第四章 酶的分子修饰

酶分子修饰的目的
一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性
修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶 的天然构象产生“刚性”结构。
二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂
大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡 抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。
三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶
4.2.2 常见基团的化学修饰反应：羧基
碳二亚胺 硼氟化三甲烊盐
4.2.3 常见基团的化学修饰反应：巯基
5,5’-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB） 对氯汞甲苯酸（PMB）
4.2.4 常见基团的化学修饰反应：胍基
丁二酮
4.2.5 常见基团的化学修饰反应：酚基
四硝基甲烷 二异丙基氟磷酸（DFPA）
4.2.6 常见基团的化学修饰反应：咪唑基
焦炭酸二乙酯 碘乙酸
4.2.7 常见基团的化学修饰反应：吲哚基
2-羟基-5-硝基苄溴
4.2.8 分子内交联修饰
含有双功能基团的化合物（称为双功能试剂），如戊二醛、己 二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链 基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法。
2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”， 抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。
酶分子修饰的设计
一、充分认识酶分子的特性，包括酶的——
1. 活性部位情况 2. 稳定条件及反应最佳条件 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性
二、 修饰剂的选择，要考虑—— 1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量） 2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活 性基团） 3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件
第四章 酶的分子修饰
Chapter 4 Modification of Enzyme Molecule
酶在实际应用中有局限性：
1、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验， 半衰期短、易变性失活； 2、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产 工艺要求，限制了酶制剂的应用范围； 3、作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被 识别降解 。
通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变 酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
在体外将酶分子通过人工的方法 与一些化学基团（物质），特别是具 有生物相容性的物质，进行共价连接， 从而改变酶的结构和性质。
蛋白质水平：化学修饰 核酸水平：基因工程
通过基因工程方法 改变编码酶分子的基因 而达到改造酶的目的。
修饰剂）。
胃蛋白酶原 HCl
胃蛋白酶（从N端失去44个氨基酸残基）
pH1.5～2
自身激活
胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
（二）核苷酸链剪切修饰 在核苷酸链的限定位点
进行剪切，使酶的结构发 生改变，从而改变酶的特 性和功能的方法。
4.2 酶的侧链基团修饰
采用一定的方法（一般为化学法） 使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改 变酶分子的特性和功能的修饰方法。
三、反应条件的选择，要注意—— 1. 酶与修饰剂的分子比例 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 3. 反应温度及时间
4.1 酶分子主链修饰
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其 空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。
（一）肽链有限水解修饰 蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为
分离：
需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶 分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
例：均三嗪活化法
PEG
活化的PEG
天然酶
修饰酶
大分子修饰的作用
（1）提高酶活力（空间构象改变）
一分子RNA酶 + 6.5分子右旋糖苷——酶活提高为原来的2.25倍。 一分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高原来的 5.1倍。 一分子胰蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高0.30倍
（2）增加酶的稳定性
SOD:属氧化还原酶类，能清除体内超氧负离子，具有保护 DNA、蛋白质和细胞膜的作用，使它们免受超氧负离子 的破坏。
治疗：类风湿性关节炎、白内障、膀胱炎、红斑狼疮、 皮肤炎等。
SOD在体内稳定性差，静脉注射方式给药SOD半衰期只 有6～30 min
双功能试剂
同型双功能基团化合物 异型双功能基团化合物
4.2.9 大分子结合修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些 精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。是目前应用 最广的酶分子修饰方法。
修饰剂的选择
修饰剂的活化
修饰
分离
修饰剂的选择 ：
大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。 如：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物 （Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚 氨基酸等。 要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶 性大分子。
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮
盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶
破坏的可能性。
四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
修饰剂的活化：
以聚乙二醇（PEG）为例： 用于酶分子修饰的主要聚乙二醇衍生物有： ①聚乙二醇均三嗪衍生物 ②聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 ③聚乙二醇马来酸酐衍生物 ④聚乙二醇胺类衍生物
修饰：
将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以 一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间， 使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶 分子进行修饰。
酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质 的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨 基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些 基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间 结构的形成和稳定有重要作用。侧链基 团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改 变，从而改变酶的特性和功能。
4.2.1 常见基团的化学修饰反应：氨基
2,4,6-三硝基苯磺酸 2,4-二硝基氟苯 丹磺酰氯