人骨髓间充质干细胞的体外连续传代及鉴定

ⅠCD105 ⅡCD90 ⅢCD44 ⅣCD29 图 6 hMSCs 的表面分子标志物流式分析图
图 7 成骨诱导形成的胞外钙结节被茜素红染色 呈红色 ×40
3讨论
1867 年 Cohnheim 首次提出在骨髓中可能存在非造血性 干细胞，20 世纪 70 年代中期 Friedenstein［6］等的研究证实了 骨髓中存在非造血干细胞即骨髓间充质干细胞这一事实。20 世纪 90 年代 Prockop［7］发现骨髓间充质干细胞具有多种分 化潜能，甚至具有横向分化能力。
2结果
2.1 hMSCs 的体外形态学特点和生长特性观察 经不连续密 度梯度离心获得的单个核细胞层培养 24 h 后，发现培养瓶内 有大量悬浮细胞，主要为圆形红细胞，换液除去悬浮细胞后可 见少量近圆形细胞贴壁生长（图 1）。48 h 后，可见较多的贴壁 细胞，散在生长，分布不均，胞体呈长梭形，少部分呈集落状样 生长（图 2）。7 d 后，贴壁细胞形成明显集落，形态比较一致， 呈漩涡状或辐射状排列，细胞胞体狭长（图 3），待细胞贴满瓶 底面积达 60%～70%时进行传代培养。连续传至 P5 代的 hM－ SCs 增殖速度较原代细胞快，但形态及生长特性无明显变化， 核呈椭圆形，并有 1～2 个核仁（图 4）。 2.2 P5 代 hMSCs 的鉴定
水平均高于 96％（图 6），表明扩增的 hMSCs 是一单一的干细
胞群。
2.2.3 hMSCs 多向分化潜能的检测 经成骨诱导培养 4 周
后，细胞形态发生改变，由长梭形变成立方形或矮柱状，伸长
天
图 5 P5 代 hMSCs 的生长曲线
2012 年 第 15 卷 第 1 期
广西中医学院学报
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许多细胞突起，一些突起互相连接，胞外出现大量钙盐沉积， 并形成多个钙结节，茜素红染色将钙结节染成红色（图 7）。经 成脂肪诱导后细胞形态开始变短、变圆，细胞胞质内形成许多 高折光性的脂滴，部分脂滴融合、增大，经油红 O 染色可将脂 滴染成红色（图 8）。
对于体外连续传代获得的骨髓间充质干细胞，本研究除 对其进行形态学观察外，还检测了细胞的生长曲线、细胞周 期、细胞表面分子标志物及多向分化潜能。研究发现骨髓间充 质干细胞呈贴壁生长，这符合由国际细胞治疗学会提出的鉴 定人来源间充质干细胞的标准之一，即在标准培养条件下，细 胞具备对塑料底物的贴附性［10］。对于骨髓间充质干细胞表面 分子标志物的检测主要通过 FCM 检测完成，结果发现细胞表 达目前比较公认的骨髓间充质干细胞表面分子标志 CD44、 CD105 和 CD29，且表达率均高达 98%以上。生长曲线分析则 体现了细胞具有活跃的分裂增殖能力，而这也是干细胞重要 的生物学特性之一。
图 1 培养 24 h 后，近圆形、贴壁生长的细胞 ×10
图 2 培养 48 h 后，贴壁细胞胞体呈长梭形，部分 细胞呈集落状样生长 ×10
图 3 贴壁细胞形态均一呈梭形，集落样生长，集 落呈漩涡状或辐射状 ×10
图 4 P5 代细胞增殖速度比原代快，形态及生长 特性无明显改变，核椭圆，核仁明显 ×40
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 实验材料 骨髓标本取自本院骨髓检查正常的志愿 者，男性，年龄 22 岁，供者对实验知情同意。 1.1.2 主要试剂 L-DMEM 培养基、H-DMEM 培养基和胎牛 血清均购自美国 Gibco 公司；胰蛋白酶、EDTA、β-甘油磷酸 钠、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、维生素 C 均为美国 Sigma 公司产品；FITC 标志的抗 CD44 mAb2、抗 CD105mAb、 抗 CD29mAb 和抗 CD90mAb 及其同型阴性对照均购自美国 ebioscience 公司。
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2012 年 第 15 卷 第 1 期
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实验研究
广西中医学院学报
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人骨髓间充质干细胞的体外连续传代及鉴定
岑妍慧，何国珍，郭文文，陈 芳，肖燕子，玉光强 （广西医科大学，广西 南宁 530021）
摘 要：［目的］将成人骨髓间充质干细胞（hMSCs）进行体外连续传代并对其进行干细胞特性的鉴定。［方法］采用不连续密 度梯度离心法进行人骨髓间充质干细胞的分离，使用含 10%胎牛血清的 L-DMEM 进行体外培养，经胰蛋白酶和 EDTA 联合消 化法体外连续传代至 P5 代后，对其进行生长曲线的测定、细胞周期和表面分子标志物的检测以及多向分化潜能的观察。［结 果］本实验可将 hMSCs 体外连续传至 P5 代，P5 代 hMSCs 在保持良好的分裂增殖能力的同时，表达 hMSCs 的表面分子标志物 及保持多向分化潜能。［结论］本实验成功地将人 hMSCs 进行体外连续传代并保持其干细胞的特性。
