06第七章__凝胶过滤
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子（如蛋白质、核酸等）的方法。
该方法基于分子的大小和形状的差异，利用一种孔隙较小的基质（凝胶）将分子按照大小分离，从而达到纯化的目的。
凝胶过滤层析是一种非亲和层析法，因为分离是通过分子与基质之间的排斥效应进行的，而不是通过特定的信号配对。
1.准备样品：将待纯化的生物大分子样品（如蛋白质溶液）处理成适合进行层析的条件。
这通常包括调节样品的pH值、离子强度、缓冲剂等。
2. 准备层析柱：选择合适的凝胶填料，并根据需要选择合适的柱尺寸。
凝胶填料可以是聚合物凝胶或硅胶凝胶。
聚合物凝胶（如Sephadex、Sepharose等）常用于分离中等分子量的生物大分子，而硅胶凝胶（如Sephacryl等）则适用于分离较大分子量的生物大分子。
3.平衡柱：将层析柱与缓冲液平衡。
通常用适当的缓冲液（如甘氨酸盐缓冲液）进行平衡，以确保柱内填充物的孔隙充满均匀。
4.样品加载：取适量的样品，在不破坏填充物的情况下缓慢地、连续地将样品滴入柱顶端。
加载速度要缓慢，以确保样品充分进入柱内而不是渗漏到填充物外。
5.洗脱：在缓冲液的作用下，样品溶液逐渐沿柱体下滤。
较小的分子会占据填充物内较小的孔隙，因此会与缓冲液一起快速通过填充物，而较大的分子则会在填充物中逐渐滞留。
洗脱时间的长短取决于目标分子的大小。
6.收集洗脱液：用收集管接收洗脱液，以便将目标分子收集起来。
7.考虑后续处理：根据需要，纯化后的生物大分子可以进一步进行其他处理，如浓缩、冻干或储存等。
凝胶过滤层析技术的优点包括操作简单、不需要特殊的设备和试剂、分离过程温和且不破坏生物大分子的活性。
但也需要注意凝胶的选择、控制操作速度、适当调节缓冲液等因素，以获得最佳的纯化效果。
另外，凝胶过滤层析不能对极低分子量的物质进行有效分离，且柱内的适用范围有限，对于较大的生物大分子可能需要较长的时间来完成分离。
凝胶层析法
聚丙烯酰胺凝胶的性质
生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如Bio-Gel P-100。
42
四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）
（一）琼脂糖凝胶
结构是由β-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以α-1，3和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
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Sepharose
琼脂糖凝胶（agarose gel）可以分离葡聚糖凝
胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分
离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达 相对分子质量108，但是由于琼脂有强烈的吸附作用， 给使用造成了困难，后来，基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，
其结构是有β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳 糖相结合的链状多糖。
这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝 胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性
远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构
破坏。最好使用条件控制在pH 4～9之间，温度0～ 40℃，超出此范围,可能被破坏。
（3）分离条件缓和。
（4）应用广泛。 （5）分辨率不高，分离操作较慢。
20
第二节 凝胶的结构和性质
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
分离的目的。
（一）平衡排除理论
当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶 质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。
凝胶过滤
1.0 1.5 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 20.0
2 3 5 10 12-15 15-20 20-30 30-40
1) 任意卷曲的多糖 2）多肽和球蛋白 Sephadex在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸溶液中稳定，在强碱中糖苷键被水解。可在 100℃高压消毒40分钟。
（二）、琼脂糖凝胶（Sepharose） 由琼脂制成的线性多糖，由D-半乳糖和3，6-脱水L-半乳糖交替 组成。
（二）、凝胶级别的选择 1.细的（20-80μm）： 2.超细的（10-40μm）：以上二者区带窄， 分辨率高。 3.中等的（50-150μm）： 4.粗的（100-300μm）：以上二者流速快， 适用于制备，组分离。
（三）、层析柱的选择
1.柱长：两个区带的分辨率与柱长的平方根成正比。 2.柱内径：大小由载样量决定。 3.加样装置：样品进入凝胶前避免稀释。 4.死体积：样品经柱分离后避免再混合。 5.层析床支持物：避免阻塞。
植物外源性凝集素----红细胞、淋巴细胞的表面抗原、某 些糖和多糖
（二）、层析原理 1.以共价键将配位体与不溶性基质连接，制成层析床。 2.将欲分离样品加到柱上，与配位体有亲和性的大分子被保 留，其它直接流过。
3.改变洗脱剂组成，使吸附大分子解离和洗脱。
（三）、亲和层析的吸附剂 1、基质 1）、理想基质的性质 (1)不溶性基质应具备松散的多孔网络，大分子可以均匀和不 受阻碍地进出，并具有良好的流动性。 (2)凝胶颗粒应为规则球形，并具刚性，有利于流动和耐受静 压。 (3)基质的化学性质必须是惰性的，基质骨架与蛋白质等的反 应必须极弱以降低非特异 性结合吸附作用。 (4)凝胶的理化性质必须稳定，不因偶联配位体和吸附、洗脱 互补大分子所应用的条件而发生变化。 (5)基质必须有能活化或修饰的功能基，并且数量充足，以便 能偶联较多的配位体。
凝胶过滤的原理
凝胶过滤的原理
凝胶过滤是一种常见的分离和纯化生物大分子的方法，它基于分子在凝胶中的
迁移速度的差异来实现分离。
凝胶过滤的原理是利用凝胶材料的孔隙结构对分子大小进行筛选，从而实现不同大小的分子在凝胶中的迁移速度不同，从而实现分离的目的。
在凝胶过滤中，凝胶材料起着筛子的作用，分子在凝胶孔隙中的扩散速度与其
分子大小成反比。
较大的分子无法进入凝胶孔隙内部，只能沿着凝胶颗粒的表面进行扩散，因此迁移速度较慢；而较小的分子则可以进入凝胶孔隙内部，因此迁移速度较快。
