现代色谱

现代色谱分析

1、色谱流出曲线图能说明哪些问题?

①根据色谱峰的个数，可判断样品中所含组分的最少个数。

②根据色谱峰的保留值（峰位），可进行定性分析。

③根据色谱峰的面积或峰高，可进行定量分析。

④色谱峰的区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。

⑤色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。

2.根据Van Deemter议程式, HPLC提高柱效的方法有哪些?或 HPLC法降低板高的主要途径有哪些？

①采用粒径小、窄粒度分布的球形固定相，首选化学键合相，用匀浆法装柱。

②采用低粘度流动相，低流速（1mL／min）

③柱温一般以25~30℃为宜。太低，则使流动相的黏度增加，温度高易产生气泡。用不含有机溶剂的水溶液为流动相的色谱法（如IEC、IC）可按需升温。

3.什么是正相色谱?什么是反相色谱?HPLC常用反相色谱,它最常用的固定相和流动相是什么? 各适用于分离哪些化合物？

①正相色谱：流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法。

反相色谱：流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法。

②反相固定相：C18、C8 流动相：甲醇、乙腈、水

③适用于分离非极性和极性较弱的化合物。

4. 一个好的检测器应具备什么条件?HPLC中可使用的检测器有哪些?你在实验中用过哪些检测器,它们有何特点(包括使用中应注意的问题, 适用于何种物质的检测)?属于哪种类型? 灵敏度高、噪音低、线性范围宽、重复性好、适用化合物的种类广泛等性能。HPLC中可使用的检测器:紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器、蒸发光散射检测器、化学发光检测器。

紫外检测器特点：①灵敏度高，噪声低。②不破坏样品，能与其他检测器串联，可用于制备色谱。③对温度及流动相流速波动不敏感，可用于梯度淋洗。④属浓度型检测器。

紫外检测器的应用范围：主要用于检测具有π-π或p-π共轭结构的化合物。如芳烃与稠环芳烃、芳香基取代物、芳香氨基酸、核酸、甾体激素、羧酸与羰基化合物等。

5.流动相和分析液都不能有气泡,为什么?常用的除气方法有哪些? 流动相和分析液都不能有不溶物,为什么?如何处理?

⑴因为溶解在溶剂中的气体会在管道、输液泵或检测池中以气泡形式逸出，影响正常操作的进行。

①溶剂中的CO2使得电导检测器的背景增大。

②检测池中的气泡，使得信号不稳定，常出现系列假峰（特别是当柱子加温使用时）。

③色谱柱内的气泡，使柱效降低。

④输液泵内的气泡，使活塞动作不稳定，流量变动，严重时无法输液。

脱气方法：用惰性气相（如氦气）驱除溶剂中的气体；加热回流；真空脱气和超声波脱气。

⑵不溶物会堵塞色谱柱。使用前用0.45um孔径的滤膜过滤。

6．HPLC对流动相有哪些要求？

①不与固定相发生化学反应

②对试样有适宜的溶解度,使k在 1-10范围内

③与检测器相适应

④黏度小

⑤纯度高，无机械杂质

⑥使用前需脱气

7ODS是什么?如何制成的，有何特点?

ODS是指十八烷基。

将十八烷基氯硅烷试剂与硅胶表面的硅醇基，经多步反应生成ODS键合相。

特点：有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力。

8用ODS柱分析试样中两种弱酸性物质(pKa可能在2-5范围内),以一定比例的甲醇-水或乙腈-水为流动相时,保留时间短,分离度差,应如何改变流动相以改善分离度？

答：首先增加水含量，以延长保留时间，提高分离度，如果效果不好，可采用离子抑制色谱法。用醋酸（盐）或磷酸（盐）等缓冲液，使流动相pH降低至3，如果还不能使保留时间延长，说明酸度较强（pKa<3），则可采用离子对色谱法，用四丁基胺磷酸盐等作离子对试剂，在较高pH下（如pH 5-7）进行分离。

9 简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。

相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测

主要差别：分析对象的差别和流动相的差别

分析对象

GC ：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，

高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及

高聚物的样品不可检测

占有机物的20%

HPLC ：溶解后能制成溶液的样品，

不受样品挥发性和热稳定性的限制

分子量大、难气化、热稳定性差及高分子

和离子型样品均可检测

用途广泛，占有机物的80%

10何谓化学键合相？常用的化学键合相有哪几种类型？分别用于哪些液相色谱法中？

采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。

目前常用的Si-O-Si-C 型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。①非极性键合相：常见如ODS 键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。

11离子色谱法，反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及适用范围有何区别？

离子色谱法(Ion Chromatography) ：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法，也可用于阳离子分析。 反相离子对色谱法(IPC 或PIC) ：反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k 和tR ，以改善分离。适用于较强的有机酸、碱。 反相离子抑制色谱：在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH 值，抑制组分解离，增加其k 和tR ，以达到改善分离的目的。适用于极弱酸碱物质（pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物）