待原代培养细胞贴培养瓶底面积达 60％～70％左右时，吸 尽培养基并用 PBS 洗涤 1 次，加入 37 ℃预温的 0.25％胰蛋白 酶和 0.02％ EDTA 各 0.5 ml 混合消化细胞，约 3 min 后镜下 可 见 细 胞 收 缩 变 短 、间 隙 增 大 ，加 入 含 10％ 胎 牛 血 清 的 L-DMEM 终止消化。用吸管轻轻吹打直至贴壁细胞悬浮，吸 取细胞悬液，1000 r/min 离心 5 min，洗涤 2 次。最后用 10％胎 牛血清的 L-DMEM 培养液重悬细胞，分别接种于两瓶 50 ml 的培养瓶中，此时的细胞称为 P1 代细胞。同法进行以后各代 细胞的传代培养直至传至 P5 代。采用倒置显微镜下逐日观 察细胞形态。 1.2.2 P5 代 hMSCs 干细胞特性的检测 1.2.2.1 hMSCs 生长曲线的绘制 P5 代细胞使用胰酶消化，按 1×107/ml 密度接种于 96 孔培养板中，每孔培养液为 100 μl。 每 24 h 取细胞各 6 孔，MTT 比色法测各孔光密度值（OD490 值），连续测 8 天，以时间为横坐标、OD490 值为纵坐标绘制
2.2.1 hMSCs 生长曲线的测定 hMSCs 的生长曲线呈“S”形，
接种入 96 孔板第 1、2 天为细胞潜伏期，第 3 天进入对数生长
值
期，第 7 天到达平台期，第8 天曲线出现下降趋势（图 5）。
度
2.2.2 流式细胞仪 （FCM） 检测 hMSCs 的表面分子标志物
ห้องสมุดไป่ตู้
密 光
hMSCs 表面分子标志物 CD105、CD90、CD44 和 CD29 的表达
为进一步对骨髓间充质干细胞进行鉴定，本研究通过添 加成骨培养基［11］和成脂肪培养基［12］诱导其向成骨细胞和成 脂肪细胞方向分化。经成骨诱导培养 4 周后，观察到细胞外 有大量钙盐沉积；经成脂肪诱导培养后，观察到细胞内产生了 大量的脂肪。由此表明经体外诱导，骨髓间充质干细胞已经 向成骨细胞和成脂肪细胞方向分化，证实了其具有干细胞的 多向分化潜能。
骨髓间充质干细胞的数量较少，平均每 10 万个有核细胞 中仅含有 1 个 MSC［8］，随着年龄的增长，其数量亦逐渐减少［9］。 因此，建立适宜的体外分离培养、纯化及鉴定骨髓间充质干细 胞的技术和方法是进一步开展骨髓间充质干细胞应用研究的 重要基础。目前从骨髓中分离间充质干细胞的方案主要有： 密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠 法等。其中简单而又广泛应用的是 Percoll 或 Ficoll 密度梯度 离心法，该法利用骨髓间充质干细胞与其他细胞密度不同的 特点而达到分离目的，从而得到低密度的单个核细胞，然后利 用骨髓间充质干细胞的贴壁生长的特性达到有效将其分离的 目的。本研究采用的即是该方法。实验中观察到经密度梯度 离心法分离获得的单个核细胞培养 48 h 后即可见较多的贴 壁细胞，胞体呈长梭形，7 d 后细胞形成明显集落，集落呈漩 涡状或辐射状。细胞传代时采用胰蛋白酶和 EDTA 联合消化 法，利用骨髓间充质干细胞较易脱落的特点，保证其在短时间 内与培养瓶底分开，减少了消化对干细胞的刺激，从而使干细 胞得到有效的纯化。
收稿日期：2011-12-08 基金项目：广西教育厅研究生科研创新课题（2010105981001D34）；广西科技厅自然科学基金青年基金项目（2010GXNSFB013070） 作者简介：岑研慧（1980-），女，讲师，在读博士，主要研究方向：干细胞与相关疾病的研究
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Journal of Guangxi Traditional Chinese Medical University
1.2 研究方法 1.2.1 hMSCs 的体外分离、培养及连续传代 无菌抽取 5 ml 骨髓液并肝素化，与等量体积、含 10％胎牛血清的 L-DMEM 培养液混匀，置于 ficoll 分离液（比重 1.077）上，2000 r/min 离 心 20 min，离心后可见混合液从上至下共分四层：最上层淡 黄色的为血清；第二层为菲薄的白膜层即单个核细胞；第三层 为无色透明的淋巴细胞分离液；最底层为红细胞层。收集白 膜层中的单个核细胞，以含 10％胎牛血清的 L-DMEM 培养液 重悬细胞并进行计数，以 1×106/ml 的密度接种于 50 ml 的培 养瓶中，置于 37 ℃、体积分数 5％的 CO2 培养箱孵育。24 h 后 全量更换培养基以弃去非贴壁的细胞，此后隔天或视细胞生 长状态进行半量换液。
2012，Vol．15 No．1
各代细胞的生长曲线。 1.2.2.2 hMSCs 表面分子标志物的鉴定 以 0.25%胰蛋白酶 消化细胞，按 1×109/ml 重悬细胞，PBS 洗涤 1 次，重悬细胞并 分 3 管，分别加入 100 μl CD105、CD90、CD44 和 CD29，避光 孵育 30 min。1000 r/min 离心 5 min 沉淀细胞，倒去上清液， 加 500 μl PBS 进行流式细胞术（FCM）分析。设立同型对照。 1.2.2.3 hMSCs 多向分化能力的检测 对 hMSCs 分别进行成 骨及成脂肪方向的诱导分化。成骨诱导体系为含 10%胎牛血 清 、0.1μmol/L 地 塞 米 松 、10 mmol/L β - 甘 油 磷 酸 钠 和 含 50 μg/ ml 维生素 C 的 L-DMEM 培养液；成脂肪诱导的体系 为含 10%胎牛血清、1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L 3-异丁 基-1-甲基黄嘌呤及含 10 mg/L 胰岛素的 H-DMEM 培养液， 分别连续诱导 4 周。