通过这种方式，不同大小的分子可以在凝胶中被有效地分离开来。
凝胶过滤的原理可以用来分离蛋白质、DNA、RNA等生物大分子。
在实际操
作中，通常会选择适当孔径的凝胶材料，使得待分离的分子能够在凝胶中得到有效的筛选和分离。
此外，还可以通过改变凝胶的pH值、离子强度等条件来调节分子
在凝胶中的迁移速度，从而实现更精细的分离效果。
凝胶过滤的原理简单直观，操作方便，因此在生物大分子的分离和纯化中得到
了广泛的应用。
它不需要复杂的实验设备，只需要凝胶柱和一些基本的实验仪器即可完成分离操作。
同时，凝胶过滤还可以实现高效的分离效果，对于一些需要高纯度的生物大分子样品的制备具有重要的意义。
总的来说，凝胶过滤的原理是基于凝胶材料对分子大小的筛选作用，利用分子
在凝胶中的迁移速度差异来实现分离。
它是一种简单、有效的生物大分子分离方法，具有广泛的应用前景。
通过对凝胶过滤原理的深入理解，可以更好地指导实际操作，提高生物大分子的分离和纯化效率，推动生物科学研究的发展。
凝胶过滤的原理
凝胶过滤的原理
凝胶过滤是一种常见的分离和纯化生物大分子的方法，它基于凝胶的孔隙大小对分子进行分离。
凝胶是一种多孔性材料，可以是天然的，也可以是人工合成的。
在凝胶过滤中，样品溶液通过凝胶柱时，大分子会被凝胶的孔隙所排斥，因而会绕过这些孔隙，而小分子则会进入孔隙内部，从而被凝胶所阻滞。
这样，不同大小的分子就会在凝胶柱中被分离开来。
凝胶过滤的原理主要是基于分子的大小排斥效应和孔隙阻滞效应。
对于大分子而言，它们的尺寸大于凝胶孔隙的大小，因此无法进入孔隙内部，只能绕过孔隙，从而在凝胶柱中形成一条较为直的通道。
而小分子则可以进入凝胶孔隙内部，受到孔隙的阻滞作用，从而在凝胶柱中形成一条较为曲折的通道。
这样，不同大小的分子在凝胶柱中会以不同的速率通过，从而实现了它们的分离。
凝胶过滤的原理还涉及到凝胶的选择和操作条件的控制。
不同大小的分子对凝胶的选择有着不同的要求，通常需要根据样品的特性和分子大小来选择合适的凝胶材料。
此外，操作条件的控制也对凝胶过滤的效果有着重要的影响，比如流速、温度、缓冲液的选择等。
这些因素都需要在实验中进行合理的控制和调节，以保证凝胶过滤的效果。
总的来说，凝胶过滤是一种简单、有效的分离和纯化生物大分子的方法，它基于凝胶的孔隙大小对分子进行分离，利用分子的大小排斥效应和孔隙阻滞效应来实现分子的分离。
在实际操作中，需要根据样品的特性和分子大小选择合适的凝胶材料，并合理控制操作条件，以保证凝胶过滤的效果。
这种方法在生物化学、生物学等领域有着广泛的应用，为研究人员提供了一种重要的工具和技术手段。
凝胶过滤层析法
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Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。
10
15-20
72
5
150
5000-400000
1000-150000
15
20-30
72
5
200
5000-800000
1000-200000
20
30-40
72
5
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Sephadex的型号及性能
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3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。
峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。
标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。
Wb=4 σ=1.699W1/2
W1/2=2.354 σ
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保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。
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Sephacryl系列产品性能
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(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。
第七章 凝胶层析
一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算 五、凝胶层析的扩展
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一、凝胶的选择和处理
（一）凝胶的选择 (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋
白质与盐类，称作类分离。
(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离， 如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分 离。
避免硼酸缓冲液
（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）
架桥琼脂糖凝胶为琼脂 线性分子经1，3-二溴丙 醇交联的凝胶。
它的凝胶孔径均匀，机 械强度明显加大。
对热和化学物质的稳定 性 大 大 增 加 , 在 pH3~14
范围内稳定。
36
（三）超胶（Utro-gel ACA）
所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚
例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分 子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗 脱出来。
4. 分级分离范围
分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分 子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好 的线性分离。
例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为 3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形 蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。
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一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
1.结构
