核酸杂交技术 分子生物学

ETOH ppt
Phenol
Pro K
SDS
Spin
ห้องสมุดไป่ตู้
CHCl3
tissue
2、限制性核酸内切酶切断DNA
➢基因组DNA很大，需要将其切割成片段后用于杂交分析。 ➢一般选择一种限制酶来切割DNA分子。 ➢有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交 叉顺序的DNA片段。 ➢消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活内切酶。 ➢样品可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩 DNA样品。
提取DNA 限制性内切酶消化
琼脂糖凝胶电泳 碱变性
转移到NC膜，高温烘烤 预杂交
与DNA或RNA探针杂交 放射自显影
1、 提取基因组DNA
➢ SDS使组织蛋白与DNA分子分离 ➢ 蛋白酶K消化分解蛋白质 ➢ 酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质， ➢ 乙醇沉淀纯化DNA ➢ 加入EDTA能抑制DNase的活性，RNase除去RNA，此法可获得 100~200kb的DNA片段。
三、核酸分子杂交的类型
核酸分子杂交可按作用环境大致 分为固相杂交和液相杂交两种类型。
以上两种类型根据具体的杂交方 式，反应条件等又可以分成多种类型。
1. 固相杂交
➢ 概念：参加反应的一条核酸链被预先固定 在固相支持物上，另一条核酸链则 游离在溶液中进行的杂交反应。
➢ 固相支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜、 PVDF膜、乳胶颗粒、磁珠、 微孔板，芯片等
➢基本原理：将RNA标本经琼脂糖凝胶电泳分离后转印至 硝酸纤维素膜上，烘干固定后于探针杂交。
➢注意：A 甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性,不 能用NaOH （会使RNA水解）。 B 样品RNA变性后进行电泳分离。 C 转印后，烘烤固定前不能用低盐缓冲液洗 D 胶中不能加EB（影响RNA与硝酸纤维素膜 的结合）
❖ 非放射性标记：化学发光标记、酶标记、荧 光标记等
➢根据探针中核酸的性质分：
DNA (包括cDNA) 探针 RNA探针(包括cRNA) 寡核苷酸探针 肽核酸（peptide nucleic acid, PNA）探针
(1)DNA探针（包括cDNA探针）的优点：
①这类探针多克隆在质粒载体中，易于扩增， 取之不尽，制备方法简便。 ②DNA探针较稳定（相对RNA而言）。
2. 探针设计的条件
具备下列条件之一，就可以设计、制备 特异性基因探针。
① 被检基因结构清楚；
② 有明确的基因产物;
3. 核酸探针的常用标记方法
核酸探针的标记 几乎总是先将底物标 记相应的信号，然后 利用核酸合成的方法 合成具有标记信号的 核苷酸链。
substrate
Pol.
probe
➢放射性探针的标记
核酸杂交技术
Nucleic Acid Hybridization
主要内容
核酸杂交概念及原理 核酸探针 核酸杂交的分类
Southern blot Northern blot chip ChIP on chip
一、核酸分子杂交的概念及原理
核酸杂交:两个不同来源的、含有互补碱基序列 的单股核酸分子，通过碱基配对形成一个新的、 稳定的双股分子的过程。
+
电极
缓冲液 滤纸 凝胶 尼龙膜 滤纸
真空转移法
5．膜的洗涤、固定
1）膜置于0.5M Tris·Cl（pH7.2）、1M NaCl中，室 温浸泡15分钟，除去粘附的琼脂糖。
2）将膜平铺于一张纸巾上，室温干燥30分钟以上。
3）DNA固定：在真空烤箱或普通烘箱内于80℃烘烤 0.5－2小时。
6.探针标记和预杂交
大肠杆菌DNA聚合 酶Ⅰ：5’→3’DNA 聚 合酶活性； 5’→3’ 核酸外切酶活性
（2）随机引物法（random priming）
随机引物：含有各种可 能排列顺序的寡核苷酸 片段的混合物。46 = 4096
DNA聚合酶ⅠKlenow片段： 5’→3’DNA聚合酶活性 弱3’→5’外切核酸酶活性 无5’→3’外切核酸酶活性
❖探针的类型、标记方法和浓度 ❖杂交反应温度 ❖杂交反应时间 ❖杂交促进剂
1. 探针的选择
根据不同的杂交实验要求，选择不同的探针：
核酸探针的质量（标 记效率和特异性）是核 酸分子杂交成功的关键。
1. 核酸探针的分类
➢根据标记物的性质分：
❖ 放射性标记:32P,35S,125I, 3H。
敏感度高，半衰期短（32P 14.3天，35S 87.1天， 125I 60天，3H 的半衰期长达12.3年，但它所释放 β放射线能量太低，只能用于组织原位杂交）， 有辐射危害。
