现代色谱
现代色谱
现代色谱分析1、色谱流出曲线图能说明哪些问题?①根据色谱峰的个数，可判断样品中所含组分的最少个数。
②根据色谱峰的保留值（峰位），可进行定性分析。
③根据色谱峰的面积或峰高，可进行定量分析。
④色谱峰的区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。
⑤色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。
2.根据Van Deemter议程式, HPLC提高柱效的方法有哪些?或 HPLC法降低板高的主要途径有哪些？①采用粒径小、窄粒度分布的球形固定相，首选化学键合相，用匀浆法装柱。
②采用低粘度流动相，低流速（1mL／min）③柱温一般以25~30℃为宜。
太低，则使流动相的黏度增加，温度高易产生气泡。
用不含有机溶剂的水溶液为流动相的色谱法（如IEC、IC）可按需升温。
3.什么是正相色谱?什么是反相色谱?HPLC常用反相色谱,它最常用的固定相和流动相是什么? 各适用于分离哪些化合物？①正相色谱：流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法。
反相色谱：流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法。
②反相固定相：C18、C8 流动相：甲醇、乙腈、水③适用于分离非极性和极性较弱的化合物。
4. 一个好的检测器应具备什么条件?HPLC中可使用的检测器有哪些?你在实验中用过哪些检测器,它们有何特点(包括使用中应注意的问题, 适用于何种物质的检测)?属于哪种类型? 灵敏度高、噪音低、线性范围宽、重复性好、适用化合物的种类广泛等性能。
HPLC中可使用的检测器:紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器、蒸发光散射检测器、化学发光检测器。
紫外检测器特点：①灵敏度高，噪声低。
②不破坏样品，能与其他检测器串联，可用于制备色谱。
③对温度及流动相流速波动不敏感，可用于梯度淋洗。
④属浓度型检测器。
紫外检测器的应用范围：主要用于检测具有π-π或p-π共轭结构的化合物。
如芳烃与稠环芳烃、芳香基取代物、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羧酸与羰基化合物等。
5.流动相和分析液都不能有气泡,为什么?常用的除气方法有哪些? 流动相和分析液都不能有不溶物,为什么?如何处理?⑴因为溶解在溶剂中的气体会在管道、输液泵或检测池中以气泡形式逸出，影响正常操作的进行。
色谱分析(中国药科大学)第5章现代色谱技术简介
第五章现代色谱技术简介第一节高效毛细管电泳分析法（high performance capillary electrophoresis, HPCE）一、概述1、发展1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳——第一次的自由溶液电泳。
1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳分析法。
2、特点①仪器简单、易自动化②分析速度快、分离效率高③操作方便、消耗少④应用范围极广二、高效毛细管电泳理论基础1、高效毛细管电泳(HPCE)基本原理电泳：带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度。
当带电离子以速度v在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。
电场力：E F qE = 阻力：F fv = 故：qE fv =q -离子所带的有效电荷；E -电场强度；v -离子在电场中的迁移速度；f -平动摩擦系数 ( 对于球形离子：6f πηγ=,γ-离子的表观液态动力学半径；η-介质的粘度)。
所以，迁移速度：6πqE qv E f γη== 淌度（mobility ）μ ：单位电场强度下的平均电泳速度。
6πv q E μγη== 淌度不同是电泳分离的基础。
2、 电渗现象与电渗流(1) 电渗流现象当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。
电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF ）。
(2)HPCE中电渗流的大小与方向电渗流的大小用电渗流速度V表示，取决于电渗淌度 和电场强度E。
电渗流电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：①内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；②内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；③石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；(3)HPCE中电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。
现代仪器分析色谱分析
进样系统
载气系统
色谱柱
检测器
记录、数据 处理系统
第15页，共35页。
气相色谱仪的流程图
第16页，共35页。
1)载气系统
气源、气体净化、气体流速控制和测量
1. 常用的载气有： 氢气、氮气、氦气、氩气 2. 净化干燥管: 活性炭、硅胶、分子筛等（除去载气中的 水分、氧等杂质） 3. 减压阀、稳流阀：载气压力和流速控制（载气流要稳定 ）
死时间t0 (tM)
：空气、甲烷等不被固定相吸附或溶解的惰性物质流经柱的时间 。
调整保留时间tR’ ：由于溶解或吸附于固定相，比不溶解或不被吸附的组分在色谱中多
t’R= tR-tM
滞留的时间。
第5页，共35页。
保留体积 VR
死体积V0
调整保留体积 VR’
VR tR Fc V0 tM Fc
VR' tR Fc VR V0
相色谱的特点之一。
C、应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定、可调、耐腐蚀等
第28页，共35页。
2) 梯度淋洗装置
定义：流动相中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过 程中按一定的程序连续改变流动相的配比和极性，以提高分离效 果。
优点：分离时间缩短，分辨能力增加，峰形改善
第29页，共35页。
高压梯度:
指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平
衡时，在固定相与流动相中的质量比——更易测定.