商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡
聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为
交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
22
2 规格型号：
实验七、凝胶过滤层析
装柱的两种方法： a.手工操作
1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2 厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢 加入凝胶
b.电动搅拌下的装柱法
（如图4-9）
样品上柱
分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的20—30%
部分收集器的操作方法
1．将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和 “停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或 “慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开"慢" 和“定”，再按一下"停"设定定时时间工作就完毕。 若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能 显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则 需按下“秒”键。
先关闭层析柱出水口向柱管内加入约13柱容积的洗脱液然后边搅拌边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中使其自然沉降等凝胶沉降约23cm后打开柱的出口调节合适的流速使凝胶继续沉集待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱关闭出水口
实验七 凝胶过滤层析纯化细胞 色素C
一、目的要求
1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的 原理与方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯 化
（四）加样 1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直 至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液1 mL小 心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下 口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当 样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样 操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连 通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液 口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。 （五）洗脱 洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.025 mol/LTrisHCl，以每管3 mL/10 min流速洗脱，用自动部分收集 器收集流出液。
生物化学A (山东联盟)智慧树知到课后章节答案2023年下青岛农业大学
生物化学A（山东联盟）智慧树知到课后章节答案2023年下青岛农业大学青岛农业大学第一章测试1.生物化学的主要研究内容有哪些？（）A:其他 B:生物大分子的新陈代谢规律 C:遗传物质的传递和表达 D:生物大分子的结构、性质和功能答案:生物大分子的新陈代谢规律;遗传物质的传递和表达;生物大分子的结构、性质和功能第二章测试1.加入下列试剂不会导致蛋白质变性的是（）A:盐酸胍 B:硫酸铵 C:十二烷基磺酸SDS D:尿素(脲)答案:硫酸铵2.以下蛋白质中属寡聚蛋白的是（）A:肌红蛋白 B:血红蛋白 C:Rnase D:胰岛素答案:血红蛋白3.利用分子筛原理来分离蛋白质的技术是（）A:阳离子交换层析 B:阴离子交换层析 C:亲和层析 D:凝胶过滤答案:凝胶过滤4.与茚三酮反应呈黄色的氨基酸是:A:Pro B:Tyr C:Phe D:Trp答案:Pro5.除脯氨酸外,所有的α-氨基酸都能与茚三酮作用是:A:绿色反应 B:红色反应 C:黄色反应 D:蓝紫色反应答案:蓝紫色反应第三章测试1.下列何种碱基在DNA中不存在? （）A:鸟嘌呤 B:腺嘌呤 C:尿嘧啶 D:胞嘧啶答案:尿嘧啶2.维系DNA双螺旋结构最主要的力是（）A:共价键 B:碱基对规则排列形成的疏水键 C:盐键 D:碱基对之间的氢键答案:碱基对规则排列形成的疏水键3.单核苷酸的组成成分（）A:碱基+戊糖 B:戊糖+磷酸 C:碱基+磷酸 D:碱基+戊糖+磷酸答案:碱基+戊糖+磷酸4.下列哪些实验在证明核酸是遗传物质中起了决定性作用?A: Waston和Crick于1953年提出的DNA双螺旋模型 B: Wilkins和Franklin(1953年)DNA的X射线晶体衍射研究 C:Chargaff(1958)DNA碱基组成的研究 D:O.Avery等1944年的肺炎双球菌转化实验答案:O.Avery等1944年的肺炎双球菌转化实验5.DNA在水溶液中最稳定的构象为A:Z型 B:C型 C:A型 D:B型答案:B型第四章测试1.酶的活化和去活化循环中,酶的磷酸化和去磷酸化位点通常在哪一种氨基酸残基上? （）A:脯氨酸 B:丝氨酸 C:赖氨酸 D:天冬氨酸答案:丝氨酸2.NAD或NADP中含有哪一种维生素? （）A:吡哆醛 B:烟酰胺 C:烟酸 D:吡哆胺答案:吡哆胺3.乳酸脱氢酶是由两种不同的亚基组成的四聚体。
凝胶过滤
The end Thank you !
从颗粒的间隙通过 （3）小分子滞留，大分子向下移动
（4）大小分子完全分开
（5）大分子先于小分子流出层析柱
影响凝胶过滤的因素
（一）凝胶的选择 （二）凝胶粒度对分离效果的影响
40-60目为粗粒。100-200目为细粒（应用较多）能使洗
脱曲线的峰区变得对称和狭窄。 250-400目为最细粒。 （三）洗脱流速对分离效果的影响 一般采用流速在30-200ml/h，过快会使层析带变形。 （四）离子强度 （五）样品液体积对分离效果的影响 通常样品液体积约为凝胶床总体积的5-10%。 （六）凝胶柱的长度，直径和分离效果的关系
凝 胶 过 滤
韩建平
原理：凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物
Hale Waihona Puke 质却被阻挡在外部，从而使混合溶液中各种组分按分子质量不同进行