12试讨论影响

根据分离方程式 可知分离度R 受n 、r 和k 的影响，其中n （或H 除了受固定相种类影响外，更主要的是流动相溶剂种类（选择性）的影响，这些因素决定组分与流动相（或固定相）间分子作用力，即选择性k 主要受溶剂强度及混合溶剂配比的影响。

提高分离度：①选择适宜种类和粒度小且均匀的固定相，并填充均匀。

②选择强度适当的流动相，获得适宜的k

③试验用选择性不同的溶剂或混合溶剂，提高分离度

④还可适当延长柱长或调节柱温来提高分离度。

13试讨论反相HPLC的分离条件的选择。

反相HPLC常用非极性固定相，可以选择键合碳链长度不同或含碳量、覆盖度不同的固定相，还可以选用中等极性甚至极性固定相。以极性溶剂为流动相，常用水或水-甲醇、水-乙腈。如果被分离物是弱酸或弱碱，则需选用pH一定的缓冲溶液为流动相，抑制弱酸或弱碱的解离

14什么叫梯度洗脱？它与GC的程序升温有何异同？

在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成或浓度配比，称为梯度洗提。程序升温与梯度洗脱的共同点都是为了有效分离样品，但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度。程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段。

15蒸发光散射检测器的原理及特点是什么？

1．ELSD原理

恒定流速的色谱仪（高效液相、逆流色谱、高效毛细管电泳等）洗脱液进入检测器后，首先被高压气流雾化，雾化形成的小液滴进入蒸发室(漂移管，drift tube)，流动相及低沸点的组分被蒸发，剩下高沸点组分的小液滴进入散射池，光束穿过散射池时被散射，散射光被光电管接收形成电信号，电信号通过放大电路、模数转换电路、计算机成为色谱工作站的数字信号——色谱图。

2．特点

1.洗脱液需要雾化，所以雾化气流的纯度和压力会影响检测器的信噪比。

2.流动相要蒸发掉，a/所以不能使用不易挥发的物质来调节流动相的pH值。b/可以通过蒸发温度的调节来使比被测物质沸点低的组分蒸发。c/在不使被测物质蒸发的前提下，温度越高，流动相蒸发越完全，色谱图基线越好、信噪比越高。d/如果被测物质沸点接近或低于流动相的蒸发温度，则无法检测；不过，100%的水做流动相，蒸发室温度也才设为150摄氏度，沸点比水低的有机物质完全可以用气相色谱仪进行分离检测了。e/由于流动相和溶剂蒸发了，使用ELSD检测器收集的色谱图一般没有溶剂峰；而且梯度洗脱没有折光视差效应，一般不会出现基线漂移。

3.检测光散射变化，所有进入到散射池的物质都可被检测，而且响应值只与物质的量（？质量）有关。

4.浓度跟峰面积不成线性，分别取自然对数后成线性。

16毛细管电泳中常用的分离模式有哪些？每种操作模式的分离机制有什么区别？

毛细管区带电泳法（CZE）:电泳淌度的差别，分离离子。

胶束电动毛细管色谱法（MEKC）、毛细管电色谱法（CEC）：电泳淌度与分配系数差别, 分离中性分子与离子。

环糊精电动毛细管色谱法（CDEKC）：电泳淌度与分配系数差别, 分离手性分子。

凝胶毛细管电泳法（CGE）：电泳淌度与筛分作用（正筛子，分子尺寸），小个分子先出柱。等电聚焦毛细管电泳法（IEFCE）：等电点差别而分离, 分离两性分子

毛细管电色谱法（CEC）

17高效毛细管电泳为什么能实现高效和高速分离？

由于毛细管能抑制溶液对流，并具有良好的散热性，允许在很高的电场下（可达400v/cm 以上）进行电泳，因此可在很短时间内完成高效分离。例如可以在3.1min内分离36种无机及有机离子，把碱金属和镧系元素的24种样阳离子完全分离仅需 4.1min，分离效率可达105~107块/m.

