生化实验四--果蔬中过氧化物酶分析

聚丙烯酰胺凝胶常分为两大类, 聚丙烯酰胺凝胶常分为两大类,一类是 连续的凝胶,另一类为不连续的凝胶. 连续的凝胶,另一类为不连续的凝胶.前者 凝胶系统的pH值 凝胶孔径是均一的, 凝胶系统的 值,凝胶孔径是均一的,电泳 过程中缓冲系统的离子强度及溶胶体系的各 部分电位梯度都是一致的. 部分电位梯度都是一致的.而后者则刚好相 反;前者电泳时只有电场和分子筛两种物理 效应,而后者除此外还有样品的浓缩效应, 效应,而后者除此外还有样品的浓缩效应, 故具更好的分离效果. 故具更好的分离效果.
6,电泳 , 按上" 接好电源线( 按上"-"下"+"接好电源线(上槽即加 样槽为负极) 将电泳槽置于4℃ 冰箱( 样槽为负极 ) . 将电泳槽置于 ℃ 冰箱 ( 或接通 电泳槽水冷却系统) 打开电源开关, 电泳槽水冷却系统).打开电源开关,调节电流 到 10mA 左 右 , 当 样 品 进 入 到 分 离 胶 后 加 大 到 30mA, 维持恒流 . 待溴酚蓝指示剂下行到距胶 , 维持恒流. 板末端1cm处, 即可停止电泳 . 关闭电源 , 电泳 处 即可停止电泳.关闭电源, 板末端 约3h. .
二,原理
聚丙烯酰胺凝胶的形成, 1,聚丙烯酰胺凝胶的形成,结构及特性
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺( 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 ( Acr) ) 和N,N- 甲叉双丙烯酰胺(Bis)聚合而成的 , 甲叉双丙烯酰胺( ) 大分子.凝结过程: 大分子.凝结过程:过硫酸铵溶于水产生大 量自由基,引发Acr与Bis也形成自由基, 在 也形成自由基, 量自由基 , 引发 与 也形成自由基 四甲基乙二胺( TEMED) 催化下这些自由 四甲基乙二胺 ( ) 基之间进行反应而聚合成凝胶. 基之间进行反应而聚合成凝胶.聚丙烯酰胺 凝胶是具有立体(三维)网状结构的大分子. 凝胶是具有立体(三维)网状结构的大分子 .
2,聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 , 凝胶电Biblioteka Baidu具有一般电泳的电场效应, 凝胶电泳具有一般电泳的电场效应,即 在一定pH的溶液中 , 在一定 的溶液中, 样品分子由于解离或 的溶液中 吸附,使自身带一定的电量, 吸附,使自身带一定的电量,在相同的电场 强度作用下,不同的样品分子因带不同的电 强度作用下,不同的样品分子因带不同的电 性和电量,电泳时具有不同的泳动速度, 性和电量,电泳时具有不同的泳动速度,使 最终的迁移距离不同而分离. 最终的迁移距离不同而分离.
核黄素 蔗糖 Tris 甘氨酸
4mg 40g 6g 28.8g
pH 8.3
前沿指示剂 各种果蔬
1g 琼脂粉 100mL 电极液 25.32g 蔗糖 16.7mL 甘油 0.1g 溴酚蓝 2%联苯胺 10mL 联苯胺 35.2mg 抗坏血酸 0.6%H2O2 10mL 30mL 水 0.1%溴酚蓝 溴酚蓝
五,操作
1,贮液配制(已完成) ,贮液配制(已完成) 2,安装电泳槽(安装,封底) ,安装电泳槽(安装,封底)
3,制胶(分离胶,光聚合,浓缩胶) ,制胶(分离胶,光聚合,浓缩胶) 拔出梳子,倒入电极缓冲液,备用. 拔出梳子,倒入电极缓冲液,备用. 4,过氧化物酶的提取 , 按下列比例称取果蔬: 按下列比例称取果蔬: 冬 枣 , 柚 子 , 梨 : 1:2 ; 萝 卜 , 盘 菜 : 1:10 ( W:V) , 剪碎 , 放入研钵中 , 加适量石英砂及 ) 剪碎, 放入研钵中, 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆, 置于离心管中, 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆 , 置于离心管中 , 研钵用少量提取液清洗,洗液并入离心管,以 14000r/min的转速离心 / 的转速离心15min,取上清液贮存于低 的转速离心 , 温冰箱备用. 温冰箱备用.