筛分 特点：设备简单，操作方便、重复性好、回收率高
用途：分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等，测定蛋白质分子质
量、样品的浓缩和脱盐等
（1）将混合液放入管柱中
（2）小分子扩散进入凝胶颗粒内，而大分子
操作步骤
1、凝胶的选择和前处理 市售的凝胶干颗粒使用前必须成为膨胀形式。 2、凝胶的装柱与分析 （1）柱的选择 （2）样品液体积 （3）保证凝胶柱质量要求 3.洗脱
应注意考虑：（1）离子强度对物质分离的影响
（2）pH值对分离物质的酸碱性和洗脱行为的影响 （3）为了避免洗脱过程中产生离子交换的性能，可使用挥发性缓冲剂。
4.凝胶再生
用适当的方法去除凝胶的污染物，恢复其原来性质。
凝胶过滤的应用
1.分离、纯化与鉴定 对病毒、蛋白质、酶、激素、抗体、核酸、多糖等生物大分子 的分离、纯化和鉴定。 2.测定相对分子质量 用一系列相同形状的已知相对分子质量的分子作出一条标准曲 线，即洗脱体积-相对分子质量对数的曲线，根据未知相对分子质 量物质在同一条件下的洗脱体积，便可在标准曲线上查出其相对 分子质量。
生物化学技术凝胶过滤学习PPT教案
第二节 基本原理
一、基本原理
凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径
较一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可完全或部分排阻
某些大分子化合物于筛孔之外，而小分子化合物则可以在筛
孔中自由扩散和渗透。某种组分凝胶层析柱中被排阻的程度
用 kav 表示
kav
Ve Vt
Vo Vo
Ve 洗脱体积；
。
流速与操作压
Sephadex G-50及其以下（交联度大）的流速与操作压 之间的关系遵守Darcy’s规律
u K P L
u：线性流速(ml/cm2·h) K：常数(粗、中、细颗粒的各不相同) △P：操作压(cp) L：柱长
当洗脱液的黏度为lcp时的表达式
u Ko P L
Ko仅与凝胶的性质有关，而与柱子直径基本无关。 但是G-75以上各种型号交联葡聚糖的流速还与柱直径 大小有关
凝胶过滤是20C-60Y发展起来的一种分离纯化方 法；又称分子筛层析、排阻层析
原理：凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其 内部，而大分子物质却被阻挡在外部，从而使混合 溶液中各种组分按分子质量不同进行筛分
特点：设备简单，操作方便、重复性好、回收率 高
用途：分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等， 测定蛋白质分子质量、样品的浓缩和脱盐等
克服吸附的方法：提高洗脱液的离子强度
四、Sephacryl
Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联 制成。此凝胶属硬性凝胶，它具有一定大小的筛孔和少量的羧 基基团
耐酸碱、耐去污剂、耐解离剂，甚至可用去污剂、盐酸胍或 尿素溶液作洗脱剂
多用于蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖的分离纯化，也用于 病毒颗粒的分离
（二）凝胶用量计算
凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤
凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography）是一种常用的蛋白纯化方法，可以根据蛋白的分子大小以及形状，将不同分子量的蛋白分离和纯化。
下面将详细介绍凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤，并探讨其中一些关键的因素。
1.实验准备：准备所需的层析柱、缓冲液、样品和标准品。
选择合适的层析柱是非常重要的，根据需要选择合适的分离范围和流速。
2.柱填充：将经过活化、平衡的凝胶填充到柱中。
凝胶通常是由多孔的聚合物材料制成，如琼脂糖或聚丙烯酰胺。
选择适当的凝胶类型和粒径主要根据目标蛋白的分子大小来决定。
常见的凝胶类型有Sephadex，Sephacryl和Superdex等。
3.前处理样品：前处理样品通常包括去除杂质和减少非特异性结合。
通过串联多个柱，可以实现前处理样品，如亲和柱或离子交换柱。
4.平衡柱子：使用适当的缓冲液洗涤和平衡填充的柱子，以提前去除杂质和干扰物。
5.样品加载：将待纯化的样品加载到填充好的层析柱中。
样品应根据需要进行浓缩和稀释，使其适合填充层析柱。
6.层析运行：选择恰当的流速和缓冲液来进行层析运行。
在层析过程中，缓冲液会逐渐在凝胶中通过，较大分子的蛋白会随着缓冲液流动而快速通过，而较小分子的蛋白则会受到凝胶孔径限制而在凝胶中滞留更长时间。
这样就实现了蛋白的分离和纯化。
7.收集洗脱分数：根据纯化目标的大小和形状，选择适当的分数收集。
较大分子的蛋白会在前期的分数中被洗脱，而较小分子的蛋白会在后期的分数中被洗脱。
8.分析和纯化评价：通过检测分析，如SDS-或Western blot等技术，评估样品纯度和目标蛋白的丰度。
如果需要更高的纯度，可进行进一步的步骤，如再层析或其他纯化方法。
在凝胶过滤层析纯化蛋白的过程中-选择适当的缓冲液：缓冲液的pH值和离子强度应根据目标蛋白的理化性质进行优化，以保持蛋白稳定性和纯化效果。
-选择合适的流速：流速的选择应根据柱子的尺寸和样品的需求进行调整。
凝胶过滤
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷 键水解断裂。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加 入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。否 则，微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，因为含羧基基团。
该基团能与分离物中电荷基团（碱性蛋白质） 发生吸附作用，可提高洗脱液的离子强度。但 当离子强度大于0.05时，对弱碱性蛋白质就无 吸附力了。 葡聚糖凝胶层析时，用含有 NaCl 的缓冲液作 洗脱液。
一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形 式出售，使用前必须溶胀。 特点： 不溶于水和普通有机溶剂； 能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡； 在pH l-10或短时间超过此pH值的溶液中较稳定； 要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅 速发生分解（高温条件）。
