林木组织培养繁殖

林木组织培养繁殖

用组织培养技术进行植物的快速无性繁殖的方法简称为试管繁殖（propagation by tissue culture），也称微体繁殖或微型繁殖。繁殖的植株称试管苗，以此与种子苗（实生苗）、扦插苗、嫁接苗相区别。

试管繁殖具有繁殖率高、微型、无菌的特点，能在人工控温、控光的条件下生长、繁殖。如在间20m2的恒温室内，可年产100万株试管苗，并可不受气候条件限制，一年四季进行繁殖，到适宜的时间再移植于大田。

林业的迅速发展需要大量优质苗木；良种更新换代频繁，特别是新育成品种，良种母树少，短期内要求提供大量良种苗木，按照传统繁殖方法难以达到这个要求。而利用组培育苗法，可有效地应用于快速繁殖推广良种。此外，采用试管培养可繁殖自然繁殖率低的植物、濒临绝种的资源植物、杂种F1代、三倍体与多倍体、自交不亲和系、雄性不育系等植物，并能在较短的时间内提供大量所需优良品种的植株，从而加速引种、育种与良种的推广进程，简化制种程序。试管繁殖结合生长点培养法可大量繁殖去病毒植株，以达到复壮种性的目的。

近年来，林木组培繁殖技术的研究有较大的发展。据不完全统计，现已研究成功的林木植物试管苗已达百余种，如松属、杉属、按属、杨属中的许多种，还有泡桐、银杏、枣、茶、棕桐、咖啡、椰子等，其中按树、杨树、辐射松和北美黄杉等已大面积应用于生产。按树组培工厂化育苗在我国也已大面积推广，澳大利亚、新西兰已分别实现用按树和辐射松试管苗造林，用幼芽培养每年可繁殖上百万株。

通过组培建立木本植物无性系时采用的材料有茎尖、茎段、形成层、叶、根、胚、下胚轴、上胚轴。花芽、花药、胚珠、珠心、雌配子体、果实等。一茎尖培养最为普遍。取样的部位不同，诱导效果亦有所不同，在杨树、杉木等的离体培养试验中均观察到这一现象。取样的季节也有影响，冬季取样，诱导效果较差，而以春季生长旺盛季节为佳。

林木的组织培养程序主要包括4个阶段：

第一阶段：无菌材料的建立与增殖的诱导。包括外植体的选择、常规方法的灭菌、培养基的选择等。

无菌营养系的建立是快速繁殖良种的重要环节。首先对接种的外植体要严格选择，挑选种性优良，树体健康，无病虫害，生长健壮发育饱满的芽条，进行灭菌消毒处理。对于含酚类物质较多的外植体，可将切取的材料浸入维生素液中处理，或在培养基中加入抗氧化剂，抑制组织切口氧化变褐。

第二阶段：继代增殖。包括增殖途径的选择、最适继代间隔时间的选择、培养基的选择和激素的调整等。

通常外植体的增殖有三种形式：

（1）器官发生，形成不定芽；

林木植物的器官发生（organogensis）植株再生包括直接的器官发生和间接的器官发生两条途径。间接器官发生是指先从外植体上诱导出愈伤组织，再从愈伤组织上诱导出不定芽或不定根原基的过程。从愈伤组织表面或内部形成芽和根，其分化取决于培养基中细胞分裂素和生长素的比例，高浓度的细胞分裂素有利于芽的形成，而高水平的生长素诱导根的形成。另外，在愈伤组织培养过程中普遍存在高频率的多倍性或非整倍性现象，这是值得注意的问题。