四,试剂与材料
A(分离胶缓冲液) 1mol/L HCL (分离胶缓冲液) / /100mL Tris TEMED B(浓缩胶缓冲液) 1mol/L HCL (浓缩胶缓冲液) / /100mL C(分离胶贮液) (分离胶贮液) 贮液 /100mL D(浓缩胶贮液) (浓缩胶贮液) 贮液 /100mL Tris TEMED 丙烯酰胺 丙烯酰胺 48mL 36g 24L 48mL 5.9g 48L 30g pH 8.9 pH 6.7 pH 8.9
二,实验材料,仪器设备与试剂 实验材料,
1,实验材料 , 各种果蔬 2,仪器设备 , 分光光度计, 研钵, 恒温水浴锅, 分光光度计 , 研钵 , 恒温水浴锅 , 100mL容 容 量瓶,吸管,离心机等. 量瓶,吸管,离心机等.
3,试剂 , 磷酸缓冲液( ⑴,0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH7.6) / 磷酸缓冲液 ) 反应混合液: ⑵,反应混合液: 100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.6)50mL于烧杯 / 磷酸缓冲液 磷酸缓冲液( ) 于烧杯 中,加入愈创木酚 加入愈创木酚28L,于磁力搅拌器上加热搅拌, ,于磁力搅拌器上加热搅拌, 直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入30%过氧 直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入 过氧 化氢19L,混合均匀,保存于冰箱中. 化氢 ,混合均匀,保存于冰箱中.
5,点样 , 将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中, 将稀释 倍的电极缓冲液倒入两槽中,上槽 倍的电极缓冲液倒入两槽中 即加样槽(短板侧)缓冲液要求没过样品槽, 即加样槽(短板侧)缓冲液要求没过样品槽,下 长板侧)缓冲液要求没过电极,备用. 槽(长板侧)缓冲液要求没过电极,备用. 用微量注射器( 用微量注射器(50L)吸取少量样液,在浓 )吸取少量样液, 缩胶上层点样,点样量: 缩胶上层点样,点样量: 冬枣,柚子, 冬枣,柚子,梨:15,30,50L 15,30,50 萝卜,盘菜:10,20,30 萝卜,盘菜:10,20,30L 点样时须小心,防止样品液扩散. 点样时须小心,防止样品液扩散. 向上槽液中滴加0.1%溴酚蓝 ～3滴. 溴酚蓝2～ 滴 向上槽液中滴加 溴酚蓝
实验材料: 实验材料:
冬枣+柚子 冬枣+柚子——1～4组 ～ 组 梨(2个品种)——5～8组 个品种) 个品种 ～ 组 盘菜+ 盘菜+萝卜 ——9～12组 ～ 组
实验四
果蔬中过氧化物酶分析
生命与环境科学学院 生化组
一,过氧化物酶同工酶的分离 ——(PAGE法 ——(PAGE法)
一,目的
1,了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构 , 特点. 特点. 2,掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及分离 , 过氧化物酶同工酶的电泳过程. 过氧化物酶同工酶的电泳过程.
三,实验步骤
1,取上述样品提取液 , 取上述样品提取液2.5mL,定容至 刻度, , 定容至50mL刻度, 备 刻度 用(仅指萝卜与盘菜,冬枣,柚子与梨不稀释). 仅指萝卜与盘菜,冬枣,柚子与梨不稀释) 2, 取光径 , 取光径1cm比色皿 只 , 于 1只中加入反应混合液 比色皿2只 比色皿 只中加入反应混合液 3mL和磷酸缓冲液 和磷酸缓冲液1mL, 作为对照 , 另 1只中加入反 和磷酸缓冲液 , 作为对照, 只中加入反 应混合液3mL和上述酶液 和上述酶液1mL(如酶活性过高可稀释 应混合液 和上述酶液 ( 立即开启秒表记录时间, 之),立即开启秒表记录时间,于分光光度计上测量 波长470nm下吸光度值 , 每隔 下吸光度值, 每隔1min读数一次 ( 连读 读数一次( 波长 下吸光度值 读数一次 5min,取平均值). ,取平均值)
生物化学实验 第一部分 果蔬成分的生化分析
综合实验一:
果蔬成分的生化分析
果蔬中维生素C的定量测定 的定量测定( 学时 学时) 实验一 果蔬中维生素 的定量测定(4学时) 果蔬中总糖及还原糖含量的测定( 学时 学时) 实验二 果蔬中总糖及还原糖含量的测定(4学时) 果蔬中蛋白质含量的测定( 学时 学时) 实验三 果蔬中蛋白质含量的测定(4学时) 果蔬中过氧化物酶分析( 学时 学时) 实验四 果蔬中过氧化物酶分析(12学时)
3,过氧化物酶同工酶凝胶电泳 , 过氧化物酶是植物体内的常见氧化酶. 过氧化物酶是植物体内的常见氧化酶.植物体 内许多生理代谢过程常与其活性及其同工酶的种类 有关.利用特异性颜色反应使待测酶着色, 有关.利用特异性颜色反应使待测酶着色,便可在 凝胶中展现出酶谱. 凝胶中展现出酶谱. 利用过氧化物酶能催化H 利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝 色或棕褐色产物的原理, 色或棕褐色产物的原理,将经过电泳后的凝胶置于 及联苯胺的溶液中染色, 含有H2O2及联苯胺的溶液中染色,出现蓝色或棕褐 含有 色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置, 色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置, 多条有色带即构成过氧化物酶同工酶酶谱. 多条有色带即构成过氧化物酶同工酶酶谱.