缺点： 对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸 附现象，使用离子强度略高的洗脱液操 作可以克服。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网 孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中，因此流程较长，移动速率慢，所 以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗 透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以 它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的 组分先流出，分子小的组分后流出。
琼脂糖凝胶在干燥状态下易破裂，一般存放在 含防腐剂的水溶液中，避免剧烈的搅动。
CL型交联琼脂糖：Sepharose 与1, 3-二溴异丙醇 （1, 3-dibromopropanol）在强碱性条件生成的。 优点： 其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，热 稳定性与化学稳定性好 可在广范围的pH溶液（pH3-14）中使用，用较 强的碱溶液短时间处理，性能不会改变。 缺点：在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生 解聚。
凝胶过滤的原理
凝胶过滤的原理凝胶过滤是一种常见的生物化学实验技术，它利用凝胶材料的孔隙结构对生物大分子进行分离和纯化。
凝胶过滤的原理是基于生物大分子在凝胶材料孔隙中的大小排列和筛选效应，通过不同大小的孔隙来分离不同大小的生物大分子，从而实现对混合物的分离和纯化。
在凝胶过滤实验中，常用的凝胶材料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶（简称PAAG）和琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶（简称SDS-PAGE）等。
这些凝胶材料具有不同的孔隙结构和分子筛选能力，可以根据实验需要选择合适的凝胶材料。
在进行凝胶过滤实验时，首先需要将凝胶材料制备成凝胶板或凝胶柱，然后将样品加载到凝胶中，通过电泳或重力作用使生物大分子在凝胶孔隙中进行分离。
在分离过程中，较大的生物大分子无法进入较小的孔隙，而较小的生物大分子则可以进入较小的孔隙，从而实现生物大分子的分离和纯化。
凝胶过滤的原理可以用一个简单的比喻来解释，就好像是在一个筛子上进行筛选一样。
较大的颗粒无法通过较小的孔隙，而较小的颗粒则可以通过较小的孔隙，从而实现颗粒的分离。
在凝胶过滤中，凝胶材料的孔隙就相当于筛子的孔隙，生物大分子则相当于颗粒，通过这种筛选效应实现生物大分子的分离和纯化。
凝胶过滤的原理还可以通过凝胶材料的孔隙大小和生物大分子的分子大小来解释。
通常来说，较大的生物大分子无法进入较小的孔隙，而较小的生物大分子可以进入较小的孔隙。
因此，通过选择合适的凝胶材料和调节实验条件，可以实现对不同大小生物大分子的有效分离和纯化。
总之，凝胶过滤是一种基于凝胶材料孔隙结构的生物大分子分离和纯化技术，它通过凝胶材料的筛选效应实现生物大分子的分离和纯化。
通过深入理解凝胶过滤的原理，可以更好地应用这一技术进行生物化学实验和研究，为生物科学领域的发展做出贡献。
《凝胶过滤层析》课件
高分子材料
随着高分子合成技术的进步，新型的高分子材料将应用于凝胶过滤层析中，以提高分离效率和分辨率。
纳米材料
纳米材料具有独特的物理和化学性质，将其应用于凝胶过滤层析中，有望实现更高效的分离和更精确的检测。
自动化和智能化发展
借助人工智能和机器学习技术，对凝胶过滤层析的数据进行深度分析，为实验结果提供更准确的解释和预测。
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂聚合形成的网状高分子凝胶，具有良好的分子筛效应。
简介
应用
优点
缺点
常用于分离蛋白质、多肽等生物小分子，也可用于制备亲和层析介质。
分离效果好、分辨率高、操作简便。
可能产生毒性，对盐浓度和pH值敏感。
凝胶过滤层析的步骤
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葡聚糖凝胶
简介 应用 优点 缺点 葡聚糖凝胶是一种由葡萄糖单元组成的线性高分子凝胶，具有良好的化学稳定性和生物相容性。 分离效果好、分辨率高、操作简便。 广泛用于分离蛋白质、酶、核酸等生物大分子，也可用于制备亲和层析介质。 成本较高，对盐浓度和pH值敏感。
琼脂糖凝胶
简介 应用 优点 缺点 琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的线性高分子凝胶，具有较好的机械强度和稳定性。 常用于分离DNA、RNA和蛋白质等生物大分子，也可用于制备微孔过滤介质。 机械强度高、稳定性好、成本较低。 对盐浓度和pH值敏感，可能产生拖尾现象。
凝胶过滤层析是一种基于分子大小分离蛋白质混合物的技术。
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定义
它利用具有不同孔径的凝胶作为分离介质，根据蛋白质分子的大小和形状进行分离。
凝胶过滤法原理
凝胶过滤法原理凝胶过滤法是一种常用的分子分离方法，主要用于分离和分析生物大分子，如蛋白质、核酸和多肽等。
凝胶过滤法是一种基于分子大小的分离方法，利用分子在凝胶中的深度穿透程度来分离分子大小不同的物质。
本文将详细介绍凝胶过滤法的原理、操作步骤、优缺点以及应用领域。
一、凝胶过滤法原理凝胶过滤法是一种分子尺寸分离的方法，属于分子筛分离方法。
其原理是通过凝胶微球的孔径大小来实现对分子进行分离。
凝胶微球的孔径大小与其交联程度及交联剂浓度有关，一般来说，交联程度越高，孔径越小，分子的分离效果就越好。
凝胶过滤法的操作步骤如下：1. 凝胶材料的制备：根据需要分离的分子大小选择合适的凝胶材料，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。
制备时需要根据实验要求控制凝胶的交联程度和孔径大小，并进行脱氧处理以去除残留的殉使剂。
2. 凝胶柱的制备：将制备好的凝胶注入柱体中，制备凝胶柱。
凝胶柱的长度和直径应根据实验需要进行选择。
凝胶柱的前端和后端各设置一个过滤器，以保持凝胶柱内部的凝胶均匀分布。
3. 样品的预处理：根据实验需要，对待分离样品进行预处理，如去除蛋白质中的盐、重组蛋白中的肽、除去核酸样品中的杂质等。
预处理的方法包括低速离心、热处理、加盐沉淀、酸性沉淀、甲醇沉淀等。
4. 样品的注入：将预处理好的样品注入凝胶柱中，根据实验需要调整注入速度和量，并在实验过程中保持凝胶柱内部湿润。
5. 柱洗脱液的选择：根据分离物的性质和实验要求选择合适的柱洗脱液，如生理盐水、磷酸盐缓冲液、硝酸盐缓冲液等，逐一加入凝胶柱中。
6. 分离物的收集：收集不同分子大小的分离物，根据需要进一步进行分析、纯化、测定样品的组成和浓度等。
凝胶过滤法有许多优势，如不需要高压，适用范围广，简单易操作，分离效果好，分离物得到的样品污染小等。
