western blot 相关试剂及步骤

Western Blot蛋白测定步骤
三蒸水制备后需要高压消毒
一、组织的采集
（一）器材和试剂准备：
镊子、眼科剪、70%乙醇（三蒸水配制）、1.5mL离心管、液氮
（二）步骤（以心脏为例）:
1、脱颈椎处死小鼠，读取小鼠编号
2、乙醇消毒胸部，剪开胸腔，剪下心脏（一颗心脏约100mg），排除血液，放入离心管，投入液氮中
3、组织于-80摄氏度冻存
二、组织蛋白的提取：
（一）器材和试剂准备：
4mL离心管、15mL管、研磨机、镊子、冰盒、离心机、RIPA蛋白裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay，详见下载的网页）（碧云天公司）、PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟，详见下载的网页prod号36978，Thermo Scientific）、70%乙醇、三蒸水
（二）步骤
1、准备好三管10mL70%乙醇、一管三蒸水；取出RIPA和PMSF解冻
2、按照1mLPIRA ：10uLPMSF ：100mg组织的比例，加试剂和组织于4mL离心管
3、按照三管10mL70%乙醇、一管三蒸水的顺序依次洗涤研磨钻头（每管5秒），再研磨组织，上下且圆周运动离心管。

每管研磨的转速和时间保持一致。

当出现大量泡沫时即可停止
4、静置于冰盒30分钟
5、12000rpm，4摄氏度，30分钟
6、先取100uL上清于离心管，再取300uL上清于离心管。

前者用于测试，后者备用。

-80摄氏度冻存。

注意：购置的RIPA不宜反复冻融，需分装-80摄氏度保存；PMSF为晶体状，购置后按照说明书溶于异丙醇，分装-80摄氏度保存
三、蛋白上样量定量
采用BCA法测蛋白（BCA protein assay kit，Prod号23225，详见下载的网页，Thermo Scientific）：
（一）器材和试剂准备：
1.5mL离心管、BCA测试试剂盒、提蛋白剩余的RIPA蛋白裂解液
（二）步骤
1、详见BCA Protein Assay Kit.pdf 使用说明书，配制溶液，制作标准曲线，测定蛋白浓度。

（加好各试剂，混合于37摄氏度放置30分钟）
2、使用Amersham Biosciences GeneQuant Pro分光光度计的562nm测试，读数三次，取平均值（ug/mL）
四、SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制（各浓度的配制见配方表）
SDS-PAGE试剂配制
1） 30%丙烯酰胺溶液：
丙烯酰胺（Acrylamide） 29.0g
亚甲双丙烯酰胺（Bis-Acrylamide） 1.0g
dddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于4℃。

2) 分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris-Hcl ( PH 8.8）
Tris 18.15g
1mol/L HCL 调节PH（可以使用分析纯级别的浓盐酸，下同）
dddH2O 定容至100mL，4℃保存
3) 浓缩胶缓冲液1.0mol/L Tris-Hcl (PH 6. 8）：
Tris 12.1g
1mol/L HCL 调节PH
dddH2O 定容至100mL，4℃保存
4) 10% SDS溶液：
SDS 10.0g
dddH2O定容至100ml，室温保存
5） 10%过硫酸铵（AP）：
过硫酸铵 0.1g
dddH2O定容至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制6）TEMED 遮光保存，分装于EP管冻存
五、电泳
（一）器材和试剂准备：
电泳仪、电磁锅、浮板、离心机、1.5mL离心管、Marker、5×上样缓冲液（loading buffer）、生理盐水、电泳液
5×SDS-PAGE Loading Buffer配制方法（20mL体系总体积）：
DTT（DL-Dithiothreitol，二硫苏糖醇）（0.1M） 1.54g
SDS（sodium dodecyl sulfate） 2.0g
1M Tris-CL（pH6.8） 8.0mL
溶解后加入10mL甘油及少量溴酚蓝定容至20mL
（二）步骤
1、电泳上样体系总25uL（即每孔加25uL）：（下表的列表示凝胶孔一个孔所加的试剂）
Marker管（泳道）蛋白样品管（泳道）空白管（泳道）
蛋白无？无
5×loading buffer 5uL 5uL 5uL
Marker 7uL 无无
生理盐水13uL 补齐至25uL 20uL
体系总体积25uL 25uL 25uL
Marker条带依次是170、130、95、72（red）、55、43、34、26、17、10（green）KD 大小的梯度。

