第五章 酶分子修饰

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第二节 大分子结合修饰
共价修饰
❖ 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐 结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的 2.25倍；
❖ 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结
合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍
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一、大分子结合修饰的方法
1、修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水 溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、 蔗糖聚合物（Ficoll）、环状糊精、肝素、羧甲基纤 维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的 特性选择适宜的水溶性大分子。
1、酶的分离纯化 2、除去原有的金属离子：加入金属螯合 剂 3、加入置换离子
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金属离子置换修饰只适用于那些在分子 结构中本来含有金属离子的酶。
用于金属离子置换修饰的金属离子， 一般都是二价金属离子。
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二、金属离子置换修饰的作用
❖ 阐明金属离子对酶催化作用的影响 ❖ 提高酶活力 （а-淀粉酶） ❖ 增强酶的稳定性（Mn-SOD） ❖ 改变酶的动力学特性
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酶分子修饰的意义
❖ 提高酶的活力 activity
❖ 增强酶的稳定性 stability
❖ 降低或消除酶的抗原性 immunological property
❖ 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、
金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象
的影响 structure
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5.2 酶分子修饰的基本要求和条件
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Contents of chapter 5
Go 1、什么是酶分子修饰 Go 2、酶分子修饰的基本要求和条件 Go 3、酶分子的修饰方法 Go 4、酶分子修饰的应用
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5.1 什么是酶分子修饰？
❖ 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变， 从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分 子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方 法与一些化学基团（物质），特别是具有生 物相容性的物质，进行共价连接，从而改变 酶的结构和性质。
❖ 侧链基团修饰
❖ 肽链有限水解修饰
❖ 氨基酸置换修饰
❖ 核苷酸置换修饰
❖ 酶分子的物理修饰
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第一节 金属离子置换修饰
❖ 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子， 使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金 属离子置换修饰。
❖ α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶 中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子 (Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）, 超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)
2、修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能 直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用 之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧 链基团进行反应。 P139活化后的聚乙二醇衍生物。
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一、大分子结合修饰的方法
3、修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经 过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一 定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修 饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价 键结合，对酶分子进行修饰。
Chapter 5
Modification of Enzyme Molecule
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酶分子修饰的产生
酶在生物技术与工程中占有十分重 要的地位。酶所具有的反应专一性、催化高 效性及反应条件温和等优点，使其广泛应用 在工业、农业、医药、环保及能源等领域。
由于酶的本质是蛋白质的特点，在
催化反应中受到稳定性、反应条件等制约，
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第二节 大分子结合修饰
定义：利用水溶性大分子与酶结合,使酶的空 间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的 特性与功能的方法称为大分子结合修饰法。 简称为大分子结合法。
常用的修饰剂：右旋糖酐（dextran）、聚乙 二醇（PEG）、肝素(heparin)、蔗糖聚合物 （Ficoll）、聚氨基酸等。
（1）pH与离子强度
❖pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由 于它们的解离状态不同，反应性能也不同。
（2）修饰反应的温度与时间
❖严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专 一性的修饰反应。
（3）反应体系中酶与精修品课饰件剂的比例
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5.3 酶分子的修饰方法
❖ 金属离子置换修饰
❖ 大分子结合修饰(共价/非共价)
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❖ 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶 往往会丧失其催化活性。
❖ 如果重新加入原有的金属离子，酶的催化 活性可以恢复或者部分恢复。
❖ 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶 呈现出不同的特性。
❖ 有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的
却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定
性。
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一、金属离子置换修饰的方法
❖ 对酶分子进行修饰必须对修饰原理、修饰剂和反应条件 的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。
了解：
（1）酶的稳定性
❖热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。
（2）酶活性中心的状况
❖活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、 亚基数等。
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酶分子修饰的条件
❖ 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破 坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的 活力回收高。
早期能大规模应用的酶还不够多，酶工艺也
不完善。
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酶在使用中的缺陷有：稳定性差、 活力不够高、抗原性等，如对酸、碱、重 金属、有机介质、高温等物理化学环境敏 感，且活性、专一性、作用条件不能满足 生产工艺要求。
酶分子修饰成为酶工程中具有重 要意义和应用前景的领域。
随着蛋白质工程的兴起与发展， 酶分子修饰与基因工程技术结合在一起， 使酶分子修饰展现出更广阔的前景。
4、分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离， 将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具
有较好修饰效果的修饰酶。
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❖ 聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无 免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末 端活化后可以与酶产生交联，因而，它被 广泛用于酶的修饰。
大分子结合修饰是目前应用最广的酶分子修
饰方法。
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第二节 大分子结合修饰
共价修饰
❖ 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等， 通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。
❖ 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以 降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。