第五章 酶分子修饰
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酶工程 第五章
第—节 金属离子置换修饰
用于酶分子修饰的金属离子，往往是二价金属离子。例如 Ca 2 , Mg 2 , Mn2 , Zn2 , Co 2 , Cu 2 , Fe2 等等。金属离子置换修饰法只适用于本来 在结构中含有金属离子的酶。 在离子置换修饰的过程中，首先要加入一定量的乙二胺四乙酸 (EDTA)等金属螯合物到酶液中，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯 合物，此时酶成为无活性状态。通过透析或超滤、分于筛层析等方法， 可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。然后用不同的金属离子加到 酶液中，酶蛋白与金属离子结合。根据离子种类的不同，经离子置换 后的酶将会出现不同的特性。有些修饰酶活性比原来酶的活性降低， 甚至完全无活性；有些修饰酶的活性比原酶活性提高；有些修饰酶的 稳定性比原酶增加等。所以只要选择到适宜的金属离子作修饰剂，去 置换原来的金属离子，就有可能提高酶活力，增加酶稳定性。
第二节
大分子结合修饰
一、通过修饰提高酶活力
酶的催化能力受诸多因素的影响。本质上是由其特定 的空间结构，特别是由其活性中心的特定构象所决定的。 水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后，可使酶的 空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物 结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力得以提高。 例如：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可 使该酶的活力提高到原有的活力的2.25倍；用右旋糖酐修 饰胰凝乳蛋白酶，当每分子酶与11分子右旋糖酐结合时， 修饰酶的活力达到原有的活力的5.1倍；每分子胰蛋白酶 用11分子的右旋糖肝修饰后，酶活力可提高30％等。
第二节 大分子结合修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某 些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分 子结合修饰法。简称为大分子结合法。 通常使用的水溶性大分子修饰剂有：有旋糖酐、聚乙 二醇、肝素、蔗糖聚合物(Ficoll)、聚氨基酸等。这些大 分子在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分 子以共价键结合。对酶分子进行修饰。例如：右旋糖酐先 经高碘酸(HIO4)活化，然后与酶分于的氨基共价结合。
酶工程 第五章酶分子修饰 第四节酶蛋白侧链基团修饰
酶蛋白侧链基团修饰一般采用化学手段，故属于化学 修饰法。所采用的各种小分子化合物称为侧链基团修饰剂。 不同的侧链基团所使用的修饰剂各不相同，可根据需要加 以选择。现将几种常用的小分子侧链基因修饰剂介绍如下：
一、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为 氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二 酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱 氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原 有的副链改变，从而改变酶蛋白的构象。
酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也 可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基 团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用 不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法， 将在下一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋 白侧极基团相互作用的修饰方法。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
已知大肠杆菌的苹果酸酶可催化下列4种生化反应：
该酶的巯基用乙基马来酰亚胺修饰后，其催化 主反应A的功能消失，同时也失去催化反应B的能力， 然而催化反应C和D的酶活性却提高10倍以上。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶经侧链基团修饰后，对于酶的活性、稳定性或抗原 性都有显著影响，往往可提高其使用价值。例如：用O-甲 基异脲修饰溶菌酶，使赖氨酸残基的ε-氨基与之结合， 修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且很容易结晶析 出；用亚硝酸修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸 和肽链中的赖氨酸的氨基脱去变成羟基，经修饰后，该酶 的稳定性大大提高，在体内的半衰期可延长2倍，显著提 高治疗效果；枯草杆菌蛋白酶的第l 04位酪氨酸可特异地 被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由于负电荷能 引入，而增加了对带正电荷底物的结合力；葡萄糖异构酶 经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加酶 的稳定性，这对果葡糖的生产有利。
一、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为 氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二 酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱 氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原 有的副链改变，从而改变酶蛋白的构象。
酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也 可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基 团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用 不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法， 将在下一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋 白侧极基团相互作用的修饰方法。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