18、用什么方法可以测定电渗流迁移率？

利用中性分子的出峰时间可以测定电渗流迁移率。

19影响毛细管电泳谱带展宽的主要因素有哪些？

在毛细管电泳中，影响谱带展宽的原因主要是分子扩散、自热、吸附，另仪器死体积也会使谱带变宽。

20在毛细管电泳过程中，为什么阳离子，阴离子，中性分子向一个方向移动？

在毛细管区带电泳中，毛细管内壁如果没有进行修饰，正离子迁移的方向与电渗方向一致，负离子迁移的方向与电渗方向相反。因此，正离子在毛细管的迁移速度加快，负离子在毛细管的迁移速度减慢。多数情况下，电渗的速度比电泳速度快5－7倍，故在毛细管中负离子也总是向负极移动。所以在毛细管区带电泳中利用电渗流可将正/负离子和中性分子一起朝一个方向移动。

21如何选择毛细管区带电泳的分离条件？

22胶束电动毛细管色谱和毛细管区带电泳的区别是什么？为什么MECC可以分离中性分子？

毛细管区带电泳：仅为缓冲液，或者其中加入了部分添加剂，若加入表面活性剂也要求其浓度不能达到临界胶束浓度。常用来分离在缓冲液中带电的离子。

胶束电动毛细管色谱：是指缓冲液中加入了大雨临界胶束浓度的表面活性剂而形成胶束。常用来分离中性分子。

23毛细管电泳CE的驱动力、分离机理与HPLC有何不同？CE的柱效为何高于HPLC？

CE是以高压电场为驱动力。以毛细管为分离通道，依据样品中各组成之间淌度和分配行为上的差异，而实现分离的一类液相分离技术。HPLC是由于组分在固定相和流动相间的分配系数不同，使得保留时间不同而分离。

根据Van Deemter方程可知，影响柱效的因素包括涡流扩散项、纵向扩散项和传质阻力项。在毛细管电泳中，使用空心毛细管柱，无涡流扩散项，毛细管内壁也不涂渍固定液，消除了组分在固定相与流动相间平衡所需的时间，传质阻抗项趋零，而高效液相色谱中存在两种影响因素，因而CE的柱效高于HPLC。

24 电渗速度受哪些因素响?

1.电场强度的影响：电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。

2.毛细管材料的影响：不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；

3. 电解质溶液性质的影响：

（1）溶液pH的影响

（2）阴离子的影响：在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大

差别，产生的焦耳热不同。

4. 温度的影响：毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。

5. 添加剂的影响

（1）加入浓度较大的中性盐，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。

（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；

（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。

25、PHCE 影响分离度的主要因素有哪些?

工作电压，毛细管有效长度与总长度比，有效淌度差

26 电渗流是如何产生的？为什么说毛细管电泳的流型是“塞子”状的平面流型？它有什么优点？

毛细管内溶液溶液在电场作用下整体朝一个方向迁移。CE 的电流是流体相对于带电管壁移动的一种现象，它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动, 使整个流型呈近似扁平型的“塞式”流 。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。但在HPLC 中,采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型, 其中心处速度是平均速度的两倍, 导致溶质区带本身扩张, 引起柱效下降, 使其分离效率不如CE 。

27你认为对紫外没有吸收或吸收太少的样品，用HPLC 检测该如何处理？

可选择荧光检测器、蒸发光检测器等等，总而言之需要的样品主成分要在检测器上有响应信号。或者采用衍生的方法，使检测物在紫外区有吸收。

28 手性药物的拆分你可用什么方法？

1、高效液相色谱 (HPLC)：间接法（又叫非对映体拆分法或柱前手性衍生化法）；手性固定相（CSP ）法；手性流动相添加剂（CMPA ）法。

2、气相色谱 (GC)(样品需具有一定的挥发性及热稳定性）。

3、毛细管电泳(HPCE)。

4、超临界流体色谱（SFC)。

29 影响R 的因素？

增大柱效n ，影响峰形；增大容量因子k ，影响峰位；提高分配系数比α，影响峰间距。

31.计算题

例. 对于一个混合物的分离得到三个峰，分简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点别为阳离子(t =78s)、 中性化合物(t=132.8s)和阴离子(t=264.6s)。所用毛细管总 长度为48.5 cm ，有效长度为40 cm ，施加电压为10 kV 。 试求算电渗淌度以及不同离子的表观淌度和电泳淌度。

例： 设某CZE 系统的毛细管长度Lt=65cm, 由进样口至检测器长度Ld=58cm,分离

电压V=20kV ,扩散系数D=5.0?10-9m2/s 。测得某中性分子A 的迁移时间是9.96min 。app eo ep μμμ=+app d d R L L L t u V

μ==?

(1) 求出该系统的电渗淌度；(2) 求电泳淌度为2.0?10-5cm2/Vs的阴离子B的迁移

时间；(3) 以A计算理论塔板数；(4) 求A与B的分离度。

解：(1)μapp=（L d / t）/（V/ Lt）

μapp =58?65/ (9.96?60?20000)

=3.2?10-4cm2/Vs

(2) tB/tA=μA/?μ

tB= 9.6?3.2?10-4/ (3.2?10-4-2?10-5) =11min

3) n =μA?V/2D

=3.2?104?20000/2?5.0?10-5

= 6.4?104

4）