k ms mM
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二、气相色谱法，GC
第11页，共35页。
1、概述
气相色谱-----是用气体作为流动相的一种色谱法。
根据固定相状态的不同，可分为：
气固色谱：多孔性固体为固定相，如分子筛、硅胶、活性炭
现代色谱分析讲稿1
此外还有： 亲和色谱法(affinity chromatography)：专属亲和力 手性色谱法(chiral chromatograohy)：手性固定相 毛细管电泳法(capillary electrophoresis)：电泳淌度
3．按固定相的外形分类
固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱，它又可分 为填充柱色谱和毛细管色谱；固定相呈平板状的色谱 法，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。
§1-4 色谱法分析的基本原理
色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完 全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两 相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是 两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是 不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为 决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和 动力学两方面来研究色谱行为。
设流动相在柱内的线速度为u ，组分在柱内线速度为 us，由于固定相 对组分有保留作用，所以us＜u．此两速度之比称为滞留因子R。
us tM R u tR
R若用质量分数表示，则：
R
nm 1 1 nm ns 1 ns 1 k nm
对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为
色谱法分类
1．按两相状态分类
气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC），根据固定相是固体 吸 附 剂 还 是 固 定 液 （ 附 着 在 惰 性 载 体 上 的 一 薄 层 有 机化合 物 液 体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）．液体为流 动相的色谱称液相色谱（LC）。同理，液相色谱亦可分为液固色谱 （LSC）和液液色谱（LLC）．超临界流体为流动相的色谱称为超 临界流体色谱（SFC）。
现代色谱分析—液相色谱在中药分析中的应用论文
现代色谱分析—液相色谱在中药分析中的应用论文近年来，随着现代科学技术的发展以及人们对中药的深度研究，液相色谱成为了中药分析中常用的一种技术手段。
液相色谱作为一种高效、准确、快速、灵敏的分析方法，已经在中药分析领域取得了广泛的应用和有重要的意义。
液相色谱是以液相为固定相，以其种类及其物理化学特性与柱填充物的物理化学特性相适应的固定相为动相，通过色谱柱的固定相与液相之间的气固界面相互作用，对物质进行分离的一种色谱分析技术。
在中药分析中，液相色谱的应用主要包括高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱（UPLC）。
首先，液相色谱可以用于中药中活性成分的分离和定量分析。
中药复杂的成分成分组成，不同的成分对人体的药效也不同。
通过液相色谱技术，可以将中药中的不同成分进行分离，并通过检测器准确地测量出各个成分的含量。
这对于深入了解中药的药理学作用以及指导合理用药具有重要意义。
另外，液相色谱还可以用于中药中新药物的发现与研究。
中草药是中医药领域非常重要的一个组成部分，其中很多草药中存在着未知的化学成分，这些成分可能隐藏着新的药理学活性。
液相色谱配合质谱等分析技术可以对中草药进行全面的分析，快速地发现中草药中的潜在新药物，并对其进行深入研究。
综上所述，液相色谱在中药分析中具有非常重要的应用价值。
它可以对中药中的活性成分进行分离和定量分析，帮助我们深入了解中药的药理学作用。
同时，液相色谱还可以用于中药中有害成分的检测，保障中药的质量安全。
此外，液相色谱还可以用于中药中新药物的发现与研究，对推动中医药现代化起到积极作用。
因此，液相色谱在中药分析中的应用有着广阔的前景，并且仍然有待进一步的发展和完善。
现代色谱理论
第二章现代色谱理论色谱法(Chromatography)是一种分离分析方法。
它是利用各物质在两相中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的。
俄国植物学家M.Tswett于1906年首先提出色谱法。
