Western Blot试剂配方
Western blot试剂配方
SDS-PAGE相关试剂、缓冲液的配置方法1.5M Tris-HCl 组分浓度：1.5M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 36.33g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=8.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 24.22g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=6.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 24.22g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=7.5(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存10%SDS （W/V）组份浓度：10%（W/V）SDS配置量：200ml配制方法： 1.称取2g SDS。
2.加入200ml的去离子水后搅拌溶解。
注意：溶解定容SDS时不宜剧烈摇晃，避免产生过多的泡沫；10%SDS溶液在低温是易析出晶体，可以置于70℃溶解。
30%（W/V）丙烯酰胺组份浓度：30%（W/V）Acrylamide配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于1L烧杯中。
丙烯酰胺58gN-N亚甲基双丙烯酰胺2g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定容至200ml，用定性滤纸滤去杂质。
4.于棕色瓶中4℃保存。
注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成份。
10%APS （W/V）组份浓度：10%（W/V）过硫酸铵配置量：1ml配制方法： 1.称取0.1g过硫酸铵。
western blot各种液体配制
一、所需试剂的配制1、丙烯酰胺贮存液（30%Acr/Bic）丙烯酰胺（Acr）29.2gN，N-甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g超纯水至100ml37度溶解，4度避光保存一个月，使用时恢复至室温且无沉淀。
2、分离胶缓冲液（4×）（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：Tris（MW121.14）18.15g超纯水90ml用HCl调pH值至8.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
3、浓缩胶缓冲液（4×）（1.0mol/L Tris-HCl，pH6.8）:Tris（MW121.14）12.1g超纯水90ml用HCl调pH值至6.8，最后用超纯水定容至100ml，4度保存。
4、10%十二烷基硫酸钠（SDS）SDS 10g蒸馏水至100ml50度水浴溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶解后仍可使用。
5、10%过硫酸铵（Aps）Aps 0.1g超纯水1ml溶解后4度避光保存，保存时间为一周，现用现配，也可-20度保存6、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）：避光保存。
7、2×上样缓冲液（2×Loading Buffer）：1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.8ml10%SDS（电泳级）2ml溴酚蓝0.5mg甘油0.8ml2-巯基乙醇0.2ml蒸馏水 1.2ml总量为5ml，可在4度存放数周，-20存放数月。
（其中2-巯基乙醇可保护二硫键，并使蛋白下沉用利于电泳的进行。
）8、电泳缓冲液（pH8.3）Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4gSDS 1g或10%SDS 10ml蒸馏水至1L无需调pH值（8.2~8.3），可在4度存放数周，次溶液可重复使用3~5次。
9、转移缓冲液：Tris 3.03g甘氨酸（Gly）14.4g甲醇200ml蒸馏水至1L先用蒸馏水溶解甘氨酸和Tris，然后再加入甲醇，最后补足液体。
无需调pH值（8.1~8.4），可在4度存放数周。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Western Blot试剂配方
1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr) 29.0g，亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1.0g，混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。
2. 4×分离胶缓冲液(1mol/L Tris-HCl PH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。
3. 4×浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8) ：Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。
4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。
5. 5×电泳缓冲液(PH 8.3)：Tris 15.2g 甘氨酸94g ddH2O 定容到1000ml SDS 5g 先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。
6. 10%过硫酸铵(AP)：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。