点样点到酶带的距离 Rf = 点样点到溴酚蓝前沿的距离
+
溴酚蓝前沿 酶带
-
×
点样点
二,过氧化物酶活性的测定
一,原理
在有过氧化氢存在下, 在有过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创 木酚氧化, 生成茶褐色物质, 该物质在470nm处 木酚氧化 , 生成茶褐色物质 , 该物质在 处 有最大吸收, 可用分光光度计测量470nm的吸光 有最大吸收 , 可用分光光度计测量 的吸光 度变化测定过氧化物酶活性. 度变化测定过氧化物酶活性.
亚甲基双丙烯酰胺 0.8g 10g pH 6.7 亚甲基双丙烯酰胺 2.5g
E 核黄素/100mL 核黄素/ F 蔗糖/100mL 蔗糖/ 电极缓冲液/ 电极缓冲液/100mL 用时稀释10倍 (用时稀释 倍) 封板胶 加热煮沸) (加热煮沸) 样品提取液 (0.1mol/L磷酸盐缓冲液 pH7.6) / 磷酸盐缓冲液 ) 临用时, 提取液中加: 临用时,每100mL提取液中加: 提取液中加 染色液
7,剥胶 , 取出胶板, 去掉胶套, 取出胶板 , 去掉胶套 , 用微量注射器沿玻璃 内面注入一定量水后即可掀开玻璃, 内面注入一定量水后即可掀开玻璃 , 去掉浓缩胶 注意先进行测量) 将分离胶放入培养皿. (注意先进行测量),将分离胶放入培养皿. 8,染色 , 将配制好的染色液倒入培养皿, 室温下染色 将配制好的染色液倒入培养皿 , 1～ 10min后显示蓝色条带 , 后变红褐色 . 用去离 ～ 后显示蓝色条带, 后显示蓝色条带 后变红褐色. 子水漂洗,并拍照记录. 子水漂洗,并拍照记录. 9,记录酶谱,并计算各同工酶的迁移率(Rf值) ,记录酶谱,并计算各同工酶的迁移率( 值
凝胶电泳与其他电泳的重要区别是它除了有 凝胶电泳与其他电泳的重要区别是 它除了有 电场效应外, 还具分子筛效应 分子筛效应: 电场效应外 , 还具 分子筛效应 : 凝胶是一种立体 网状结构物质, 网状结构物质 , 样品分子在通过凝胶网孔时受到 摩擦力等的作用, 其结果: 体积小, 摩擦力等的作用 , 其结果 : 体积小 , 且为圆球状 的样品分子受到的阻力较小, 移动较快, 的样品分子受到的阻力较小 , 移动较快 , 而体积 大 , 形状不规则的样品分子受到的阻力较大 , 移 形状不规则的样品分子受到的阻力较大, 动较慢. 因此, 动较慢 . 因此 , 凝胶电泳不但从分子带电情况的 差别, 而且还从分子大小 分子大小, 差别 , 而且还从 分子大小 , 形状等方面的差别来 分离样品分子,具有很高的分辨力. 分离样品分子,具有很高的分辨力.
样品分子在上层大孔径的浓缩胶中快 速移动到小孔径的下层分离胶时, 速移动到小孔径的下层分离胶时,由于凝 胶孔径突然变小而移动速度大大减慢, 胶孔径突然变小而移动速度大大减慢,使 之在浓缩胶与分离胶的界面处被浓缩成一 狭窄的区带,一齐进入分离胶, 狭窄的区带,一齐进入分离胶,然后再进 行与连续凝胶电泳类似的电泳分离. 行与连续凝胶电泳类似的电泳分离.
板栗
盘菜
三,器材
稳流稳压电泳仪; 稳流稳压电泳仪; 冷冻离心机及离心管; 冷冻离心机及离心管; 成套电泳槽; 成套电泳槽; 微量进样器( 微量进样器(50L) ) 高速离心机( 高速离心机(10 000r/min) ) 量筒: 量筒:500mL,10mL,5mL(各×1) , , ( ) 烧杯: 烧杯:250mL×4 × pH试纸; 试纸; 试纸 其它常规用具(玻棒,大培养皿等) 其它常规用具(玻棒,大培养皿等)