种子的扩大培养

种子的扩大培养
孢子龄
• 过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子 生产能力下降。孢子龄以控制在孢子量多、成 熟、效价正常的阶段为宜。
接种量
接种量过小斜面长出的菌落稀疏，太大则菌落 密度过大。传代用斜面孢子要求菌落稀疏，便 于挑选单个菌落传代；摇瓶或进罐用斜面孢子 要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标 准。
种子罐的作用：
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝） 体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定 的菌体量，以利于产物的合成。
种子的扩大培养
种子罐级数的确定 种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培
养的次数。
一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌 体繁殖速度以及所采用发酵罐的容积而 定。
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• 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少。 • 茄子瓶→种子罐→发酵罐 二级发酵 • 霉菌：生长较慢，如青霉菌， • 孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发芽， 产生菌丝 ）→二级种子罐（ 27˚C,10~24小时，菌体 迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐 三级发酵 • 放线菌：生长更慢，采用三级种子罐扩大培养 四级发酵 • 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子。 • 二级发酵 • 种子的扩大培养
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2、生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种至 种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同 菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成 分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等。如果是需 氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不 断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布， 获得相同的培养条件。
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活力强，移种至发酵后能够迅速生长，迟缓期短。
一、种子制备工艺及生产操作过程
种子制备分实验室种子制备和生产车间 种子制备两个阶段。
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种子制备工艺
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养） 种子的扩大培养
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种子罐接种方法： 1、压差法（孢子悬液接种） 2、注射法 3、摇瓶直接进罐法 发酵罐接种方法： 1、压差法（种醪接种）
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种子培养注意事项
• • • • • • • • • 1、严格无菌操作，避免染菌。 2、培养基、器皿、设备消毒灭菌要彻底。 3、保持环境卫生，防止杂菌滋生。 4、斜面菌种移接限三代以内。 5、培养工艺要因菌种而异。 6、加强培养工艺条件因素控制。 7、采取措施保持优良菌种的性能，防止死亡和变异。 8、及时对退化的菌种进行分离纯化和复壮。 9、压差移种时要防止接收罐表压降到零，以免染菌。
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二、种子罐培养过程中的影响因素
• 1、原料 • 2、培养条件（温度、PH、通气量、搅 拌）
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• 原料 一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养 基， 在营养上要易于被菌体直接吸收利用，营养成分 要适当的丰富和完全，氮源和维生素含量较高，这样 可以使菌丝粗壮并具有较强的活力； 另一方面，培养基的营养成分要尽可能地和发酵 培养基接近，以适合发酵的需要，这样种子一旦移入 发酵罐后就比较容易适应发酵罐的培养条件。
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种子质量的控制措施
1、菌种的稳定性检查 2、适宜的生长环境（营养、温度、湿 度、通气量） 3、种子无杂菌检查
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生产发酵罐的无菌接种技术
生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：
种子罐接种：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种 入一个种子罐； 发酵罐接种：从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
微生物制药工艺
第一章 种子的扩大培养
菌 种： 用于发酵过程作为活细胞催化剂 的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌 和霉菌四大类。 种 子：是指由菌种及其生长基质组成的 繁殖材料。
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种子培养过程
种子培养：是指提供给种子适宜的生长繁 殖条件，使种子能迅速生长成合格的菌体的过 程。一般包括孢子制备和菌丝种子制备两个过 程。
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种龄 种龄——种子罐中培养的菌体开始移入下
一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
选择适当种龄的菌种接种十分重要
通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数期，且培养 液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。过于年轻的种 子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、发酵周期延 长、产物开始形成的时间推迟，造成异常发酵的情况。过 老的种子会引起生产能力下降，菌体过早自溶。
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
实验室种子制备阶段： • 琼脂斜面 • 固体培养基扩大培养 • 摇瓶液体培养 生产车间种子制备阶段：
种子罐扩大培养
种子的扩大培养
1、实验室种子制备
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长 繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子， 孢子可直接作为种子罐的种子；这样操作简 便，不易污染杂菌。
种子质量的判断
1、细胞或菌体 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等） 单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况 和内含物情况好。 2、生化指标 通常测定的参数有： 1）pH 2）培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量变化 3）其它参数，如某种酶的活力 如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系，可通过 测定种子液中淀粉酶的活力判断种子质量。 3、产物生成量 在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产 物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。
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接种量
接种量——是指移入的种子液体积和接种后培养液 体积的比例。 接种量的大小取决于生产菌种在发酵中生长繁殖 的速度。
大多数抗生素发酵的最适接种量为7～15%，有 时可增加到20 ～25%；而由棒状杆菌生产谷氨 酸接种量只需1%。 除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的 各阶段接种量一般均需0.5～10%的接种量。
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问题分析及处理手段