色谱法分类流动相名称固定相名称气体气相色谱固体气固色谱液体气液色谱液体液相色谱固体吸附剂液固色谱液体液液色谱键合固定相键合相色谱多孔固体尺寸排阻色谱离子交换剂离子交换色谱纸纤维中的水纸色谱固体吸附剂薄层色谱超临界流体超临界流体色谱类似LC 超临界流体色谱按分离机理：吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱法或尺寸排阻色谱（选择渗透）亲和色谱法第一节色谱法中常用参数一、色谱流出曲线1保留值221ln 22σ=W σ4=bW 死时间t 0保留时间t R调整保留时间t’R ：t’R =t R -t O死体积，保留体积，调整保留体积2 区域宽度半峰宽峰底宽标准偏差σ：0.607倍峰高处的色谱峰宽度的一半3 容量因子ｋ’一定的温度、压力条件下，分配达平衡时，组分在两相中的总量之比称分配比k ′，又称容量因子。
k ′与K （分配系数）的关系为：相对保留值 ：4 柱效率塔板理论理论塔板数可按下式计算：有效塔板数ｎeff有效塔板高 m s W W K ==组分在流动相中的总量组分在固定相中的总量'β''K V V K V W V W c c K s m s m m s m s ====βK V V K k m s =='')1()2(')1(')2(')1()2(1,2R R V V k k K K ===αnL H =22122121)(54.5)(54.5)(54.5W d W V W t n R R R ===222)(16)(16)(16b R b R b R W d W V W t n ===H eff ＝L/ｎeff =H[(1+k’)/k’]2表示色谱流出的曲线可以近似地采用对称的Gauss 正态分布曲线来描述。
现代色谱技术在药物分析中的应用
现代色谱技术在药物分析中的应用近年来，随着药物研发和制造的不断发展，药物分析变得越来越重要。
而现代色谱技术作为一种高效、准确的分析方法，被广泛应用于药物分析领域。
本文将探讨现代色谱技术在药物分析中的应用，并介绍其原理和优势。
一、高效液相色谱（HPLC）高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的色谱技术，它通过将样品溶解在流动相中，在固定相上进行分离和分析。
HPLC在药物分析中的应用非常广泛，可以用于分离和检测药物中的各种成分，如活性成分、杂质和降解产物等。
其高分辨率和高灵敏度使得HPLC成为药物分析中不可或缺的工具。
二、气相色谱（GC）气相色谱（Gas Chromatography，GC）是另一种常见的色谱技术，在药物分析中也得到了广泛应用。
GC通过将样品蒸发成气体，然后在固定相上进行分离和检测。
与HPLC相比，GC在分析挥发性和半挥发性化合物方面具有更好的分离效果。
因此，在药物分析中，GC常被用于分析药物中的挥发性成分、残留溶剂和有机杂质等。
三、超高效液相色谱（UHPLC）超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC）是近年来发展起来的一种新型色谱技术。
与传统的HPLC相比，UHPLC具有更高的分辨率、更短的分析时间和更高的灵敏度。
在药物分析中，UHPLC可以更快速地分离和检测药物中的成分，提高分析效率和准确性。
四、固相微萃取（SPME）固相微萃取（Solid Phase Microextraction，SPME）是一种新兴的样品前处理技术，广泛应用于药物分析中。
SPME通过将固相萃取材料直接暴露在样品中，通过吸附和解吸的过程，实现对样品中目标化合物的富集和分离。
SPME具有操作简便、灵敏度高和样品损失小等优点，被广泛应用于药物代谢动力学和药物残留分析等领域。
现代液相色谱技术导论
现代液相色谱技术导论
现代液相色谱技术是一种高效、灵敏、准确的分析技术，它可以
用来分离、鉴定和定量分析混合物中的各种成分。
它是一种综合
性的分析技术，可以用来分析复杂的混合物，并且可以在短时间
内完成分析。
现代液相色谱技术的基本原理是将混合物中的各种成分分离出来，然后用检测器测量每个成分的浓度。
液相色谱技术的基本组成部
分包括柱、检测器、泵和计算机。
柱是液相色谱技术的核心部分，它由一种吸附剂组成，可以将混合物中的各种成分分离出来。
检
测器是用来测量每个成分的浓度的，它可以根据每个成分的特性
来测量它们的浓度。
泵是用来将混合物送入柱中的，它可以控制
混合物的流速，从而控制分离的效果。
计算机是用来控制整个液
相色谱系统的，它可以控制柱、检测器和泵的运行，并且可以将
测量的数据进行处理和分析。
现代液相色谱技术的应用非常广泛，它可以用来分析各种混合物，如药物、食品、环境样品等。
它可以用来分离、鉴定和定量分析
混合物中的各种成分，并且可以在短时间内完成分析。
此外，它
还可以用来检测混合物中的有毒物质，从而为食品安全提供可靠
的保障。
现代液相色谱技术的发展也受到了许多因素的影响，如柱材料、
检测器、软件等。
柱材料的发展使得液相色谱技术可以分离更复
杂的混合物，检测器的发展使得液相色谱技术可以检测更灵敏的
成分，软件的发展使得液相色谱技术可以更快地完成分析。
综上所述，现代液相色谱技术是一种高效、灵敏、准确的分析技术，它可以用来分离、鉴定和定量分析混合物中的各种成分，并且可以在短时间内完成分析。
现代色谱分析技术发展及应用