7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液，0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2ml，10%SDS 4 ml，β-巯基乙醇1ml，甘油2ml，1%溴芬蓝1ml，置4℃避光保存8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即1×SDS-Page10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：NaCl 8.5g，(12H2O)Na2HPO4 2.9011g，(2H2O)NH2PO4 0.24g，加ddH2O定容至1000ml11. 封闭液: 1×PBS中加入30ml，5%(V/V)脱脂奶粉1.5g，0.02%叠氮钠0.006g，0.05% Tween-20 0.015g12. 漂洗液(PBST)：含0.05% Tween-20的PBS溶液每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-2013. 水饱和正丁醇：正丁醇50 ml，ddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。
western-blot 通用配方
1.Western Blotting 相关溶液及抗体1)转膜缓冲液（running buffer）(10×)(1L)Tris 30.3g甘氨酸144g不调pH转膜工作液（1×)(1L)（现配现用）(10×)转膜缓冲液（running buffer）100ml无水乙醇100ml水800ml2)TBS 缓冲液(5×)（1L）Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-20 0.1%（1ml for 1L）3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine)4）Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5）Western Blotting 第二抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE 电泳分离蛋白质：(浓缩胶70V，30-40min；分离胶120V，1h)5×loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油1ml 10%（w/v）SDS 0.8mlß-巯基乙醇0.2ml（2）将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1×)转膜工作液(10×)转膜缓冲液（running buffer）80ml无水乙醇80ml水640ml800ml（4）将胶泡在（1×)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1×)转膜工作液中。
（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7）将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干)：白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜（靠正极）--胶（靠负极）（用小试管排气泡）--两层滤纸—海绵（用小试管排气泡）--夹住—放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）--在胶槽中加入转子—倒入（1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V～100V 恒压，60min(该条件可以转移25kD～90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4℃静置过夜。
常用western blot 试剂配方
Western blot常用试剂配方1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml）丙烯酰胺29 g双丙烯酰胺1g加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。
2. 10% SDS：（10ml）电泳级SDS 1 g蒸馏水9 ml初始PH约为7.85，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至7.2，定容至10ml。
3.TEMED（四甲基乙二胺）（成品）4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH 8.8）：50mlTris-base 9.085 g蒸馏水45 ml加浓盐酸（约0.4ml）调PH至8.8后定容至50ml，4℃保存。
5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH6.8）：50mlTris-base 6.055 g蒸馏水44 ml加3.5ml浓盐酸调PH至6.8后定容至50ml，4℃保存。
6. 10%过硫酸铵（10% AP）：0.5ml 新鲜配制称取0.05g AP于1.5ml EP管中，储存于-20℃，用时溶于0.5ml蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50mlupper buffer 0.312 ml 15.6ml甘油（丙三醇）0.5 ml 25mlSDS 0.1 g 5gDTT 0.0385 g溴酚蓝0.005g 0.25g加蒸馏水溶解后定容至1ml。
取0.2ml加0.8ml蒸馏水配成工作液。
8. 5 × running buffer：（1000ml）Tris-base 15.1 g甘氨酸（Glycine）94 gSDS 5 g加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
用时加4000 ml蒸馏水。
9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用）甲醇30 ml冰乙酸10 ml蒸馏水60 ml考马斯亮-250 0.05 g10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配乙酸（10%）50ml甲醇（30%）150ml加蒸馏水定容至500ml。
