细胞培养工作记录

陈涛、泌尿外科、肾脏肿瘤、男、有组织-80℃冻存记录

器材：

离心管架、离心管，一次性用吸量管，电动移液枪，移液枪，大枪头，酒精喷壶，75%酒精，灭菌后的剪刀、镊子，一次性用吸管，1640液，TIL培养液，培养皿，24孔培养板，冻存管2个。

流程：

1.先把所有需要用到的物品耗材准备好，放置好，装枪头用大烧杯套入一层黄色塑料袋，工作人员戴好无菌手套跟口罩。安全柜里应放好2个培养皿（打开的），里面分别放入75%酒精（润洗剪刀镊子）、1640液（润洗剪刀镊子）。

2.先剪下2块组织放入冻存管内，然后将剩余组织放入1640液中清洗，上下颠倒数次，弃去上清液，重复此操作2次。

3.将清洗后的肿瘤组织倒入一块培养皿中，用剪刀先去掉血管、血块、脂肪组织等，之后将需要的组织剪碎。

4.往24孔板中的其中6个孔每孔加1ml培养基。并将剪碎的组织用一次性吸管吸入并均匀加入到含培养基的每个孔中，之后在培养板上写上病人姓名、性别、年龄、组织部位、处理时间等信息，并在冻存管上写上相同信息。

5.培养板放在倒置显微镜下观察，看组织块是否分布均匀，之后等待数日后进行补液换液等。冻存管先放到-20℃冰箱中保存，处理完剩余步骤马上放-80℃冰箱中的冻存盒中保存。

6.操作完成后，处理剩余物品，操作顺序为：①先把培养板放入培养箱（培养箱内有装有灭菌水的盘子，保证生长所需湿度，37℃，5%CO2），再把冻存管放到-℃冰箱暂存。②把培养基放到4℃冰箱中，然后把1640液也放入4℃冰箱，再拿出75%的酒精，放好，之后倒掉废液，扔掉用完的移液管、一次性吸管，并将移液枪放好。③最后处理废弃组织，把装有酒精、1640液的培养皿合好丢进套有塑料袋的烧杯中，之后再套上一层袋子，绑好扔掉，处理完所有物品后，操作台里喷上酒精，往擦手纸上喷上酒精对工作台面进行仔细擦拭，之后，开上紫外照30min，一般情况下，如果刚好需要进行换液跟处理标本，应当先换液再处理样本。

TILs 原代培养

2015.12.01 4:30 pm。为处理组织的过程，未消化。

TILs 第一次补液

2015.12.04 4:30 pm。准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头等。补液，往培养板加入1ml培养基即可。

TILs 第二次换液

2015.12.17 17:20pm 换液。准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头等。吸去培养板内的培养基，大概每个孔吸去1ml，之后直接补充1ml培养基。TIL细胞开始长出来，形态典型（豆芽状、哑铃状、蝌蚪状）

TILs 第三次换液

2015.12.19 18:00pm 换液、分孔。此时，其中几孔培养基开始变黄，细胞长得比较多，可以分孔了，本次分孔为1分2.准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头等。吸取一半上清液，吹打混匀，细胞少的换液，长得好的分孔。

TILs 第四次换液

2015.12.22 18:00换液、分孔。此时，分孔后的细胞依然长得比较满，继续分孔。本次分孔为1分2.准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头等。吸取一半上

清液，吹打混匀，细胞少的换液，长得好的分孔。

TILs 第五次换液

2015.12.24 16:10pm 换液、分孔。分孔后一共有12孔，分完孔继续观察细胞生长状况。准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头等。吸取一半上清液，吹打混匀，细胞少的换液，长得好的分孔。

TILs 第六次换液

2015.12.26 14:50am 换液、过滤，转6孔板。每4孔细胞转1个大的孔，之后继续培养。准备好准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头、6孔板。先吸去上清，每孔吹打混匀后，每4小孔合并成1个大孔，之后每个打孔补3ml培养基，继续培养并观察，写好病人信息。

第七次换液

2015.12.29 9:10am 6孔板细胞扩瓶（一共3瓶），每个大孔吸到1个50ml培养瓶内，继续培养。准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头、5ml培养瓶等。3个孔先吸去上清液，吹打混匀后将细胞液吸到培养瓶内，每瓶补充15ml培养基，之后写上病人信息，放培养箱中培养，继续传代，继续换液1-3次即可冻存，视细胞生长状况。

第八次换液

2015.12.31 15:00pm 换液。准备好移液枪、加样枪、培养基、枪头。用移液枪吸去一半上清液，上下左右吹打混匀细胞后，补充7ml培养基，放培养箱继续培养。

第九次换液

2016.01.02 9:40am冻存细胞（一共6管（分别为24.46M，22.34M，21.08M))（标记12.17，未写名字）。冻存过程：将培养瓶内的培养基，先吹打混匀，将所有贴壁细胞尽量吹打下来，再将培养基吸入离心管，然后，把培养板中同一序号的培养基吸去上清并吹打混匀，之后分别吸入到3个15ml离心管中，吸取30ul 左右细胞液到EP管内，做好标记，用来细胞计数用。配平后，1500rpm离心3—5min，然后，弃去上清，弹拨混匀沉淀后每个离心管内加入1ml冻存液，吹打混匀后将冻存液吸入到冻存管内，写上病人相关信息。冻存管（一共6个）放入程序降温盒中再放入4℃冰箱中，先进行细胞计数。细胞计数过程参考欧阳水平标本处理过程。本次细胞计数结果为24.46M，22.34M，21.08M。