现代色谱分析技术发展及应用色谱分析技术是一种重要的分离和分析方法，在各个领域具有广泛的应用。
随着科学技术的发展，色谱分析技术也不断地得到改进和完善。
本文将就现代色谱分析技术的发展历程以及应用领域进行探讨。
一、色谱分析技术的发展历程色谱分析技术起源于20世纪初，最早的色谱法是在液体中通过旋塞柱进行分离的，被称为“旋转色谱法”。
随后，固定相柱的发明推动了色谱分析技术的进一步发展。
20世纪50年代，气相色谱技术的诞生使得色谱分析技术得到了重大突破。
然而，早期的色谱分析技术存在着许多缺点，如分离效率低、分析速度慢等。
为了克服这些问题，人们进行了一系列的改进和创新。
在20世纪60年代，高效液相色谱技术被引入，这种技术在分离效率和分析速度方面较传统的液相色谱技术有了显著的提高。
此外，超临界流体色谱、毛细管电泳等新型色谱分析技术的出现也为色谱分析的研究和应用带来了新的思路和方法。
二、现代色谱分析技术的分类及原理现代色谱分析技术主要可以分为气相色谱、液相色谱和电泳三类。
下面将分别介绍这三种技术的原理和特点。
1. 气相色谱（Gas Chromatography，GC）气相色谱是利用气体作为载气相和样品分子之间的分隔介质，将混合物中的分离成分分开的色谱技术。
它主要包括样品的气相进样、气相传递和色谱柱的分离。
气相色谱具有分离效率高、分析速度快和灵敏度高等优点，被广泛应用于气体组分分析、环境检测、食品安全等领域。
2. 液相色谱（Liquid Chromatography，LC）液相色谱是以液体作为流动相和样品分子之间的分离介质的色谱技术。
常见的液相色谱包括高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC）。
液相色谱具有高分离度、适用范围广、操作简便等特点，广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。
现代色谱分析讲稿7HPCE
4-1 高效毛细管由泳的基本原理
1.电泳与电渗流
电泳 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作 用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象， 称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不 同可实现分离。 在电场的影响下，带电荷的质点受到的力Fe，等于其净电荷q 与电场强度E的乘积，即Fe = q×E。电场强度E以每单位长度所加 的电压U来表示，即E=U/L，其中L是毛细管长度。电场力促使带 电质点向两极移动，质点在移动过程中，也受到一种与电场力方 向相反的阻滞力 Fd ，阻止其移动，此阻滞力与质点的电泳速度υ 成正比，由下式给出：
当在毛细管两端加有电场时；扩散层内可迁移的 阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的，因此， 在缓冲液中的液体也随迁移着的阳离子一道，向阴 极移动，形成一种液流，称之为电渗流 （electroosmotic flow，EOF），它是一种电泳驱动 力。在双电层内，EOF总是向双电层内抗衡离子方 向迁移，穿过双电层的电势下降的程度受电渗流速 度所控制。电渗流的线速度υeof ，可以定义为：
HPCE不同于经典的区带电泳，有如下特点：
（1）它是在内径（10～200）μm的石英毛细管中进行的，在毛细管 中的散热较好，沿着管截面的温度梯度很小，因此，可以提高加在毛 细管两端的电压，所加电压可高达几十千伏。 （2）高效，理论塔板数为几十万至几百万／米。
（3）快速，一般几十秒至十几分钟就能完成分离。 （4）微量，取样量少，有时只需几个纳升（nL，10-9L），流动相只 需几毫升。 （5）自动，是目前自动化程度最高的分离方法。 （6）经济、洁净。
分离过 程：
子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性 粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相 互分离。
现代色谱分析边缘效应名词解释
现代色谱分析边缘效应名词解释现代色谱分析边缘效应的意思：在平面色谱法中，同一块色谱板基线上不同位置点上同一种物质，而产生边缘比移值大于中间比移值的现象。
他是因为边缘的溶剂蒸发比中间的快，从而加速了边缘的溶剂迁移，让边缘比移值变大。
色谱又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。
研究植物色素分离时提出色谱法概念；他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。
按光谱的命名方式，这种方法因此得名为色谱法。
以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。
在色谱法中，静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相。
现代色谱法分析技术—高效液相色谱法(分析化学课件)