直接器官发生是指不经过愈伤组织阶段，直接从原始外植体上诱导产生不定芽或不定根的过程。这是木本植物器官发生植株再生的主要途径。直接器官发生植株再生的培养程序包括：

①芽分生区诱导；②芽的发育和伸长；③根分生区的诱导；④再生植株的发育和移栽等。

一般往往先诱导芽分化，然后将无根苗转入含有低浓度生长素或不含生长素的培养基上诱导生根，形成完整植株后移入土壤中。

（2）腋芽增殖植株再生

腋芽增殖植株再生（plant regeneration by auxiliary bud culture）与器官发生植株再生的培养程序基本相似，所不同的是幼芽的原始来源。腋芽增殖植株再生中的幼芽来自于外植体中现存的腋芽原基。腋芽增殖植株再生的优点是：①再生植株在遗传上比较稳定，自发变异频率低；②植株再生所需的时间短，植株粗壮，适应性强，移栽成活率高。腋芽增殖植株再生的基本培养步骤包括：①分生组织发育的启动；②幼芽的增殖和伸长；③不定根的诱导；

④再生植株的移栽。

（3）产生胚状体

据不完全统计，目前高等植物已有50科约180多种植物可经过胚状体发生（embryogenesis）途径再生植株。其中果树和林木植物有24科80多种。

胚状体可以在愈伤组织阶段形成，也可以直接在外植体上形成，原生质体培养在形成愈伤组织后，也能形成胚状体。离体产生胚状体的部位可以概括为6种类型：①外植体表皮细胞；

②外植体内部细胞；③愈伤组织表面细胞；④愈伤组织内部细胞；⑤胚性细胞复合体的表面细胞；⑤单个游离细胞。同一种植物可能有一种以上的类型。

应用组织培养法诱导优树体细胞产生胚状体如能成功，则无性系的来源将用之不尽。

但由于影响胚状体形成的内外因素极为复杂，实验材料甚至个体之间差异很大，进行研究仍存在一定困难，因而迄今尚无普遍规律可循，较为有效的还是选择合适的起始材料，控制激素条件和提供适合的营养条件。

许多实验证明，培养基中有生长素特别是2，4-D存在时，发生胚性细胞的分化，而胚

状体的进一步发育不需要2，4-D，甚至2，4-D有抑制作用。有些植物胚状体的发生需要适量的生长素或生长素与细胞分裂素的适当比例。也有些植物能在无激素的培养基上诱导形成胚状体。在营养条件方面，水解乳蛋白或酵母浸膏有促进形成胚状体的作用。谷氨酸胺、丝氨酸对胚状体的形成也有好的效果，维生素B能增加胚状体的数量。

芽分生区的诱导与外植体的生理状态、培养基组成、激素浓度和培养时间等有关。不定芽的伸长通常在无激素培养基上进行。Thorpe等发现，活性炭有利于不定芽的伸长。

继代培养间隔的时间，一般以3—4周为宜，不同果树应通过系统试验，确定最高增殖率的转代培养时间。同时还要研究不同材料继代培养次数的最适上限，以便及时采用新建立的无菌株系进行生产。因为随着继代培养次数增加，增殖能力随之下降，变异率会急剧提高。

第三阶段生根成苗

选择合适的试管无根苗，采用降低盐浓度的配方或是添加适量生长素的方法。

外植体大量增殖，通常产生的是无根芽苗，无根芽苗需要诱导生根，采用的生根培养基要降低无机盐浓度，减少糖和琼脂用量，添加吸附剂，如活性炭之类物质，对生根培养有一定作用。

无根芽苗经壮苗培养直接进行移苗，可以省略生根培养阶段，对商业化苗木生产，节省工本，缩短试管育苗期有实际意义。

第四阶段移栽成活

试管苗的移植是从“异养”到“自养”的转变过程，移植前试管苗要加强光照，让植株生长健壮，这种“炼苗”方法可以提高移植成活率。盆栽的土壤一般用泥炭土、珍珠岩、粗粒状蛭石等，将它们按一定比例混合使用。移植后的小苗管理，必须注意控制土壤湿度，掌握光照强度，使小苗逐渐适应外界环境条件。炼苗，适时移栽，保温、保湿以及适度的光照是保证该阶段顺利通过的主要因素。