已知大肠杆菌的苹果酸酶可催化下列4种生化反应：
该酶的巯基用乙基马来酰亚胺修饰后，其催化 主反应A的功能消失，同时也失去催化反应B的能力， 然而催化反应C和D的酶活性却提高10倍以上。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶经侧链基团修饰后，对于酶的活性、稳定性或抗原 性都有显著影响，往往可提高其使用价值。例如：用O-甲 基异脲修饰溶菌酶，使赖氨酸残基的ε-氨基与之结合， 修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且很容易结晶析 出；用亚硝酸修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸 和肽链中的赖氨酸的氨基脱去变成羟基，经修饰后，该酶 的稳定性大大提高，在体内的半衰期可延长2倍，显著提 高治疗效果；枯草杆菌蛋白酶的第l 04位酪氨酸可特异地 被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由于负电荷能 引入，而增加了对带正电荷底物的结合力；葡萄糖异构酶 经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加酶 的稳定性，这对果葡糖的生产有利。
第五章 酶分子的化学修饰
对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修饰：
如果辅因子与酶是非共价结合的,可以将 辅因子共价结合于酶分子上；
引入新的具有更强反应的辅因子。 四、金属酶的金属取代
酶分子中的金属离子可以被其他金 属离子取代，可以改变酶的专一性、稳 定性等。
第二节 酶化学修饰的基本要求
一、被修饰酶的性质 （一）酶的稳定性：包括热稳定性、酸
（五）分子间交联：利用一些双功能 或多功能试剂将不同的酶交联在一 起形成杂化酶。例如用戊二醛把胰 蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起， 可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性； 将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形 成的杂化酶可作为部分代谢途径的 模型。
（六）脂质体包埋：一些医药用酶， 如 SOD、溶菌酶等，由于分子量较 大，不易进入人体细胞内，而且在 体内半衰期短，产生免疫原性反应； 用脂质体包埋法纪可解决这些问题。 制止提是天然脂类或类固醇组成的 微球体，酶分子包埋在其内部，可 以通过与细胞的膜融合或内吞作用 而进入细胞内。
碱稳定性，作用温度以及pH，酶蛋白 解离时的电化学性质，抑制剂的性质 等。 （二）酶活性中心的状况：包括酶分子 活性中心的组成，如参与活性中心的 氨基酸残基、辅因子等。酶分子的形 状、大小以及寡聚酶的亚基组成。
（三）酶侧链基团的性质与反应性质
1、对巯基的化学修饰：
常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂 和Ellman试剂等。
2、大分子共价修饰：利用一些可溶性 大分子，通过共价键连接于酶分子的 表面，形成一层覆盖层，形成的可溶 性酶具有许多有用的性质。例如用聚 乙二醇共价修饰超氧化物歧化酶 （SOD），不仅可以降低或消除酶 的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了半衰期，从而提高了药效。
（四）分子内交联：增加酶分 子表面的交联键数目是提高酶 稳定性的有效方法之一，例如 胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰 二亚胺活化后，可以与一系列 二胺发生作用，使酶的稳定性 得到改善。
如果辅因子与酶是非共价结合的,可以将 辅因子共价结合于酶分子上；
引入新的具有更强反应的辅因子。 四、金属酶的金属取代
酶分子中的金属离子可以被其他金 属离子取代，可以改变酶的专一性、稳 定性等。
第二节 酶化学修饰的基本要求
一、被修饰酶的性质 （一）酶的稳定性：包括热稳定性、酸
（五）分子间交联：利用一些双功能 或多功能试剂将不同的酶交联在一 起形成杂化酶。例如用戊二醛把胰 蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起， 可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性； 将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形 成的杂化酶可作为部分代谢途径的 模型。
（六）脂质体包埋：一些医药用酶， 如 SOD、溶菌酶等，由于分子量较 大，不易进入人体细胞内，而且在 体内半衰期短，产生免疫原性反应； 用脂质体包埋法纪可解决这些问题。 制止提是天然脂类或类固醇组成的 微球体，酶分子包埋在其内部，可 以通过与细胞的膜融合或内吞作用 而进入细胞内。
碱稳定性，作用温度以及pH，酶蛋白 解离时的电化学性质，抑制剂的性质 等。 （二）酶活性中心的状况：包括酶分子 活性中心的组成，如参与活性中心的 氨基酸残基、辅因子等。酶分子的形 状、大小以及寡聚酶的亚基组成。
（三）酶侧链基团的性质与反应性质
1、对巯基的化学修饰：
常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂 和Ellman试剂等。
2、大分子共价修饰：利用一些可溶性 大分子，通过共价键连接于酶分子的 表面，形成一层覆盖层，形成的可溶 性酶具有许多有用的性质。例如用聚 乙二醇共价修饰超氧化物歧化酶 （SOD），不仅可以降低或消除酶 的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了半衰期，从而提高了药效。
（四）分子内交联：增加酶分 子表面的交联键数目是提高酶 稳定性的有效方法之一，例如 胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰 二亚胺活化后，可以与一系列 二胺发生作用，使酶的稳定性 得到改善。
酶工程-05-酶分子修饰
2、化学修饰法
2)专一性化学修饰 （2）位点专一性修饰（亲和标记） 含有活泼反应基团的底物类似物：
①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与 活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。
②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形 成稳定的共价键。
Enzyme Engineering
位点专一性修饰
18
Enzyme Engineering
酶的结构
研究酶活性中心的方法
2、化学修饰法 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团相互作
用。
Problem???