分析乙苯及二甲苯三个异构体的样品，用归一化法定量结果如下，计 算各组分百分含量。
组分 峰面积A 重量校正因子
乙苯 120 0.97
对二甲苯 75 1.00
间二甲苯 140 0.96
邻二甲苯 105 0.98
（乙苯21.15％；对二甲苯17.50％；间二甲苯31.35％；领二甲苯24.00％）
高效液相色谱定量分析方法 ——内标法
高效液相色谱定量分析方法
目录
01 面积归一化法
02 外标法
03 内标法
高效液相色谱定量分析方法
什么是定量分析方法
实质是搞清楚样品里各组分含量有多少的问题 。
高效液相色谱法：能将组分分离后再分析含量 。
高效液相色谱定量分析方法—案例
怎样测出食品中的添加剂是符合标准的呢？
高效液相色谱定量分析方法—案例
高效液相色谱定性分析方法
目录
01 高效液相色谱法定性分析原理
02 高效液相色谱法定性分析方法
高效液相色谱定性分析方法
天麻为天麻片的主药，怎么鉴别 天麻片里是否真正含有天麻呢？
功效 祛风除湿 舒筋通络 活血止痛
医学用途 治疗肢体拘挛 治疗手足麻木 治疗腰腿酸痛
高效液相色谱定性分析方法 01.定性分析原理
高效液相色谱定性分析方法
课后思考
复方感冒片里主要有伪麻黄碱、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、右美沙芬这四种成份，请你结合
前面所学知识，说一说如何采用高效液相色谱法定性鉴别这四种成份呢？ 如下图所示，这个样品中是否含有这四种有效成份呢？
高效液相色谱法概念
高效液相色谱法概述
一、高效液相色谱法简介
液相色谱分析是在经典的液体柱色 谱基础上，引入了气相色谱的理论；
现代色谱分析
（二）有效峰数（effective peak number,ENP)
ENP RZ 1 Z 1
式中，RZ 1 Z为含有Z 1和Z个碳的正构同系物的分离度
ENP的含义：在含有Z与Z+1个碳的
正构同系物的色谱峰间能容纳的色 谱峰数。 ENP越大，色谱柱的分离性能越好。
例如：在一个20m0.24mm内径的WCOT 柱，固定液为Carbowax 20M，柱温80℃， 测定正构醇同系物得：正戊醇、正己醇 和正庚醇的保留时间分别为：554.0， 870.6和1459.2s，色谱峰宽分别为：7.54， 12.03和20.40s。 用正戊醇、正己醇的数据计算ENP
Vm KVs
5．死体积 (dead volume；V0)
V0＝t0 Fc
6．调整保留体积(adjusted
retention
volume；VR' )
V VR V0 t Fc KVs
' R ' R
' 与流动相流速无关 VR
7．相对保留值(relative
retention；r)
规定，所以不便于比较，所以， 常用分离数（SN或TZ）衡量色 谱柱和薄层的分离性能。
色谱图示意图
3．色谱峰(Peak)
是流出曲线上的
突起部分。
正常色谱峰为对称形正态分布曲线。 不正常色谱峰有两种：拖尾峰(Tailing Peak)和前延峰(Leading Peak)。 色谱峰的对称与否可用对称因子fs (symmetry factor) ，或叫拖尾因子(tailing factor)，来衡量。 对称因子在0.95～1.05之间的色谱峰为对 称峰；
图示
现代色谱技术与药物分析
现代色谱技术与药物分析现代色谱技术与药物分析1.概述色谱法是一种高效能的物理分离技术，它利用混合物中的各组分在互不相容的两相（固定相和流动相）之间的分配差异而使混合物得到分离的一种方法。
从1903年Tswet发表了吸附色谱分离植物色素的论文至今，色谱技术已近百年的发展历史。
特别是60年度现代液相色谱技术的问世，使其在生命科学、药物化学、食品卫生、环境化学等诸多领域得到了广泛的应用。
经过30多年的发展，现代高效液相色谱技术得到了不断的完善和改进，在输液泵、检测器、色谱柱及数据控制和处理系统等方面采用了许多专利技术，使泵的稳定性和重复性、检测器的灵敏度和检出能力、色谱柱的分离效能和应用范围及数据处理软件的智能化得到了很大的提高。
近年来多种高新技术的引用，各类色谱仪器在性能、结构和技术参数等各方面都有了极大的提高。
目前比较成熟的色谱仪器主要是气相色谱和高效液相色谱两大类。
下面将对应用于药物分析中的几种液相色谱进行逐一的介绍。
2.高效液相色谱高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，简称HPLC)是在20世纪70年代在经典液相柱色谱的基础上结合气相色谱的理论与技术而发展起来的一种重要的分离分析方法。
它具有高效、快速、高灵敏度、色谱柱可以反复使用、分离出的组分易收集、适用范围广等优点，在药物的分析中发挥着重要的作用。
HPLC在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定。
在HPLC法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，可用于药物的鉴别。
如在中国药典收载的药物利福平的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致由于HPLC分离效能及灵敏度高，在药物的杂质检查中被广泛应用，主要用于药物中有关物质的检查。