Westernblot试剂配制及操作步骤(最新整理)
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
westernblotting试剂配制
westernblotting试剂配制Western Blot试剂配制Lower buffer（PH8.8）Tris base 18.15g⽤1mol/LHCl 调PH⾄8.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100mlUpper buffer （PH6.8）Tris base 12.1g⽤1mol/LHCl 调PH⾄6.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%SDS SDS 粉末10g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%AP(4℃保存)过硫酸铵固体0.1g1ml ddH2O30%Acr/Bic: 丙烯酰胺29g甲叉双丙烯酰胺1g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml5%脱脂奶粉（封闭液）脱脂奶粉5g加TBST完全溶解后定容⾄100ml5×电泳缓冲液 Tris Base 15.1g⽢氨酸94gSDS 5g加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×电泳缓冲液5×电泳缓冲液100ml400ml ddH2O1×转移缓冲液Tris 5.8g（半⼲转）⽢氨酸2.9gSDS 0.37g---可以少加甲醇200ml(有毒，最后加)----可以200-250之间，⽤途是固定作⽤加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×TBS缓冲液 TBS缓冲液粉末⼀包加ddH2O完全溶解后定容⾄2LTBST缓冲液500ml 1×TBS缓冲液250ul Tween20显影液⼤包5.2g⼩包0.6g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml定影液⼤包6.6g⼩包1.9g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml脱⾊液甲醇30mlddH2O60ml冰⼄酸10ml六楼(湿转技术) 10X转移缓冲液：Tris 30.26克⽢氨酸151克1000ml双蒸⽔湿转技术; 1X转移缓冲液：10X转移缓冲液100ml⽆⽔甲醇200ml 1000ml双蒸⽔SDS-PAGE蛋⽩电泳胶配制Reagents Separating GEL(12%) Stacking GEL(4%) Distilled water 3.2 ml 2.4mlLower buffer 2.6ml(1.5m PH8.8) ----Upper buffer10% SDS Acrylamide/Bis(30%) 10%Ap(fresh)TEMED----100ul4.0ml100ul5ul1ml(PH6.8)40ul0.536ml20ul4ulTotal 10ml 4ml注意：Acrylamide/Bis(30%)是调节配制胶的浓度，据柳鹏讲10ml体系中1.5mol PH8.8的Lower buffer固定在2.5ml，⽽Distilled water 和Acrylamide/Bis(30%)之和等于7.3ml。
western blot试剂配方
Tris (MW121.14)
30.29g
蒸馏水
200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
Ph
Hcl
7.4
约17ml
7.5
约16ml
7.6
约15ml
8.0
约10ml
（5）10%SDS
SDS
10g
蒸馏水至
Western blotting所需要试剂配方
1、超纯水
2、30%Acr/Bic(29.1)、1.5mol/L Tris.Hcl(Ph=8.8)、0.5mol/L Tris.Hcl(Ph=6.8)、1.0mol/L Tris.Hcl、10%SDS
3、10%AP(使用前加1000ul超纯水)、转移缓冲液、TBS、TBST、TEMED、甲醇、吐温20
5.8g*10
SDS
0.37g*10
甲醇
200ml*10
蒸馏水至
1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（8）TBS缓冲液
1 mol/L Tris·HCl（pH7.5）
10ml
NaCl
8.8g
蒸馏水至
1000ml
可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用
（9）TBST缓冲液
20％Tween20
1.65ml
TBS
700ml
混匀后即可使用，最好现用现配
（10）电转缓冲液
Tris（MW121.14）
3.03g
甘氨酸（MW75.07）
配制Westernblot试剂配方
`配制Western-Blot 所用相关试剂1. 30%聚丙烯酰胺 100ml （RT or 4°C避光保存）29g丙烯酰胺1g bis-亚甲双丙烯酰胺2.10%SDS 100ml RT10g SDS→100ml ddH2O 加热搅拌溶解3.Buffers RT or 4°C1.5M Tris (pH: 8.8) 500ml (加Tris 90.855g)1.0M Tris (pH: 6.8) 250ml (加Tris 30.285g)4. 10% 过硫酸胺（APS） 4°C 避光保质期一周0.1g APS →1ml ddH2O5. Tris-Glycine (Running Buffer) 1L RT or 4°C5× 10× 1×ddH2O 800ml 800ml 800mlTris 15g 30g 3gGlycine 94g 188g 18.8g10％SDS 50ml 100ml 10ml(1g)加ddH2O→1000ml6. 