• 一、孢子培养过程中的影响因素 • 1、原材料质量 • 2、培养条件（温度、湿度、通气量） 3、斜面冷藏时间 • 4、孢子龄 • 5、接种量
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原材料质量
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现 象，其主要原因是原材料质量波动。
如： 四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的麸皮， 原材料质量的波动，起主要作用的是 因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量均有 一定影响。 其中的无机离子含量不同。如微量元 制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同， 素 Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的 孢子质量也不同。 形成。磷含量太多或太少也会影响孢 蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）对孢子影响也不同。 子的质量。 水质的硬度、污染程度对生产均有影响 种子的扩大培养
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• 发酵工业的“三先天”条件（孢子或菌丝培养阶段）： 1、菌种质量； 2、培养基原料； 3、无菌状态。
发酵工业的“四后天”条件（种子培养阶段）： 1、温度； 2、pH值； 3、通气量； 4、搅拌。
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三、常见问题及处理手段 1. 菌种生长发育缓慢或过快 ⑴ 孢子质量； ⑵ 原料质量； ⑶ 种子罐培养条件； ⑷ 供氧不足； ⑸ 罐温偏低； ⑹ [Fe+]过高； ⑺ pH偏低。 一旦出现这些情况，应注重调整好培养条件。
早自溶，效价降低等。
一般需保证充足的通气
斜面外观
上部稀薄，下部稠，略黄 上部薄，中部均匀，发白 一片白，孢子丰富，稍皱
相对湿度
16.5～19 25～36 40～45
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培养时间和冷藏时间
（1）培养时间
• 一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进 入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力 的下降。 • 措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正 常的阶段终止培养。
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2. 菌丝结团 概念：在液体培养基中，繁殖的菌丝并不分散舒展 而聚集成团状，外观呈白色小颗粒，成为菌丝团。 ⑴ 通气不良，搅拌效果差，溶氧浓度不足； ⑵ 原料质量差或灭菌效果差，导致培养基质量下降； ⑶ 接种的孢子或菌丝保藏时间长而菌落数少，泡沫 多。
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•
培养条件
培养条件对种子罐培养过程中的影响主要集中在以下几方面： ① 温度——最适温度20～40℃。 ② pH值——大多数为pH4～9，保生长，防杂菌污染。 ③ 通气量——不同时期需氧量不同，一般前期需氧量少， 后期需氧量多，应适当增大供氧量。 ④ 搅拌——控制搅拌转速，确保溶氧均匀，利于种子的培 养。也可避免菌丝结团、粘壁等现象发生。
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷 冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜 面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩 大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
种子的扩大培养
种子扩大培养的目的与要求：
种子扩培的目的： 接种量的需要、菌种的驯化、缩短 发酵时间、保证生产水平。 种子的要求：
生理状况稳定。 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。 无杂菌污染。 保持稳定的生产能力。 种子的扩大培养
如：柠檬酸生产的制种，用麸皮培养基产 生大量孢子直接用于种子罐接种。
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• 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇 瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶中，恒 温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 • 如：用灰色链霉菌生产链霉素 • 用卡那链霉菌生产卡那霉素 • 对于不产孢子的细菌，生产上一般采用将试管斜面菌 种接入茄瓶斜面或摇瓶培养。 如：谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸
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采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高 峰的时间，使产物的形成提前到来。 近年来，不少厂家以加大种子量及采用丰富培养基作为获 得高产的措施；有的产品采用两个种子罐接一个发酵罐的双种 法。 如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8%，且 达到产量高峰的时间提前。 但如果接种量过大，往往使菌体生长过快、培养液黏度增加， 造成溶氧不足，从而影响产物的合成。 如由嗜碱芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的发酵，1%接种量产酶 活最高，在0.5～4%之间虽有差别，但影响不大；如超过4%则 酶产量明显下降。 种子的扩大培养
（2）斜面冷藏时间
• 斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。 • 如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4˚C冰箱保存，发现冷藏 7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。 • 冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。 • 如在链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏2个月后的发酵单位比冷藏1 个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。
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移种方式：
wk.baidu.com种子罐1
②
①
发酵罐1
① ④
③
发酵罐2
种子罐2
1）单种 2）双种 3）倒种 4）混种
种子的扩大培养
• 1）单种：一个种子罐接种到一个发酵罐中。 • 2）双种：为加大接种量，两个种子罐接种到 一个发酵罐中。 • 3）倒种：种子罐染菌又无备用种子时或种子 质量不理想可采样倒种法，以适宜的发酵罐倒 出部分给另一发酵罐。 • 4）混种：一部分种子来源于种子罐，一部分 来源于发酵罐。
发酵级数的确定
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级 种子罐开始计算发酵级数。
种子的扩大培养
确定种子罐级数需注意的问题
种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减 少染菌机会； 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 降低发酵罐的生产率，增加染菌机会；
虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而 定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种 子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的 繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
培养条件
1）温度
量有较大影响。一般湿度小，生长快；湿度大， 如 ：土霉素生产种子，在高于37℃培养时，孢子接入 生长慢。 不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的 3）通气量 发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过
2）湿度
影响
温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响。温度对多数 微生物的斜面孢子质量有显著影响。温度过低生长缓慢； 温度过高孢子早熟，易老化，接入发酵后就会出现菌丝 对糖、氮利用缓慢，氨基氮回升，发酵产量降低等，甚 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质 至引起菌丝过早自溶。