现代色谱分离技术
洗脱 再生
一般先用水洗，再用梯度递增的乙醇溶液进行洗脱，并控制洗 脱液的用量与流速，使提取液由上而下通过树脂柱。收集、合 并洗脱液，减压蒸馏，回收溶剂至干，低温真空干燥，得精制 产品。
95%乙醇洗脱至无色，再用2%盐酸浸泡，用水洗至中性， 再用2%NaOH浸泡，再用水洗至中性。
(四) ODS反相柱层析
123456 7
小极性的组分先被洗脱下来 大极性组分后被洗脱下来
（二）凝胶柱层析
1 原理
2 凝胶层析中常用的凝胶
葡聚糖凝胶 （Sephadex）
聚丙烯酰胺凝胶
琼脂糖凝胶
3 凝胶柱的使用
溶胀
装柱
上样
洗脱
羟 将 湿丙层法基析上葡 柱 样聚垂：糖直凝固胶定（在铁Se架ph上ad，ex打L开H-柱20下）口为开干关粉。，将装溶柱胀前好 量 的好凝打柱胶开体 放层积在析，烧柱再杯的根中下据，口凝使开胶凝关的胶，吸表放水面出量的凝计水胶算层柱干与面重凝上，胶的体称多积重余相后溶等足液。， 量 用 使 •控用玻液制有璃面流机 棒 与速溶搅凝，剂匀胶过（凝表快常胶面或用液相过氯，平慢仿顺齐影：玻。响甲璃分醇棒离灌=效1入：果柱1。）内溶。胀此。时柱下口一 边 沉 品 •流排降慢出水，慢将液， 逐 渗样分上步入品步口形凝加收一成胶在集边凝内凝，加胶。胶分入柱当表析搅。慢面、匀当慢，合的到渗打并凝达入开。胶所凝下，需胶口可凝的开见胶样关凝高品，胶度溶控连时液制续，面流均立与速匀即凝，地关胶使柱样 闭 面下相口平， 齐使时凝，胶关完闭全下沉口降，。完成上样。然后在凝胶柱面上加一 层（3—5cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。
•打开色谱柱下端活塞，控制流速， 等份收集洗脱液，也可用自动收 集器收集。
•通过上端加压或者下端减压可以 提高洗脱速度，但是可能会降低 塔板数影响分离效果。
17现代色谱基本理论
续前
保留体积V 保留体积VR：从进样开始到组分出现浓度极大点时 所消耗的流动相的体积
VR = t R ⋅ Fc
1 注：VR为定值，与 c无关； R ∝ F t FC
死体积V 死体积V0：不被保留的组分通过色谱柱所消耗的流 动相的体积，又指色谱柱中未被固定相所占据的空 隙体积，即色谱柱的流动相体积（包括色谱仪中的 管路、连接头的空间、固定相颗粒间间隙、以及进 管路、连接头的空间、固定相颗粒间间隙、以及进 样器和检测器的空间）
next
标准差σ 标准差σ：正态分布色谱曲线两拐点距离的一半 σ→对应0.607h处峰宽的一半 σ→对应0.607h处峰宽的一半 注：σ↓小，峰↓窄，柱效↑ 注：σ↓小，峰↓窄，柱效↑高 半峰宽W 半峰宽W1/2：峰高一半处所对应的峰宽
W1 2 = 2.355σ
峰宽W 峰宽W：正态分布色谱曲线两拐点切线与基线相交 的截距
分配系数K 分配系数K ： K = CS Cm
VS t R = t0 (1+ K ⋅ ) Vm
保留因子 容量比，分配比） 保留因子 （容量比，分配比）k：指在一定温度和 因子（ 压力下， 组分在色谱柱中达分配平衡时， 压力下 ， 组分在色谱柱中达分配平衡时 ， 在固定 相与流动相中的质量比——更易测定 相与流动相中的质量比——更易测定
练习
例 ： 在 柱 长 为 2m 的 5% 的 阿 皮 松 柱 、 柱 温 为 1000C，记录纸速度为2.0cm/min的色谱条件下， 记录纸速度为2 cm/min的色谱条件下， 测定苯的保留时间为1 min，半峰宽为0 20cm， 测定苯的保留时间为1.5min，半峰宽为0.20cm， 求理论塔板数。 求理论塔板数。 解： n = 5.54( 1.5 ) 2 =1.2 ×103
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现代色谱分析1、色谱流出曲线图能说明哪些问题?①根据色谱峰的个数，可判断样品中所含组分的最少个数。
②根据色谱峰的保留值（峰位），可进行定性分析。
③根据色谱峰的面积或峰高，可进行定量分析。
④色谱峰的区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。
⑤色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。
2.根据Van Deemter议程式, HPLC提高柱效的方法有哪些?或 HPLC法降低板高的主要途径有哪些？①采用粒径小、窄粒度分布的球形固定相，首选化学键合相，用匀浆法装柱。
②采用低粘度流动相，低流速（1mL／min）③柱温一般以25~30℃为宜。
太低，则使流动相的黏度增加，温度高易产生气泡。
用不含有机溶剂的水溶液为流动相的色谱法（如IEC、IC）可按需升温。
3.什么是正相色谱?什么是反相色谱?HPLC常用反相色谱,它最常用的固定相和流动相是什么? 各适用于分离哪些化合物？①正相色谱：流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法。
反相色谱：流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法。