它也有一些缺点，如无法分离小分子物质，分子大小分离效果有限，凝胶材料存在的自由基和殉使剂会对样品产生影响等。
二、应用领域凝胶过滤法广泛应用于生命科学领域中各项研究中，如基因工程、蛋白质分离纯化、酶学研究、药物筛选等。
第七章层析分离技术2——凝胶过滤层析
（1）介质不带电荷, 具有化学惰性，不与被分离物 质发生化学反应，条件温和，不会使物质变性；
（2）色谱介质不需再生,可反复便用； （3）分离效率高，回收率较高； （4）广泛应用于生物大分子的初级分离，脱盐等。 （5）分辨率较低，需采用细长柱。 （6）经过凝胶过滤色谱后样品被稀释，上样前需
显影响 其分离效果不受去污剂、促溶盐类、变性剂等影响 能在多种有机溶剂存在下使用
②Superdex
根据分级范围不同，可分为若干型号（见表5.6，P80）， 其中，数字越大，孔径越大。 prep grade 颗粒较大。
Superdex peptide Superdex 30 prep grade Superdex 75、200 （ prep grade ）
根据交联之前母胶中琼脂糖的含量不同，Sepharose CL系 列凝胶也有三种类型：Sepharose CL-2B、Sepharose CL4B和Sepharose CL-6B。
特点
Sepharose CL系列凝胶在颗粒直径、分级范围方面与Sepharose系 列完全相同
在pH稳定范围、机械强度（流速）及温度稳定性等方面得到了很 大的改进
二、凝胶过滤介质
2. 凝胶介质的种类
按基质组成主要可以分为 ：
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯 -二乙烯苯凝胶、二氧化硅凝胶，以及由两种物质混合 形成的如琼脂糖-葡聚糖混合凝胶、聚丙烯酰胺-葡聚糖 混合凝胶等。
按凝胶过滤层析能达到的柱效和分辨率又可分为：
标准凝胶介质：颗粒尺寸较大（一般为100~250 μm），机
（1）葡聚糖凝胶（Sephadex ） G-数字 联度越大，分级范围越小。）
凝
胶 过
（2）琼脂糖凝胶
凝胶过滤层析实验
凝胶过滤层析实验凝胶过滤作为实验室最常用的层析方法之一，无疑是众多层析方法中最娇贵的存在。
原理凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。
因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分于量蛋白更早地被洗脱下来。
最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小。
中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，因此它们晚一些到达柱底，而小蛋白质可以逬入所有填料的孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。
材料与仪器蛋白质溶液缓冲液、蓝色葡聚糖溶液、乙醇、乙腈、乙酸、胃蛋白酶低压层析系统操作步骤1.凝胶的填装1.1凝胶的溶胀如果凝胶是脱水的干粉（例如Sephadex）在使用前需要溶胀。
1.1.1一份凝胶加10份的缓冲液，原则上应将凝胶颗粒放入洗脱缓冲液中。
1.1.2在摇床上或手动搅拌混合，避免使用电力搅拌器。
因为机械搅拌力会导致凝胶颗粒破裂成碎片，这些细小的碎片将干扰层析。
如果出现细小的凝胶碎片可将凝胶浆悬浮，待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止。
1.1.3自然溶胀需要24 h至数天，为了加速溶胀，可用热法溶胀。
即在沸水浴中将凝胶浆逐渐升温至近沸，这样可加速溶胀平衡，通常1～2 h即可完成。
这种方法不但省时，还可以排除气泡和消毒。
1.1.4无论凝胶是否需要溶胀，为了防止气泡影响层析，需用水泵或真空泵对凝胶浆抽气1 h。
1.2装柱1.2.1将层析柱垂直安装在无直接光照、无空气对流处，以防止由于温度变化使层析柱内产生气泡。
通常放在专用的层析冷柜中；1.2.2装柱前取3/4体积的凝胶和1/4体积的缓冲液制成凝胶浆；1.2.3对于经常使用的层析柱，建议使用一个商品化的流动相接头（flow adaptors）。
它对柱床表面有保护作用，还可以避免样品中的大颗粒混入凝胶中，从而延长层析柱的寿命；1.2.4将缓冲液加入层析柱，当有缓冲液流出时关闭柱的出口。
凝胶过滤的原理及应用
凝胶过滤的原理及应用1. 引言凝胶过滤是一种常见的分离技术，通过在凝胶中形成孔隙网状结构，将悬浮在溶液中的大分子物质过滤出来。
本文将介绍凝胶过滤的原理及其在科研和工业生产中的应用。
2. 凝胶过滤的原理凝胶过滤的原理基于凝胶的孔隙结构。
凝胶是一种网络状聚合物，具有高度的吸水性和可变形性。
当凝胶吸水膨胀后，其中的孔隙会形成网状结构，可以阻挡大分子物质通过，而允许小分子物质自由通过。
3. 凝胶的选择在选择凝胶时，需要考虑凝胶的物理性质和化学稳定性。
常见的凝胶材料包括琼脂、聚丙烯酰胺凝胶等。
琼脂凝胶适用于较大分子物质的过滤，而聚丙烯酰胺凝胶适用于中等和较小分子物质的过滤。
4. 凝胶过滤的步骤凝胶过滤的一般步骤如下：•准备凝胶：将所选凝胶材料按照说明书中的方法制备成适当形状和尺寸的凝胶。
•预处理凝胶：将凝胶在缓冲液中浸泡一段时间，以去除残留的缓冲液和其他杂质。
•将样品加载到凝胶上：将待过滤的溶液均匀地加载在凝胶表面。
•进行过滤：让样品在凝胶中进行自由扩散或使用外加力驱动，使分子通过凝胶孔隙。
•收集被过滤的样品：在凝胶下方放置收集容器，收集通过凝胶的溶液。
5. 凝胶过滤的应用凝胶过滤在科研和工业生产中有广泛的应用。
以下是几个常见的应用领域：•蛋白质纯化：凝胶过滤可以用于蛋白质的纯化和分离。
通过调整凝胶的孔径和适当的缓冲液条件，可以选择性地过滤出目标蛋白质。
•生物学研究：凝胶过滤常用于分离细胞、细胞器和生物大分子等。
例如，通过凝胶过滤可以分离核酸中的DNA和RNA。
•水处理：凝胶过滤可以用于水处理过程中的悬浊物去除和颗粒物过滤，使水质得到改善。
•制药工业：凝胶过滤可应用于药物的制备和纯化过程中，去除杂质和过滤微粒。
•生化工业：凝胶过滤可以用于酶的分离和提纯，进而用于工业生产过程中的催化反应。
6. 总结凝胶过滤是一种简单而有效的分离技术，通过凝胶的孔隙结构可实现不同分子大小的分离。
凝胶过滤在蛋白质纯化、生物学研究、水处理、制药工业和生化工业中有着广泛的应用前景。
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实践中 测定外水体积（Vo）
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。 理由是： 该物质分子质量大(为200万)，呈蓝色， 在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻， 并可借助本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测(在210nm或 260nm、620nm)洗脱体积Ve，即 V e = Vo