怎样判断化学试剂是同活性中心内的必需基团结 合？
How to determine ?
Enzyme Engineering
催化特性
研究角度 —— 酶学
环境适应性
研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探 索酶的结构与催化特性之间的关系
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态 探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动 探索酶的作用机理和催化反应历程
Enzyme Engineering
Enzyme Engineering
酶分子修饰
大分子结合修饰
Macromolecules combine modification
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空
间构象发生某些精细的改变，从而改变酶催化特性的方法 常用的大分子
Enzyme Engபைடு நூலகம்neering
酶分子修饰
酶分子修饰的条件
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维 持酶活性功能的必需基团
2)专一性化学修饰 （2）位点专一性修饰（亲和标记） 含有活泼反应基团的底物类似物：
①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与 活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。
②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形 成稳定的共价键。
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位点专一性修饰
18
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酶的结构
研究酶活性中心的方法
2、化学修饰法 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团相互作
用。
Problem???
怎样判断化学试剂是同活性中心内的必需基团结 合？
How to determine ?
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催化特性
研究角度 —— 酶学
环境适应性
研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探 索酶的结构与催化特性之间的关系
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态 探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动 探索酶的作用机理和催化反应历程
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大分子结合修饰
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采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空
间构象发生某些精细的改变，从而改变酶催化特性的方法 常用的大分子
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酶分子修饰
酶分子修饰的条件
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维 持酶活性功能的必需基团
酶分子修饰
3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白 水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上 敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂 后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
同理，其他有机溶媒，去垢剂等也由于会 破坏维持酶天然构象的平衡力和改变微环 境而导致酶失活。
4、消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
酶经过化学修饰后，除了能减少由于内部平衡力 被破坏而引起的酶分子伸展打开外，还由于大分 子修饰剂本身就是多聚电荷体，所以有可能在酶 分子表面形成一层“缓冲外壳”。在一定程度上 抵御外界环境的电荷、极性变化，维持酶活性部 位的微环境相对稳定，使酶能在更广泛的条件下 发挥作用。
3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
根据蛋白水解酶是一大分子物质，并只是在充分接近多肽 链上敏感键和敏感基团后才能产生作用的原理，酶化学修 饰期望交联于酶上的大分子修饰剂能产生空间障碍来阻挡 蛋白水解酶接近酶分子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭 破坏。 另外，酶分子上许多敏感基团（如赖氨酸的ε-氨基等）参 与修饰反应，交联上修饰剂后，也减少了酶分子遭受蛋白 水解酶攻击破坏的可能性。
化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种 化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶分子 上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化 学反应，对酶分子结构进行改造。
化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。 只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保 持酶活性的基础上，能够在较大范围内改 变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良 特性，甚至创造出新的活性。
酶分子的基本结构是蛋白质，这一特性就决定了 当某种酶在作用于底物使之转变为产物的同时， 其本身也可能成为另一种酶（如蛋白水解酶）的 底物。对于蛋白水解酶来讲，一般是作用于某些 特定敏感键后，导致蛋白多肽链断裂。
