实验五ELISA法检查乙肝表面抗原HBsAg

免疫标记技术
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免
疫学诊断的敏感性
放射性同位素： 酶：辣根过氧化物酶、 荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄
125I、131I
碱性磷酸酶
绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹
明（红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA）
免疫酶测定法
(Enzyme ImmunoAssay,EIA)
• 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。
– 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)
• 特点：
✓ 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 ✓ 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 ✓ 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值
• 分类：
3、ELISA基本的实验过程
• 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载 体表面，使抗原或抗体固相化；
• 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物， 使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固 定；
• 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使 发生酶促反应而显色。
ELISA的试剂
ELISA中有3个是必要的试剂：免疫吸附剂、标记物和显色剂。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （聚苯乙烯板：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗 原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性） （2）酶标记的抗原或抗体（标记物）； （3）酶作用的底物（显色剂）； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）样品及标准本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液
• 1、掌握ELISA（双抗体夹心法）的原理 • 2、熟悉ELISA实验操作方法，并了解其应
用
实验材料
✓ HBsAg酶联免疫分析试剂盒 ✓ HBsAg阳性品，阴性对照品 ✓ 移液枪，枪头 ✓ 湿盒 ✓ 酶标板，酶标仪 ✓ 一次性手套 ✓ 记号笔 ✓ 计时器
实验步骤
结果判定
•定性测定 定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用 “阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作 一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。 根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不 稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 待测孔（P）与对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者 为阳性，N为阴性对照孔。
实验五：ELISA法检测乙肝表面 抗原（HBsAg）
主讲人：季煜华 2014年11月
免疫标记技术
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性 同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过 检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。
2.分类：
✓ 放射免疫测定法：131I，32P ✓ 免疫荧光技术：FITC，PE ✓ 免疫酶测定法：HRP，AP
4、ELISA类别
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂 的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不 同类型的检测方法，主要类型有
双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。
双抗体夹心法
间接法
5、操作步骤（以双抗体夹心法ELISA为例）：
清洗
清洗
清洗
用抗体包被固 相载体
加入抗原 Sample(二价以
• 1、 • 2、
课后问题
பைடு நூலகம்
✓ 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
1.简介
酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）,简称ELISA，它 是实验室最常用的检测方法，用酶标记抗原 或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗 体或抗原。 ELISA具有准确性高、检测时间 短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果 便于记录和保存等优点，适合于大批标本的 检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测 以及免疫实验分析等领域。
上)，温育
加入酶标抗体， 加入底物，
温育
显色
终止反应，底物显色深浅与待检抗原 量成正比。
利用已知浓度的抗原制成标准品，稀 释为梯度浓度，对其最终OD值与浓 度作标准曲线，那么样品的浓度可以 根据最终的OD值在标准曲线上查出。
实验内容：
双抗体夹心法测定乙肝表面抗原 （HBsAg）——定性定量检测
实验目的
• 洗涤必须彻底，防止产生假阳性； • 温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃等。37℃是实
验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温 度。 • ELISA板放在湿盒内，可在盒底垫湿的纱布，将ELISA板放在 湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速 平衡。温浴的时间要严格控制。
2、ELISA基本原理
(1).抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持 其免疫学活性。例如：蛋白质分子结构上的疏水基团与聚 苯乙烯表面的疏水基团能产生互作用而吸附。 (2).抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此 种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； (3).酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的 颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的 深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进 行定性或定量分析。
•定量测定：酶标仪测定450nm波长下的OD值，根据标准曲 线计算样品抗原的浓度。
预期结果
• 阳性：显色为黄色 • 阴性：无色
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阴性 阴性 阳性 阳性
ELISA注意事项
• 加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅 出，避免产生气泡并迅速完成；一个人操作时，一次不宜多 于两块板同时测定。