶液:取酚红0．４g置玻璃研钵中,逐滴加入0.1ＮNaOH并研磨,直至完全溶解,约加入0.1NＮaOH 10mｌ。将溶解的酚红吸入１00ｍl量瓶中,用双蒸水洗下研钵中残留的酚红液，并入量瓶中,最后补加双蒸水至100ｍl。

将1）液和2)液混合,补加双蒸水至1000ｍｌ即为原液B。

应用液：ﻫ原液A １份

原液B1份ﻫ双蒸水18份

混合后，分装于２00ｍl小瓶中，高压灭菌。临用前用无菌的５.６%NaHCＯ3调PH至7.2～

12、磷酸盐缓冲液的配制（ＰＢ)

7.6。ﻫﻫ

A液(0.2mｏｌ／L NａＨ2PO4水溶液):

ＮaH２PO4•Ｈ2Ｏ27.6g，溶于蒸馏水中,稀释至10０0mｌ。

B液（0.2mol/ＬNa2ＨＰO4水溶液）:

Na2ＨＰＯ4•7Ｈ2O ５3.6g加蒸馏水溶解,加水至１000ｍｌ。

不同PＨ值ＰB的配制：

A液ｘml（参照下表)中,加入Ｂ液ｙml，为0.2mｏｌ/L的PB。若再加蒸馏水至20０mｌ,则成0.１mｏｌ／ＬPＢ。

PＨx/ml y/ml

12．3

8

7.7

6.0

5．793．5 6.5ﻫ5.８92．０8.0ﻫ5.９９0．0１０．0ﻫ

6.１８5.0１５.0

６．2 8１.５1８．5ﻫ

77.5２2.5

6.3

6.4 7３.５２6.５

6．5 68.５3１.5ﻫ６.6 62.5 37．5ﻫ６．7 ５6.5 ４3．5

6.８5１.0 49.0ﻫ6.９４5.0５5.0

7.0 3９.0 61．0ﻫ7.１3３.06７.０

７.２2８.0 ７2.0ﻫ７.3 ２3.０７７．0

7.613.０87．0ﻫ7.７１0.0 9０.0

7．4 19.０81．０ﻫ7．５16.0 8４.０ﻫ

7.8 8.5０9１.0

7．9 ７．0０93.０

13、PBS的配制

8.0 5.3094．7 ﻫﻫ

配制PBS,只要在相应的PB基液中加入8.5g／L NaＣl即可。

ﻫ二、常用激活剂ﻫﻫ

1、激活剂ＰMＡ：用DMSO配制成0.1mｇ/ml,分装20ul／管,－２0度保存。勿反复融冻。实验时用无菌、无叠氮钠PBＳ１:100稀释储存液,终浓度为２0ng/m

2、激活剂离子霉素：用乙醇配制成浓度为０.5mg／ml的储存液，-2０度保存。实验ｌ。ﻫﻫ

时用无菌、无叠氮钠PＢS１:１0稀释储存液，终浓度为1ug/ml。ﻫ

３、Ｓｔaphylｏcoｃcａl ｅnteｒotoxiｎB（SＥB) ：用无菌无叠氮钠PBＳ调节浓度0.5mg/mL，4℃储存,ＳEB终浓度10ug／mL。

4、CD3：包被在培养板中,在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞。

5、CD28:加速不同刺激剂(包括ＳEB、CD3等)的活化效应，浓度一般为10uｇ/ml。

ﻫ６、阻断剂Bregeldｉn A:用DＭSO配制成浓度为5mg/ml的储存液，分装20ul/管,－20度保存。勿反复融冻。实验时用无菌、无叠氮钠ＰＢS １:1０稀释储存液，在激活过程最后

7、阻断剂莫能菌素：用DMSO配制成浓度为4~5小时使用BFA,终浓度为１０ｕｇ/ml。ﻫﻫ

1mg/ml的储存液,４℃储存至少4个月,实验时用无菌、无叠氮钠ＰBS 1：10稀释储存液,终浓度为2umol/L。

三、常用抗体标记荧光染料的特性及其应用

ﻫ1、FITＣ：激发波长4８8ｎｍ,最大发射波长525nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备４88nｍ氩离子激光器的流式细胞仪;

2)在流式细胞仪的ＦL１通道检测；

3)可用于荧光显微镜技术

4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。

２、Ａleｘa Fｌuoｒ４８8：激发波长488ｎm，最大发射波长519ｎm。ﻫ1）其标记的抗体适用于所有配备４88nm氩离子激光器的流式细胞仪;ﻫ２)在流式细胞仪的ＦL１通道检测；

3)具有超乎寻常的光稳定性,非常适用于荧光显微镜技术；

４)在较宽的PＨ值范围内保持稳定（ＰH4~10)。ﻫﻫ３、Ｃy3:激发波长48８nm，最大发射波长５70nm。

1）其标记的抗体适用于所有配备４８8ｎｍ氩离子激光器的流式细胞仪；

２)在流式细胞仪的ＦL2通道检测;