10× Tris-Glycine for Transferring 1L RT or 4°CTris : 30.26gGlycine: 144.1gddH2O: 1L1× Transferring buffer10× Tris-Glycine 100ml (或 Tris:3.026g Glycine:14.41g) Methanol 200mlddH2O 700ml7. TBS (washing buffer) RT or 4°C ( pH 7.6)20× 10× 1×Tris 48.4g 24.2g 2.42gNaCl 160g 80g 8gddH2O 1000ml 1000ml 1000ml8. Buffer A: 用超纯水配制250ml储存在4°C冰箱中终浓度母液所需用量20 mM Hepes (pH 7.4) 1M（25ml：25*10-3*FW g） 5ml2 mM EDTA 0.5M（5ml：2.5*10-3*FW g） 1ml50 mM -glycerophosphate FW：306.12 3.8265g1 mM dithiothreitol 1M (已分装，存于—20冰箱最低层铝盒) 0.25ml1 mM Na3VO41M（2ml：0.368g） 0.25ml1% Triton, 20％（70ml） 12.5ml10% glycerol 25ml备注：dithiothreitol(DTT)已经配制为1M，并储存于－20°C冰箱Na3VO4（sodiium orthovanadate）, 原装粉剂RT保存，在李志华最左边的抽屉里β－glycerophosphate粉剂在4°C冰箱李志华层托盘中9．Protein inhibitors (fresh making)取1片溶解于2ml ddH2O, 并分装为200ul一支，－20°C保存。
Westernblot常用试剂配制
Westernblot常用试剂配制Western blot 常用试剂配制1.5 mol/L Tris (PH8.8)1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．用浓盐酸调节pH值至8.8。
4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的p H 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
（参照kara公司Catalog-N1）1 mol/L Tris (PH6.8)1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。
pH值浓HCl 6.87.4 约70 ml7.6 约60 ml8.0 约42 ml4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。
注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。
（参照kara公司Catalog-N1）30％丙稀酰胺（100ml）1．称量下列试剂置于烧杯中。
丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g双丙烯酰胺(BIS) 1 g2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．定容至100 ml, 用0.45 μm滤膜滤去杂质。
5．于棕色瓶中4 oC保存。
注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）30％SDS1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。
WesternBlot配方和方法
Western Blot 配方和方法Western Blot配液：1.10% SDS 溶液(m/v)：SDS 0.1gDDH O 1ml2加热溶解，室温保存，用后马上拧紧瓶盖。
2.10% 过硫酸铵:APS 0.1gDDH O 1ml2由于过硫胺酸会缓慢分解，最好颖配制，或隔周配制〔也可每 200 微升 EP 分装，4℃保存 4W，-20℃保存 1 月〕3.1× 电泳缓冲液Tris base 3.028gGlycine 14.4gSDS 1.0g用蒸馏水溶解至 1000ml，调整PH 8.3。
冰箱内可保存数月。
4.10 ×转膜液〔储存液〕甘氨酸72.07gTris base 15.14gDDH O 400ml2加水至 500ml，储存液不加甲醇，4℃保存。
1 × 转膜液 1L 配制：10 × 转膜液储存液 100ml，150ml 甲醇，加 DDH O2 750ml，PH 8.5，定容至总量 1L5.1×转膜液〔现配现用〕：Tris base 3.03gGlycine 14.42g甲醇150ml加水定容至 1000ml6.10 × TBS：Tris base 12.1gNaCl 40g加水，用浓盐酸调整 PH 至 7.6 后定容至500ml 7.TBST：1 × TBS/吐温 = 1000/18.封闭液：脱脂奶粉2gTBST 40ml温度适当调整〕〔pH6.8〕配胶：先配分别胶，再配积层胶。
一般两者同时配制，只是最终分别胶先加TEMED 混合后马上灌胶，而积层胶放4℃，等分别胶凝固后再加TEMED 混匀后灌胶。
TEMED 量加大，一般加至原来的2-3倍，依据试验当时的2ml 3ml 5ml 5ml 10% 5ml 5% 5% 8% 10% 两 15% 积 积 分 分 块 分 层 胶 层 胶 离 胶 离 胶胶 离胶超纯水1.42.1 2.3 1.9 2.8 1.1530％Acr/Bic0.3 0.4 1.3 1.7 2.5 2.539551.5mol/L1.3 1.3 0.9 1.3Tris · HCl5 〔pH8.8〕1mol/L 0.2 0.3Tris · HCl 5 75〔为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和10％SDS 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0235575 5 10%APS〔过硫胺0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 酸〕235575 5TEMED 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.002 03 03 02 03 02 双丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比1：29 配制时，SDS- 有效分别范围凝胶浓度〔％〕线性分离范围〔KD)15 12-4310 16-687.5 36-945.0 57-212按所需分别的蛋白质分子大小选择适宜的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于 60～200kDa 的 SDS变性蛋白质分子的分别，10%用于 16～70kDa，15%用于12～45kDa。