②反相固定相：C18、C8 流动相：甲醇、乙腈、水③适用于分离非极性和极性较弱的化合物。
4. 一个好的检测器应具备什么条件?HPLC中可使用的检测器有哪些?你在实验中用过哪些检测器,它们有何特点(包括使用中应注意的问题, 适用于何种物质的检测)?属于哪种类型? 灵敏度高、噪音低、线性范围宽、重复性好、适用化合物的种类广泛等性能。
HPLC中可使用的检测器:紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器、蒸发光散射检测器、化学发光检测器。
紫外检测器特点：①灵敏度高，噪声低。
②不破坏样品，能与其他检测器串联，可用于制备色谱。
③对温度及流动相流速波动不敏感，可用于梯度淋洗。
④属浓度型检测器。
紫外检测器的应用范围：主要用于检测具有π-π或p-π共轭结构的化合物。
如芳烃与稠环芳烃、芳香基取代物、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羧酸与羰基化合物等。
5.流动相和分析液都不能有气泡,为什么?常用的除气方法有哪些? 流动相和分析液都不能有不溶物,为什么?如何处理?⑴因为溶解在溶剂中的气体会在管道、输液泵或检测池中以气泡形式逸出，影响正常操作的进行。
①溶剂中的CO2使得电导检测器的背景增大。
②检测池中的气泡，使得信号不稳定，常出现系列假峰（特别是当柱子加温使用时）。
③色谱柱内的气泡，使柱效降低。
④输液泵内的气泡，使活塞动作不稳定，流量变动，严重时无法输液。
脱气方法：用惰性气相（如氦气）驱除溶剂中的气体；加热回流；真空脱气和超声波脱气。
⑵不溶物会堵塞色谱柱。
使用前用0.45um孔径的滤膜过滤。
6．HPLC对流动相有哪些要求？①不与固定相发生化学反应②对试样有适宜的溶解度,使k在 1-10范围内③与检测器相适应④黏度小⑤纯度高，无机械杂质⑥使用前需脱气7ODS是什么?如何制成的，有何特点?ODS是指十八烷基。
将十八烷基氯硅烷试剂与硅胶表面的硅醇基，经多步反应生成ODS键合相。
特点：有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力。
8用ODS柱分析试样中两种弱酸性物质(pKa可能在2-5范围内),以一定比例的甲醇-水或乙腈-水为流动相时,保留时间短,分离度差,应如何改变流动相以改善分离度？答：首先增加水含量，以延长保留时间，提高分离度，如果效果不好，可采用离子抑制色谱法。
用醋酸（盐）或磷酸（盐）等缓冲液，使流动相pH降低至3，如果还不能使保留时间延长，说明酸度较强（pKa<3），则可采用离子对色谱法，用四丁基胺磷酸盐等作离子对试剂，在较高pH下（如pH 5-7）进行分离。
9 简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。
相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别分析对象GC ：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%HPLC ：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%10何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。
优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。
目前常用的Si-O-Si-C 型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。
①非极性键合相：常见如ODS 键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。
11离子色谱法，反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及适用范围有何区别？离子色谱法(Ion Chromatography) ：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。
以电导检测器为通用检测器。
试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。
离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法，也可用于阳离子分析。
反相离子对色谱法(IPC 或PIC) ：反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k 和tR ，以改善分离。
适用于较强的有机酸、碱。
反相离子抑制色谱：在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH 值，抑制组分解离，增加其k 和tR ，以达到改善分离的目的。