酶工程 第五章酶分子修饰 第五节氨基酸置换修饰
第五节 氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰除了在酶工程方面应用之外，还可用 来修饰其他功能蛋白质或多肽分子。例如：β-干扰素原 来稳定性差。这是由于其分子中含有3个半胱氨酸，其中2 个半胱氨酸的巯基连结形成二硫键，而另一个在第17位的 半肮氨酸(Cys-17)的巯基是游离的。当β-干扰素分子的 游离巯基与另—个β-干扰素的游离巯基相结合形成二硫 键时，β-干扰素就失去其活性。若将这个半胱氨酸(Cys17)用丝氨酸置换，就使β-干扰素不会生成二聚干扰素， 从而大大提高其稳定性。经修饰后的β-干扰素在低温条 件下保存半年，仍可保持其活性不变，这就为β-干扰素 的临床使用创造了条件。
第五节 氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰可以用化学方法进行。例如：Bender 和Koshland成功地用化学方法将枯草杆菌蛋白酶活性中心 的丝氨酸转换为半胱氨酸，经修饰后，该酶对蛋白质和肽 的水解能力消失，但却出现了催化硝基苯酯等底物水解的 活性。但是化学方法进行氨基酸置换，难度较大，受到诸 多限制。
80年代兴起和发展起来的蛋白质工程，为氨基酸置换 修饰提供了行之有效的可靠手段。
蛋白质工程又被称为第二代遗传工程。是指通过改造 与蛋白质相对应的基因中的碱基排列次序，或设计合成新 的基因，将它克隆到寄主细胞中，通过基因表达而获得具 有新的特性的蛋白质的技术过程。
第五节 氨基酸置换修饰
蛋白质工程主要步骤如下： 1.新蛋白质结构的设计 根据已知的蛋白质或酶的化学结构、空间结构及其特 性，确定欲得到的新蛋白质或酶的氨基酸排列次序。确定 欲置换的氨基酸及位置。 2.突变基因的核苷酸序列的确定 根据欲得到蛋白质的氨基酸序列，确定其对应的m RNA上的核苷酸序列，再根据互补原则，从mRNA核苷酸序 列确定其所对应的突变基因上的核苷酸序列。依据欲置换 的氨基酸确定需要置换的核苷酸及其位置。
第五章 酶分子修饰
Ag+ 、Al3+、Fe2+、Zn2+、 Cu2+、Hg2+对酶 具有抑制作用, 其中的 Zn2+、Cu2+、 Hg2+对 该酶具有较强的抑制作用。
技术路线图
尼罗罗非鱼
→ → →→
脱氯水暂养2d
取出全部肝脏
肝脏淀粉酶 酶活力研究
一价金属离子对酶活力的影响
钠、钾、锂对酶活力基本没有影响，酶活力相对稳定。
二价金属离子对酶活力的影响
铜对酶活力具有抑制作用, 锌对酶活力没明显影响。
三价金属离子对酶活力的影响
铝对酶活力具有抑制作用,但效果不是很强烈； 铁有促进作用,但促进的趋势则表现为先上升后下降, 最高
值达到130%。
重金属离子对淀粉酶活力的影响
镉、铅对淀粉酶的活力具有显著的抑制作用。 离子浓度分别达到4 mmol /L和5 mmol /L时酶 已全部失活。
来源于超嗜热微生物的酶：具有极高的热稳定性, 通常 能抵抗化学变性剂, 如表面活性剂、有机溶剂和高酸高碱 环境, 其催化功能优于目前在各种工业生产中应用的酶。
因此, 超嗜热微生物酶已作为研究在极端条件下酶的进 化、稳定性和活性机制、蛋白质结构和功能的关系以及生 物催化性的模型。
α-淀粉酶为重要的工业酶制剂之一, 已被广泛应用在食 品、发酵、纺织、 造纸和制药等诸多行业。
吲哚基修饰
通过改变酶分子上的（色氨酸残基）吲哚基而使酶分子的构象和特性发
α-淀粉酶
1. 合适的钙离子存在，提高酶的稳定性； 93~95℃仍能保持足够高的活性。
2. 各金属离子对不同来源的α-淀粉酶的 活性影响不同。
研究背景
超嗜热微生物：最适生长温度为 80—110℃范围的古菌 和细菌。
技术路线图
尼罗罗非鱼
→ → →→
脱氯水暂养2d
取出全部肝脏
肝脏淀粉酶 酶活力研究
一价金属离子对酶活力的影响
钠、钾、锂对酶活力基本没有影响，酶活力相对稳定。
二价金属离子对酶活力的影响
铜对酶活力具有抑制作用, 锌对酶活力没明显影响。
三价金属离子对酶活力的影响
铝对酶活力具有抑制作用,但效果不是很强烈； 铁有促进作用,但促进的趋势则表现为先上升后下降, 最高
值达到130%。
重金属离子对淀粉酶活力的影响
镉、铅对淀粉酶的活力具有显著的抑制作用。 离子浓度分别达到4 mmol /L和5 mmol /L时酶 已全部失活。
来源于超嗜热微生物的酶：具有极高的热稳定性, 通常 能抵抗化学变性剂, 如表面活性剂、有机溶剂和高酸高碱 环境, 其催化功能优于目前在各种工业生产中应用的酶。
因此, 超嗜热微生物酶已作为研究在极端条件下酶的进 化、稳定性和活性机制、蛋白质结构和功能的关系以及生 物催化性的模型。
α-淀粉酶为重要的工业酶制剂之一, 已被广泛应用在食 品、发酵、纺织、 造纸和制药等诸多行业。
吲哚基修饰
通过改变酶分子上的（色氨酸残基）吲哚基而使酶分子的构象和特性发
α-淀粉酶
1. 合适的钙离子存在，提高酶的稳定性； 93~95℃仍能保持足够高的活性。
2. 各金属离子对不同来源的α-淀粉酶的 活性影响不同。
研究背景
超嗜热微生物：最适生长温度为 80—110℃范围的古菌 和细菌。
酶工程 第五章酶分子修饰 第六节物理修饰
酶工程
第五章 酶分子修饰
第六节 物理修饰
通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改 变，而改变酶的某些特性和功能的方法称为物理修饰。
物理修饰的特点在于不改变酶的组分和基因，酶分子 中的共价键不发生改变，只是在物理方法的作用下，副键 发生某些变化和重排。例如：羧肽酶γ经高压处理后，底 物特异性发生改变，有利于催化肽的合成反应，而水解反 应的能力降低；用高压方法处理纤维素酶以后，该酶的最 适温度有所降低，在30～40℃的条件下，高压修饰酶比天 然酶的活力提高10％。
第六节 物理修饰
酶分子空间构象的改变还可在某些变性剂的作用下， 先使酶原有空间构象破坏，然后在不同的条件下，使酶分 子重新构建新的构象。例如：先用盐酸胍等变性剂使胰Байду номын сангаас 白酶的原有构象破坏，通过透析除去变性剂后，在不同温 度下，使酶重新折叠形成新的构象。结果表明，50℃条件 下重新构建构象的胰蛋白酶的稳定性比在20℃下重建构象 的酶提高5倍。天然胰蛋白酶的稳定性与20℃条件下重建 构象的酶的稳定性基本相同。
酶分子修饰
金属离子置换修饰的作用
1、阐明金属离子对酶催化作用的影响 2、提高酶活力
锌型蛋白酶置换成钙型蛋白酶，酶活力可提高20%-30%；结晶的 钙型α -淀粉酶催化效率比杂离子型α -淀粉酶催化效率高3倍以上， 且稳定性增加。 3、增强酶稳定性
含铁的超氧化物歧化酶中铁原子被锰取代后,酶的稳定性和抑制 作用发生显著改变,重组的含锰的酶对H2O2的稳定性显著增强,对 NaH3的抑制作用的敏感性显著降低。 4、改变酶动力学特性