蛋白样品管的上样量的计算：40ug（这个值不一定的，可以根据算出的体积来改变。

比如超过20uL则需要减少上样量。

而且如果内参不齐时也需要调整）除以依据分光光度计的读数算出的蛋白浓度ug/mL（根据说明书蛋白以1：20被稀释），再转换成uL的单位。

空白管的设置是因为，当蛋白样品少于9个样品时，空出的孔需要加入物质，以免蛋白跑偏。

2、根据上表加好各试剂后，于270摄氏度水浴5分钟，离心，再上样，倒入电泳液
3、上层胶80V跑，下层胶120V跑（一般至少1个半小时）
六、转膜
（一）器材和试剂准备：
电转仪、电转液、冰块
（二）步骤
1、准备夹板、滤纸、NC膜（浸泡于电转液）
2、取出凝胶切下蛋白和marker所在的凝胶，制成由下到上依次是：滤纸、凝胶、NC膜、滤纸的夹板。

放置各层时注意要加电转液湿润并排出气泡，以免干扰电转效果。

3.放入电转仪，加入冰块和电转液，300mA恒流电转1小时。

七、封闭
（一）器材和试剂准备：
丽春红染料、脱脂牛奶、TBST、塑料盒、镊子、剪刀、摇床
（二）步骤
1、取出夹板，用镊子夹出NC膜置于丽春红染料中3-5分钟
2、取出NC膜可以观察一下条带是否均匀、有无跑偏，用剪刀剪去周围空白，并在左下角剪一斜角。

用蒸馏水洗去丽春染料。

3.TBST配置5%脱脂牛奶，放入NC膜于摇床上慢摇1小时
八、一抗孵育
（一）器材和试剂准备：
塑料膜、封塑机、一抗、TBST
（二）步骤
1、根据NC膜的大小剪出一张双层的塑料膜，取出NC膜置于塑料膜中，封闭塑料膜的三边，制成一个袋子
2、按照一定比例稀释一抗后，加入塑料膜袋，排气泡，封闭塑料膜开口
3、NC膜正面朝下，放置于慢摇的摇床30分钟，再放入4摄氏度的慢摇摇床过夜
九、二抗孵育
（一）器材和试剂准备：
二抗、TBST、剪刀、摇床
（二）步骤
1、取出NC膜于常温慢摇的摇床30分钟，剪开塑料膜，用TBST洗涤3次
每次10分钟（调节摇床至快摇）
2、按照说明书准备二抗的稀释液，一种是目的蛋白的，一种是内参的。

3、洗完NC膜后，将膜剪开，分别放入目的蛋白和内参的二抗稀释液，于慢摇的摇床孵育1小时。

十、显色曝光（采用辣根过氧化物酶HRP_ECL发光法）
（一）器材和试剂准备：
Western Blotting Luminol Reagent测试剂盒（SANTA CRUZ BITECHNOLOGY Int.,sc-2048）、片盒、柯达x-omat Bt医用x射线胶片（型号:xbt-1 规格(cm):12.7x17.8cm）、Kodak X-OMAT 2000 PROCESSOR（洗片机）
（二）步骤
1、取出NC膜用TBST洗涤3次，每次10分钟（调节摇床至快摇）
2、用TBS润洗NC膜，放入有保鲜膜的片盒中
3、将A、B发光液1：1比例混合，加入NC膜，盖上保鲜膜和片盒的盖子
4、到暗室，打开片盒擦去保鲜膜周边的发光液，放入胶片盖上片盒盖子，分别压10秒、30秒、1分钟，胶片放入洗片机
5、取出胶片后对着NC膜标上marker的位置
丽春红染液
丽春红 5g
冰醋酸 1mL
dH2O 定容至100mL
Western blot中三种溶液的配制：
电泳液：
10×储备液（pH 8.3）：Tris 30.3g 1×工作液：10×储备液100mL 甘氨酸144g H2O 900mL
SDS 10g
H2O定容至1L
电转液：
10×储备液：Tris 30.3g 1×工作液：10×储备液100mL 甘氨酸144g H2O 700mL
H2O定容至1L 甲醇200mL
TBST:
10×储备液：Tris 24.2g 1×工作液：10×储备液100mL NaCL 87.6g H2O 900mL
调节pH到7.6（1L约加8mLHCL）Tween-20 1mL
H2O定容至1L
TBS：不加Tween-20。