自己根据实验总结的Western blot
Western blot一、试剂配制1）细胞裂解液：用双蒸水定容至50ml，于4℃保存。
2）PMSF：PMSF 0.0174g溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。
注：PMSF工作浓度为0.1-1mM，此液为100mM母液，使用前加入细胞裂解液中，终浓度为1mM。
PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸和，吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。
一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。
凡被PMSF污染的衣服应予丢弃。
PMSF在水溶液中不稳定，应在使用前从贮存液中现用现加入裂解缓冲液中。
PMSF在水溶液中的活性丧失速率高于4℃。
pH值为8.0时，20umol/L的PMSF溶液的半寿期大约为35分钟（James，1978），这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。
3）1.5M Tris-base PH8.8：Tris-base 18.17g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至96ml，调PH时约需4ml浓HCL。
4）0.5M Tris-base PH6.8：Tris-base 6.05g溶于双蒸水定容至100ml，注：定容时可定容至97ml，调PH时约需3ml浓HCL。
5）10%SDS：SDS 10g溶于60ml双蒸水中，68℃助溶，定容至100ml，注：由于SDS溶解时会产生很多泡沫，定容时应先定容至95ml，等泡沫散去。
6）30%Acry/bis：丙烯酰胺29g，甲叉丙烯酰胺1g，双蒸水定容至100ml，37℃助溶，-4℃保存。
注：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺时应戴手套和口罩，配制该溶液时应在通风橱中进行，操作过程中应穿好实验服，注意防护。
8）10mg/ml牛血清白蛋白（BSA）母液：BSA 0.01g，生理盐水1ml，-20℃保存，使用时稀释为1mg/ml工作液。
9）5×SDS凝胶上样缓冲液（Loading Buffer）：组分：1MTris-base PH6.8（250mM），SDS（10%），溴酚蓝（0.5%），甘油（50%），β-巯基用双蒸水定容至5ml，小分（1ml）分装后，于室温保存，使用前将50ulβ-巯基乙醇加入每小份中，加入β-巯基乙醇Buffer可在室温中保存一个月，使用时稀释为1×工作液。
(完整word版)Westernblot试剂配制及操作步骤
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1) pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
Western blotting试剂配制
非离子表面活性剂T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。
30% Triton X-100的配制：试剂：Triton X-100 28.2ml0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4) 72.8ml配制方法：取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。
用前取该储备液稀释至所需浓度。
Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。
它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。
1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，配制BSA等。
名称：1.0mol/L Tris·HCl成分：Tris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200mlPH值：溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），体积：最后用蒸馏水定容至250ml，保存：高温灭菌后室温下保存。
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。
10％SDSSDS 10g蒸馏水至100ml50℃水浴下溶解，室温保存。
如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
Western Blot试剂配方
11.5
13.9
18.5
23.2
30% Acrylamide
1.3
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ7
4.0
5.3
6.7
8.0
10.7
13.3
1.5MTris-Hcl（pH8.8）
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.004
0.008
0.012
0.016
0.02
0.024
0.032
0.04
8%
H2O
2.3
4.6
6.9
Western Blot凝胶配制
分离胶配方表：
不同凝胶体积所对应各种组分的量
5mL
10mL
15mL
20mL
25mL
30mL
40mL
50mL
6%
H2O