测定内水体积(Vi)
常用于： 分离纯化蛋白质(包括酶类)、核酸、多糖、激素、氨 基酸和抗生素等物； 还可用于: 测定蛋白质的分子质量，样品的浓缩和脱盐等方面。
第一节 凝胶的分类及性质
凝胶是不溶于水但在水中有较大膨胀度和较好分子筛 功能的一类化合物。 这化合物目前主要有： 葡聚糖凝胶 天然琼脂糖 交联琼脂糖 其次还有： 聚丙烯酰胺凝胶(生物胶Bio-gel) 交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶 交联琼脂糖与葡聚糖共结合的凝胶 (superdex) 详见表6-1。
三、聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio-gel。 它是以甲撑双丙烯酰胺(双体)作交联剂，以过硫酸铵 作催化剂， 在N,N,N’,N’,- 四甲基乙二胺(TEMED)加速剂的作用 下， 将丙烯酰胺(不同的产物。
该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵 抗力，在pH4.0~9.0的缓冲液中是稳定的。 琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰 胺和葡聚糖凝胶。 琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放 在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。 琼脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose 2B(2％)、4B(4％) 和6B(6％)。
Kav值的计算
从公式Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）看出， 只要测出：床体积Vt 外水体积Vo 洗脱体积Ve 即可计算出Kav值。
凝胶床总体积Vt的求得
有如下2种方法可求得Vt I.计算法 根据层析柱体积计算总体积，可用下列公式表示 Vt =πr2h 式中, r为层析柱半径； h为凝胶床高度； π为圆周率。
新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能， 需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响 (虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子质 量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时,需 预层析)。 此外；葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及 某些凝集素具有较强的吸附作用， 若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸附 性能，而不是排阻原理。
五、Superdex
Superdex是由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合 而成的。 该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学稳定性。 在用其分离样品过程中，溶液的酸碱度可在pH3~12范 围内变化，溶液中加入去污剂(如1％SDS)和(或)解离剂 (如8mol／L尿素、6mol／L盐酸胍)时，也不会影响分 离效果。 此凝胶共有6种类型，详见表6-6
II.测量法 已知，床体积Vt Vt=Vo+Vi+Vg 因Vg与Vt相比是很小的，可忽略不计，故 Vt=Vo+Vi Vo和Vi可以通过实验测得(见图6-3)，如下：
通过实验求Vo和Vi
当把分子质量不同的混合溶液铺在凝胶床上时，
溶液中的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而被 排阻在外水体积的溶液中。 凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水体积Vo， 即: Ve=Vo (Kav=0) 溶液中的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内； 凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积, 即: Ve=Vt=Vo+Vi (Kav=1) 则: Vi=Ve-Vo 溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则有一部分 能进入凝胶网孔，故其洗脱体积 Ve是在Vo和Vt之间(Kav在0～1之间)。
一、葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex。 它是由葡聚糖[右旋糖酐(G型)]和3-氯-1,2环氧丙烷(交 联剂)以醚键相互交联而成的。 其结构式如图6-1所示。
在交联葡聚糖G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应， 即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。
1．理化性质
四、Sephacryl
Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价 交联制成的。 属硬性凝胶，具有筛孔和少量的羧基基团。 Sephacryl吸水时，其珠状颗粒直径为25-75um(见表6-5)。 通常是用于水相系统中。 若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化。
它在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少； 它可在pH2~11范围内使用，当pH低时，葡聚糖链将发 生少许水解作用； 在0.2mol／L NaOH溶液中(室温)处理100h，对其低流 速和多孔性没有明显影响。 用去污剂(如SDS)、6mol／L盐酸胍和8mol／L尿素溶 液可作为洗脱剂， 高温(120℃)消毒(pH7.0时)处理后，层析性质没有明显 变化。 Sephacryl能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖 (proteoglycans)，甚至大的病毒颗粒(直径>300-400nm) 也可用它分离。 层析时，用细颗粒凝胶分辨率高
(2)粒度 凝胶的粒度有粗有细(与交联度无关)。 细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均一，因此分离效果 较粗得好 (见图6-4)。 但细颗粒凝胶流速慢，故宜用大直径的层析柱，这类 凝胶用于小型试验，可得到满意结果。 粗颗粒凝胶流速快，宜用于小直径的层析柱，如操作 得当也可得到较满意的结果。