3.酶分子修饰的依据
依据酶的结构特点与酶催化特性的关系即构效关系，找出关 键结构，有目的进行改造，或者以基因的随机重组为手段，参考 酶的构效关系进行关键位点的改造
4. 酶分子修饰的意义
提高酶的催化效率，改变底物专一性； 增强酶的稳定性； 降低或消除酶的抗原性； 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种 物理因素对酶分子空间构象的影响，进一步探索酶的结构与催化特性 之间的关系。
7. 酶分子修饰的方法
金属离子置换修饰 大分子结合修饰 侧链基团修饰 肽链有限水解修饰 核苷酸链剪切修饰 氨基酸置换修饰 核苷酸置换修饰 物理修饰 酶分子修饰的应用
第一节 金属离子置换修饰
把酶分子中所含的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催 化特性发生改变的修饰方法。
适用对象：金属ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 1. 酶分子中含有一种或几种金属离子，作为辅因子，往往是酶活 性中心的组成部分； 2. 参与酶的催化作用，或者对保持酶的活性和构象起稳定作用； 3.不同的金属离子可使酶呈现不同特性。
构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。
大分子结合修饰的作用
1、提高酶的催化效率 酶的催化功能是由其空间结构决定的，特别是其活性中心的特定
4.8第五章酶分子修饰
4. 活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 5. 酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用
等次级键结合。
单选题 1分
下列关于酶活性部位的描述错误的一项是 。
活性部位是酶分子中直接与底物结合，并发挥催 A 化功能的部位
活性部位的基团按功能可分为两大类：一类是结 B 合基团，一类是催化基团
酶活性部位的基团可以是同一条肽链但在一级结 C 构上相距很远的基团 D 不同肽链上的有关基团不能构成该酶的活性部位
▪ 超氧化物歧化酶（SOD）：生物体内重要的自由 基清除剂，催化超氧阴离子（O2-）的歧化反应， 能缓解许多由自由基介导的炎症反应，减轻组织 缺血性损伤，预防和治疗辐射损伤。
▪ 应用：延缓人体衰老，防止色素沉着，消除局 部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发 性关节炎及辐射防护。
缺陷：半衰期短（6min）、稳定性差、免疫原 性强！
单选题 1分
利用物理吸附法对酶进行固定化主要通过 载体上。
结合于
A 氢键、疏水作用和π-电子亲和力 B 氢键、离子键和π-电子亲和力 C 氢键、离子键和共价键 D 离子键、疏水作用和共价键
提交
单选题 1分
酶固定化后，受载体带电性和产物性质的影响，其最适pH和 酶活力-pH曲线常发生偏移。一般来说，用带负电荷载体制 备的固定化酶，其最适pH较游离酶 ；当催化反应的产物 为碱性时，固定化后酶的最适pH值较游离酶 。
消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期 用Dextran修饰-淀粉酶，-淀粉酶，胰蛋白酶、 过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。
（2）侧链基团修饰（小分子修饰 ）
（side residues modification）
通过小分子化学修饰剂使酶分子侧链基团发生改变， 从而改变酶的催化特性的修饰方法。
等次级键结合。
单选题 1分
下列关于酶活性部位的描述错误的一项是 。
活性部位是酶分子中直接与底物结合，并发挥催 A 化功能的部位
活性部位的基团按功能可分为两大类：一类是结 B 合基团，一类是催化基团
酶活性部位的基团可以是同一条肽链但在一级结 C 构上相距很远的基团 D 不同肽链上的有关基团不能构成该酶的活性部位
▪ 超氧化物歧化酶（SOD）：生物体内重要的自由 基清除剂，催化超氧阴离子（O2-）的歧化反应， 能缓解许多由自由基介导的炎症反应，减轻组织 缺血性损伤，预防和治疗辐射损伤。
▪ 应用：延缓人体衰老，防止色素沉着，消除局 部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发 性关节炎及辐射防护。
缺陷：半衰期短（6min）、稳定性差、免疫原 性强！
单选题 1分
利用物理吸附法对酶进行固定化主要通过 载体上。
结合于
A 氢键、疏水作用和π-电子亲和力 B 氢键、离子键和π-电子亲和力 C 氢键、离子键和共价键 D 离子键、疏水作用和共价键
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单选题 1分
酶固定化后，受载体带电性和产物性质的影响，其最适pH和 酶活力-pH曲线常发生偏移。一般来说，用带负电荷载体制 备的固定化酶，其最适pH较游离酶 ；当催化反应的产物 为碱性时，固定化后酶的最适pH值较游离酶 。
消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期 用Dextran修饰-淀粉酶，-淀粉酶，胰蛋白酶、 过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。
（2）侧链基团修饰（小分子修饰 ）
（side residues modification）
通过小分子化学修饰剂使酶分子侧链基团发生改变， 从而改变酶的催化特性的修饰方法。
酶学与酶工程第五章酶分子修饰学生
01
十一次课
02
2
1
酶分子侧链基团修饰
酶侧链基团的修饰方法很多，主要有氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、酚基修饰、胍基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰及分子内交联修饰等
功能基团主要有氨基、羧基、巯基．咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基
3
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸
侧链基团
修饰剂
Lys
氨基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸
02
分离
03
需要通过不同的方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