2.6
5.3
7.9
10.6
13.2
15.9
21.2
Westernblot实验所需试剂配制方法
Westernblot实验所需试剂配制⽅法⼀．Western blot实验所需试剂配制⽅法制胶试剂：1.30％（W/V）丙烯酰胺溶液：名称⽤量备注Acrylamide 29g1g 充分搅拌溶解N-甲叉双丙烯酰胺(N，N-methylene-bisacylamide，BIS)去离⼦⽔80ml 定容⾄100ml，0.45µm滤膜过滤除杂，置于棕⾊瓶中4℃保存，（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，通过⽪肤吸收并具有累积性，配制时应戴⼿套操作）2.10％（W/V）过硫酸铵：名称⽤量备注过硫酸铵0.1g去离⼦⽔1ml 现配现⽤（注意：10％过硫酸铵溶液在4℃保存能使⽤两周左右，过期会失去催化效果）3. 1M Tris-HCL, pH=6.8 (36%的浓盐酸) ：名称⽤量备注Tris 12.1去离⼦⽔80ml浓盐酸8.8-9ml 预实验已确定去离⼦⽔加⼊去离⼦⽔定容⾄100ml后，室温保存4. 1.5M Tris-HCL, pH=8.8 (36%的浓盐酸) ：名称⽤量备注Tris 18.17去离⼦⽔80ml浓盐酸 2.8-3ml 预实验已确定去离⼦⽔加⼊去离⼦⽔定容⾄100ml后，室温保存5. 10%SDS：名称⽤量备注SDS 10g去离⼦⽔80ml 加⼊去离⼦⽔定容⾄100ml后，室温保存缓冲液配置：6. 5ⅹTris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)名称⽤量备注pH=8.3Tris 15.1gGlycine 94.0gSDS 5.0g去离⼦⽔800ml 加⼊去离⼦⽔定容⾄1L后，室温保存7. 1ⅹ膜转移缓冲液：名称⽤量备注Glycine 2.9g 2.9gTris 5.8g 5.8gSDS 0g 0.37g甲醇⽤前加200ml甲醇⽤前加200ml甲醇去离⼦⽔定容到1000ml 定容到1000ml 室温保存8. 1ⅹ膜转移缓冲液：名称⽤量备注Glycine 2.9g 2.9gTris 5.8g 5.8gSDS 0g 0.37g甲醇⽤前加200ml甲醇⽤前加200ml甲醇去离⼦⽔定容到1000ml 定容到1000ml 室温保存9. 5×SDS-PAGE Loading Buffer：名称⽤量备注1MTris-HCL, pH=6.8 1.25ml 2.5mlSDS 0.5g 1g⽢油 2.5ml 5mlBPB（溴酚蓝）25mg 50mg超纯⽔⾄5ml 10ml 分装200ul/管50℃充分溶解，30min，离⼼取上清，0.45uM过滤2ME 10ul/200ul 使⽤前添加，添加后可室温保存⼀个⽉10. 封闭缓冲液：名称⽤量备注脱脂奶粉5gTBST 100ml 充分溶解后，4 ℃保存其它：（备⽤）11. 考马斯亮蓝R-250染⾊液：名称⽤量备注考马斯亮蓝R-250 0.1g异丙醇25ml 搅拌溶解冰醋酸10ml 搅拌均匀去离⼦⽔65ml 搅拌均匀，滤纸除去颗粒物，室温保存12. 考马斯亮蓝染⾊脱⾊液：名称⽤量备注冰醋酸100ml甲醇100ml去离⼦⽔800ml 充分混匀后使⽤13. 2%的丽春红贮备液(20mL)：名称⽤量备注丽春红5g三氯⼄酸0.4g磺基⽔杨酸6g 充分溶解，定容20ml 制胶：14、分离胶的制备（pH 8.8）15、浓缩胶的制备（5%Acrylamide）。
Westernblot试剂配制及操作流程
cooktail 。
Western-Blot 操作流程试剂配制1.RIPA 裂解液:10mM Tris (,)1%NP40%Trit on X-100% 兑氧胆酸钠2 mM EDTA1 mM PMSF20%甘 油调pH 值至。
混匀后4 C 保存，长期保存于-20 C 。
使用时，加入蛋白酶抑制剂制胶用（1-6）:1. L Tris • HCI （）Tris 12.114g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至），室温下保存。
2. L Tris • HCI （）Tris 18.671g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至），室温下保存。
3. 10 % SDSSDS 10g蒸馏水至100ml如溶解困难，可在50C水浴下溶解，室温保存如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用4. 10 %过硫酸胺（AF）过硫酸胺蒸馏水1ml（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4C保存，保存时间为1周）5. 四甲基乙二胺原液（TEME）4?C保存。
6. 30初稀酰胺:4?C保存。
胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定10%F层胶，即分离胶（两块胶，15ml):依次加入去离子水30%^烯酰胺5ml1.5M Tris-HCI()10%SDS150口 I10%AP150口 ITEMED6口I每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEME量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEME混匀后应即刻灌胶。
灌胶后加异丙醇（1ml）消泡5%上层胶（两块胶，6ml）:依次加入去离子水30%丙烯酰胺1ml1M Tris-HCl ()10%SDS 60 口l10%AP 60 口lTEMED 6 口l每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEME量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEME混匀后应即刻灌胶。
7. 5X电泳液缓冲液Tris () 15.1g甘氨酸（）94gSDS （先加甲醇5.00g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存，用时稀释5倍，通常取160ml 配制成800ml 即可。
Westernblot所需溶液的配制