第三节 操
一、凝胶的选择和处理
作
1．凝胶的选择 (1)型号 凝胶型号多。型号不同，筛分范围亦不相同。 Sephadex G型一般适宜于分离蛋白质。 蛋白质脱盐时，可选用凝胶SephadexG-25。 一般来说， 在规定的筛分范围内，混合物之间分子质量差别越大， 分离的效果越好。
除上述5类凝胶外，还有： Superose(高交联度的多孔琼脂糖珠，有制备级和分析级)、 玻璃珠 聚苯乙烯凝胶 等也具有分子筛功能。
玻璃珠 有大量的网孔，且分布均一; 它机械性能良好，在较高的层析流速下，分辨率并不 受影响; 缺点是对蛋白质等物质有吸附能力。
第二节 基本原理
凝胶过滤层析的基质: 具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的 物质。 排阻、扩散效应（见下图） 这种基质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于 筛孔之外， 而不能排阻某些小分子化合物，但可让其在筛孔中自 由地扩散、渗透。 任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围 均在0~100％之间。
二、琼脂糖凝胶
琼脂糖是从琼脂中分离出来的。 在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除 去，得到不带电荷基团的琼脂糖。 琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成 的多糖链。 这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到45℃ 以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环 的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。
以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶 液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称 为葡聚糖凝胶过滤层析。 以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机溶 剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为 葡聚糖凝胶渗透层析。
2．稳定性
葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和 有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学 降解。 在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消 毒0.5h，其性质并不改变。 在0.1mol／L HCl溶液中浸泡1~2h，甚至在0.02mol／L HCI溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。 当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解 断裂，因此，要避免与其接触。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防 腐剂如氯仿、0.05％NaN3 或20％乙醇等，不然微生物 将生长。
第六章 凝胶过滤
凝胶过滤（又叫分筛层析）是20世纪60年代发展起来 的一种分离纯化方法。 其原理是： 凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大 分子物却被排阻在外部; 当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质 就按不同分子质量筛分开了。 凝胶过滤特点：设备简单、操作方便、重复性好和样 品回收率高等。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含 10~20μg当量的羧基基团所致。 羧基基团能与分离物中电荷基团 (尤其是碱性蛋白质) 发生吸附作用。
这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克 服。 当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附 力了。
因此，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。
分配系数Kav
用分配系数Kav表示被排阻的程度；即：分离化合物分 配在内水和外水体积中的比例关系。 Kav值的大小依赖于凝胶床的总体积(Vt)、外水体积(V0) 以及分离物本身的洗脱体积(Ve)。即: Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）
在限定的层析条件下， Vt和Vo都为恒定值， Ve值是随着分离物分子质量的变化而变化的。 分离物分子质量大，Kav值小； 反之，Kav值增大。
可选用硫酸铵、N—乙酰酪氨酸乙酯，或者其他与凝胶无吸附力 的小分子物质。即： V i = Ve - Vo
洗脱体积Ve 分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者的洗脱体积 Ve也是通过实验测得。 故可求得某一分离物的Kav值=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）。
分离物在凝胶过滤层析时的行为，除用Kav和Kd表示外， 还可用Ve／Vo或Vo／Ve(R值)表示。这些值的大小见图 6-3。
Sepharose 6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B。
Sepharose与1，3-二溴异丙醇(1，3-dibromopropano1)在 强碱性条件下反应后，即生成CL-型交联琼脂糖。 这种琼脂糖的筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同， 但热稳定性和化学稳定性都有了提高。 CL-型交联琼脂糖可在广范围的pH溶液(pH3~14)中使 用，即使用较强的碱溶液短时间处理，其性能也不会 改变， 但是，在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚。 琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝 胶好。正如前章所述，用琼脂糖凝胶进行柱层析时， 流速可以快些。 琼脂糖凝胶的有关性质见表6-1和表6-3。