04
金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法成为金属离子置换修饰。 金属离子置换修饰的方法：酶的纯化、去除原有的金属离子、加入置换离子 金属离子置换修饰的作用：
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
6 min
1
右旋糖酐-SOD
7 h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
14 h
140
Ficoll(高分子量)–SOD
2
引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。
01
仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。
02
有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。
03
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：
氨基酸置换修饰
将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。
十一次课
02
2
1
酶分子侧链基团修饰
酶侧链基团的修饰方法很多，主要有氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、酚基修饰、胍基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰及分子内交联修饰等
功能基团主要有氨基、羧基、巯基．咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基
3
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸
侧链基团
修饰剂
Lys
氨基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸
02
分离
03
需要通过不同的方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
04
金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法成为金属离子置换修饰。 金属离子置换修饰的方法：酶的纯化、去除原有的金属离子、加入置换离子 金属离子置换修饰的作用：
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
6 min
1
右旋糖酐-SOD
7 h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
14 h
140
Ficoll(高分子量)–SOD
2
引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。
01
仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。
02
有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。
03
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：
氨基酸置换修饰
将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。
酶分子修饰
Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。金属离子置
换修饰只适用于本来在结构中含金属离子的酶。
6
一、金属离子置换修饰的方法
1、酶的分离纯化：将需修饰的酶进行分离纯化，获
得具有一定纯度的酶液。
2、除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定
量的金属螯合剂，与酶分子中的金属离子形成螯合物，
乙醛等进行分子内交联修饰；还可以利用水溶性大分子
与酶的侧链基团共价结合进行大分子结合修饰。
22
2）核酸类酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基
上的功能团。主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶
碱基上的氨基和羟基。
通过侧连基团的修饰，提高R酶的稳定性，扩展其催
化功能，提高酶的催化效率。
23
一、氨基修饰
第五章 酶分子修饰
定义：通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，
从而改变酶的某些特性和功能的过程。
天然酶在应用中的限制因素：
1）酶的活性、作用专一性和作用最适条件常不能
适应生产工艺的要求；
2）酶是蛋白质，容易变性失效，一般经不起高温、
强酸、强碱、有机溶剂以及时间等的考验；
3）注入人体内，作为异体蛋白，有难于吸收、易
17
❖
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无
毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活
化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
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min
1
右旋糖酐-SOD
7
h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
换修饰只适用于本来在结构中含金属离子的酶。
6
一、金属离子置换修饰的方法
1、酶的分离纯化：将需修饰的酶进行分离纯化，获
得具有一定纯度的酶液。
2、除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定
量的金属螯合剂，与酶分子中的金属离子形成螯合物，
乙醛等进行分子内交联修饰；还可以利用水溶性大分子
与酶的侧链基团共价结合进行大分子结合修饰。
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2）核酸类酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基
上的功能团。主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶
碱基上的氨基和羟基。
通过侧连基团的修饰，提高R酶的稳定性，扩展其催
化功能，提高酶的催化效率。
23
一、氨基修饰
第五章 酶分子修饰
定义：通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，
从而改变酶的某些特性和功能的过程。
天然酶在应用中的限制因素：
1）酶的活性、作用专一性和作用最适条件常不能
适应生产工艺的要求；
2）酶是蛋白质，容易变性失效，一般经不起高温、
强酸、强碱、有机溶剂以及时间等的考验；
3）注入人体内，作为异体蛋白，有难于吸收、易
17
❖
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无
毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活
化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
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右旋糖酐-SOD
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Ficoll(低分子量)–SOD
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早期能大规模应用的酶还不够多，酶工艺也
不完善。
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2
酶在使用中的缺陷有：稳定性差、 活力不够高、抗原性等，如对酸、碱、重 金属、有机介质、高温等物理化学环境敏 感，且活性、专一性、作用条件不能满足 生产工艺要求。
酶分子修饰成为酶工程中具有重 要意义和应用前景的领域。
随着蛋白质工程的兴起与发展， 酶分子修饰与基因工程技术结合在一起， 使酶分子修饰展现出更广阔的前景。
❖ 侧链基团修饰
❖ 肽链有限水解修饰
❖ 氨基酸置换修饰
❖ 核苷酸置换修饰
❖ 酶分子的物理修饰
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9
第一节 金属离子置换修饰
❖ 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子， 使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金 属离子置换修饰。
❖ α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶 中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子 (Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）, 超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)
（1）pH与离子强度
❖pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由 于它们的解离状态不同，反应性能也不同。
（2）修饰反应的温度与时间
❖严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专 一性的修饰反应。
（3）反应体系中酶与精修品课饰件剂的比例
8
5.3 酶分子的修饰方法
❖ 金属离子置换修饰
❖ 大分子结合修饰(共价/非共价)
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3
Contents of chapter 5
Go 1、什么是酶分子修饰 Go 2、酶分子修饰的基本要求和条件 Go 3、酶分子的修饰方法 Go 4、酶分子修饰的应用
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4
5.1 什么是酶分子修饰？
❖ 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变， 从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分 子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方 法与一些化学基团（物质），特别是具有生 物相容性的物质，进行共价连接，从而改变 酶的结构和性质。
大分子结合修饰是目前应用最广的酶分子修
饰方法。
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15
第二节 大分子结合修饰
共价修饰
❖ 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等， 通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。
❖ 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以 降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能 力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。
❖ 对酶分子进行修饰必须对修饰原理、修饰剂和反应条件 的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。
了解：
（1）酶的稳定性
❖热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑制剂等。
（2）酶活性中心的状况
❖活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、 亚基数等。
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7
酶分子修饰的条件
❖ 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破 坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的 活力回收高。
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10
❖ 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶 往往会丧失其催化活性。