Westernblot所需溶液的配制WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
4Tris.HCl的配置注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml 微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置加HCl调pH到7.6，室温储存。
7TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液（loading buffer）的配置SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
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11.5
13.9
18.5
23.2
30% Acrylamide
1.3
2.7
4.0
5.3
6.7
8.0
10.7
13.3
1.5MTris-Hcl（pH8.8）
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
ddH2O 900mL
Tween-20 0.5mL
1ml
2ml
3ml
4ml
5ml
6ml
8ml
10ml
H2O
0.68
1.4
2.1
2.7
3.4
4.1
5.5
6.8
30%Acrylamide
0.17
0.33
0.5
0.67
0.83
1.0
1.3
1.7
1.0MTris-Hcl（pH6.8）
0.13
0.25
0.38
0.5
0.63
0.75
1.0
1.25
10%SDS
0.01
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.004
0.008
0.012
0.016
0.02
0.024
0.032
0.04
浓缩胶配方表（5%）
各种凝胶体积所对应各种组分的量
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.004
0.008
0.012
0.016
0.02
0.024
0.032
0.04
15%
H2O
1.1
2.3
3.4
4.6
5.7
6.9
9.2
11.5
30% Acrylamide
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
20.0
25.0
1.5MTris-Hcl（pH8.8）
组分名称
8%分离胶
12%分离胶
10%分离胶
H2O
16.2
11.5
13.8
30%Acrylamide
9.3
14
11.7
1.5MTris-Hcl（pH8.8）
8.8
8.8
8.8
10%SDS
0.38
0.38
0.35
10%过硫酸铵
0.35
0.38
0.35
TEMED
0.028
0.028
0.028
5%浓缩胶（14mL，四块1.5mm的胶，每块胶约3mL）
10×电泳缓冲液100mL
ddH2O990mL
10%SDS10mL
充分混匀
1×转膜缓冲液：
10×转膜缓冲液100mL
ddH2O700mL
无水甲醇200mL
充分混匀，放置4℃保存。
10×TBS缓冲液
Tris-Hcl 24.2g
NaCl 80g
蒸馏水至1000mL
1×TBS-T
10×TBS缓冲液100mL
Western Blot凝胶配制
分离胶配方表：
不同凝胶体积所对应各种组分的量
5mL
10mL
15mL
20mL
25mL
30mL
40mL
50mL
6%
H2O
2.6
5.3
7.9
10.6
13.2
15.9
21.2
26.5
30% Acrylamide
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
8.0
10.0
1.5MTris-Hcl（pH8.8）
组分名称
体积（mL）
H2O
9.5
30%Acrylamide
2.37
1.0MTris-Hcl（pH6.8）
1.75
10%SDS
0.14
10%过硫酸铵
0.14
TEMED
0.014
10×电泳（转膜）缓冲液：
Tris30.3g
甘氨酸144g
SDS10g
用ddH2O定容到1000mL，常温储存
1×电泳缓冲液：
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
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0.012
0.016
0.02
0.024
0.032
0.04
12%
H2O
1.6
3.3
4.9
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
02
0.024
0.032
0.04
10%
H2O
1.9
4.0
5.9
7.9
9.9
11.9
15.9
19.8
30% Acrylamide
1.7
3.3
5.0
6.7
8.3
10.0
13.3
16.7
1.5MTris-Hcl（pH8.8）
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.004
0.008
0.012
0.016
0.02
0.024
0.032
0.04
8%
H2O
2.3
4.6
6.9
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.08
0.1
10%过硫酸铵
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
006
0.08
0.1
TEMED
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.008
0.01
常用配方表：
分离胶（35mL，四块1.5mm的胶，每块胶7.5-8mL）
各组分体积（mL）
6.6
8.2
9.9
13.2
16.5
30% Acrylamide
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
16.0
20.0
1.5MTris-Hcl（pH8.8）
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
0.05
0.1