适用于极弱酸碱物质（pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物）12试讨论影响根据分离方程式 可知分离度R 受n 、r 和k 的影响，其中n （或H 除了受固定相种类影响外，更主要的是流动相溶剂种类（选择性）的影响，这些因素决定组分与流动相（或固定相）间分子作用力，即选择性k 主要受溶剂强度及混合溶剂配比的影响。
提高分离度：①选择适宜种类和粒度小且均匀的固定相，并填充均匀。
②选择强度适当的流动相，获得适宜的k③试验用选择性不同的溶剂或混合溶剂，提高分离度④还可适当延长柱长或调节柱温来提高分离度。
13试讨论反相HPLC的分离条件的选择。
反相HPLC常用非极性固定相，可以选择键合碳链长度不同或含碳量、覆盖度不同的固定相，还可以选用中等极性甚至极性固定相。
以极性溶剂为流动相，常用水或水-甲醇、水-乙腈。
如果被分离物是弱酸或弱碱，则需选用pH一定的缓冲溶液为流动相，抑制弱酸或弱碱的解离14什么叫梯度洗脱？它与GC的程序升温有何异同？在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成或浓度配比，称为梯度洗提。
程序升温与梯度洗脱的共同点都是为了有效分离样品，但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度。
程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段。
15蒸发光散射检测器的原理及特点是什么？1．ELSD原理恒定流速的色谱仪（高效液相、逆流色谱、高效毛细管电泳等）洗脱液进入检测器后，首先被高压气流雾化，雾化形成的小液滴进入蒸发室(漂移管，drift tube)，流动相及低沸点的组分被蒸发，剩下高沸点组分的小液滴进入散射池，光束穿过散射池时被散射，散射光被光电管接收形成电信号，电信号通过放大电路、模数转换电路、计算机成为色谱工作站的数字信号——色谱图。
2．特点1.洗脱液需要雾化，所以雾化气流的纯度和压力会影响检测器的信噪比。
2.流动相要蒸发掉，a/所以不能使用不易挥发的物质来调节流动相的pH值。
b/可以通过蒸发温度的调节来使比被测物质沸点低的组分蒸发。
c/在不使被测物质蒸发的前提下，温度越高，流动相蒸发越完全，色谱图基线越好、信噪比越高。
d/如果被测物质沸点接近或低于流动相的蒸发温度，则无法检测；不过，100%的水做流动相，蒸发室温度也才设为150摄氏度，沸点比水低的有机物质完全可以用气相色谱仪进行分离检测了。
e/由于流动相和溶剂蒸发了，使用ELSD检测器收集的色谱图一般没有溶剂峰；而且梯度洗脱没有折光视差效应，一般不会出现基线漂移。
3.检测光散射变化，所有进入到散射池的物质都可被检测，而且响应值只与物质的量（？质量）有关。
4.浓度跟峰面积不成线性，分别取自然对数后成线性。
16毛细管电泳中常用的分离模式有哪些？每种操作模式的分离机制有什么区别？毛细管区带电泳法（CZE）:电泳淌度的差别，分离离子。
胶束电动毛细管色谱法（MEKC）、毛细管电色谱法（CEC）：电泳淌度与分配系数差别, 分离中性分子与离子。
环糊精电动毛细管色谱法（CDEKC）：电泳淌度与分配系数差别, 分离手性分子。
凝胶毛细管电泳法（CGE）：电泳淌度与筛分作用（正筛子，分子尺寸），小个分子先出柱。
等电聚焦毛细管电泳法（IEFCE）：等电点差别而分离, 分离两性分子毛细管电色谱法（CEC）17高效毛细管电泳为什么能实现高效和高速分离？由于毛细管能抑制溶液对流，并具有良好的散热性，允许在很高的电场下（可达400v/cm 以上）进行电泳，因此可在很短时间内完成高效分离。
例如可以在3.1min内分离36种无机及有机离子，把碱金属和镧系元素的24种样阳离子完全分离仅需 4.1min，分离效率可达105~107块/m.18、用什么方法可以测定电渗流迁移率？利用中性分子的出峰时间可以测定电渗流迁移率。
19影响毛细管电泳谱带展宽的主要因素有哪些？在毛细管电泳中，影响谱带展宽的原因主要是分子扩散、自热、吸附，另仪器死体积也会使谱带变宽。
20在毛细管电泳过程中，为什么阳离子，阴离子，中性分子向一个方向移动？在毛细管区带电泳中，毛细管内壁如果没有进行修饰，正离子迁移的方向与电渗方向一致，负离子迁移的方向与电渗方向相反。
因此，正离子在毛细管的迁移速度加快，负离子在毛细管的迁移速度减慢。
多数情况下，电渗的速度比电泳速度快5－7倍，故在毛细管中负离子也总是向负极移动。
所以在毛细管区带电泳中利用电渗流可将正/负离子和中性分子一起朝一个方向移动。
21如何选择毛细管区带电泳的分离条件？22胶束电动毛细管色谱和毛细管区带电泳的区别是什么？为什么MECC可以分离中性分子？毛细管区带电泳：仅为缓冲液，或者其中加入了部分添加剂，若加入表面活性剂也要求其浓度不能达到临界胶束浓度。
常用来分离在缓冲液中带电的离子。
胶束电动毛细管色谱：是指缓冲液中加入了大雨临界胶束浓度的表面活性剂而形成胶束。
常用来分离中性分子。
23毛细管电泳CE的驱动力、分离机理与HPLC有何不同？CE的柱效为何高于HPLC？CE是以高压电场为驱动力。
以毛细管为分离通道，依据样品中各组成之间淌度和分配行为上的差异，而实现分离的一类液相分离技术。
HPLC是由于组分在固定相和流动相间的分配系数不同，使得保留时间不同而分离。