❖ 如果重新加入原有的金属离子，酶的催化 活性可以恢复或者部分恢复。
❖ 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶 呈现出不同的特性。
❖ 有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的
却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定
性。
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11
一、金属离子置换修饰的方法
Chapter 5
Modification of Enzyme Molecule
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1
酶分子修饰的产生
酶在生物技术与工程中占有十分重 要的地位。酶所具有的反应专一性、催化高 效性及反应条件温和等优点，使其广泛应用 在工业、农业、医药、环保及能源等领域。
由于酶的本质是蛋白质的特点，在
催化反应中受到稳定性、反应条件等制约，
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14
第二节 大分子结合修饰
定义：利用水溶性大分子与酶结合,使酶的空 间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的 特性与功能的方法称为大分子结合修饰法。 简称为大分子结合法。
常用的修饰剂：右旋糖酐（dextran）、聚乙 二醇（PEG）、肝素(heparin)、蔗糖聚合物 （Ficoll）、聚氨基酸等。
2、修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能 直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用 之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧 链基团进行反应。 P139活化后的聚乙二醇衍生物。
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18
一、大分子结合修饰的方法
3、修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与经 过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一 定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修 饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价 键结合，对酶分子进行修饰。
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16
第二节 大分子结合修饰
共价修饰
❖ 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐 结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的 2.25倍；
❖ 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结
合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍
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17
一、大分子结合修饰的方法
1、修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水 溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、 蔗糖聚合物（Ficoll）、环状糊精、肝素、羧甲基纤 维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的 特性选择适宜的水溶性大分子。
1、酶的分离纯化 2、除去原有的金属离子：加入金属螯合 剂 3、加入置换离子
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12
金属离子置换修饰只适用于那些在分子 结构中本来含有金属离子的酶。
用于金属离子置换修饰的金属离子， 一般都是二价金属离子。
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二、金属离子置换修饰的作用
❖ 阐明金属离子对酶催化作用的影响 ❖ 提高酶活力 （а-淀粉酶） ❖ 增强酶的稳定性（Mn-SOD） ❖ 改变酶的动力学特性
4、分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离， 将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具
有较好修饰效果的修饰酶。
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19
❖ 聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容 性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无 免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末 端活化后可以与酶产生交联，因而，它被 广泛用于酶的修饰。
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Hale Waihona Puke 5酶分子修饰的意义
❖ 提高酶的活力 activity
❖ 增强酶的稳定性 stability
❖ 降低或消除酶的抗原性 immunological property
❖ 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、
金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象
的影响 structure
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6
5.2 酶分子修饰的基本要求和条件