❖用途：用于检测DNA和mRNA，以及研究基因表 达中的转录。
(3)寡核苷酸探针
采用化学合成的短链寡核苷酸探针, 最常用 的寡核苷酸探针有18-40个碱基。
特点：①链短、序列复杂度低、分子量小，与 等量靶位点完全杂交的时间短。 ②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱 基的变化。 ③一次可大量合成寡核苷酸探针，使得 这种探针价格低廉。
固相杂交的特点：
① 杂交后，游离片段容易经漂洗除去； ② 支持物上留下的杂交物容易检测； ③ 能防止靶DNA自我复性。
因此，该法最为常用。
分类： 菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、
Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、 组织原位杂交和夹心杂交等。
常用杂交方法介绍
（一）、Southern印迹（Southern blot ）
③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法 可供选择，能用于同位素和非同位素标记。
(2)RNA探针：主要是细胞mRNA和病毒RNA探针。
❖cRNA探针：以双链DNA中与mRNA 序列相同的 一条链为模板转录得到的RNA链，其序列与 mRNA互补，也称为反义RNA。
❖RNA探针和cRNA探针的特点：杂交反应效率高、 易于降解、标记方法复杂 。
3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,
其用切途除速：度分别为40和 4000nt/min
制备高比活性探针(1010 cpm/μg DNA); DNA末端修饰---缺失
外切酶活性
聚合酶活性
无dNTP
dNTP
生物化学与分子生物学系
➢ 探针纯化
✓ 乙醇沉淀法 ✓ 凝胶过滤法（G-50 Spin column）
预杂交：将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。
预杂交液 ：含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性 极低，不会与DNA探针杂交）、牛血清等。
southern印迹杂交炉
➢用杂交袋封装。 ➢每平方厘米NC膜需预杂交液0.2ml。 ➢鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰 上冷却1-2min，使DNA变性，保持单链。 ➢变性的鲑鱼精DNA加至终浓度200μg/ml。 ➢42℃水浴中温育4h。
（四）从冰箱中取出暗盒，置室温12h，使其温度上升至室温，然后冲 洗X光底片。
➢ Southern blot 的应用
Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术， 在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方 面有重要价值。
DNA指纹分析
血迹中的DNA
（二）、Northern印迹（northern blot ）
➢基本原理：
是1975年由英国人Southern创建，在遗传病诊断、DNA图 谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分 离，然后将DNA从凝胶中转印至滤膜上与探针杂交。
通过检测与探针互补DNA条带来确定在众多酶解产物中含 某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
➢ 产物平均长度为400-600个核苷酸。
➢ Klenow片段没有5 ’ →3’外切酶活性, 反应稳定, 可以获 得大量的有效探针。
➢ 反应时对模板的要求不严格, 用微量制备的质粒DNA模 板也可进行反应。
(3)末端标记法
T4 DNA聚合酶
5’→3’聚合酶活性，1500 nt/min, 为pol I的 两倍
生物化学与分子生物学系
核酸分子杂交技术原理
核酸经加热变性后，在低于变性温度 20℃-30℃时，反应系统中加入的核酸探针与 待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或 RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检 测特定的核酸片段。
二、核酸探针
核酸探针（nucleic probe）:带有可检 测标记，能与特定序列的核酸片段互补配 对形成双链的一段核酸。
甲醛变性电泳：
RNA提取
➢ RNA变性，消除RNA中的 二级结构，保证RNA完全按 照分子的大小分离。
➢ DEPC水处理电泳槽，去除 RNA酶。
➢ 在通风橱中加入甲醛，放置 一段时间以减少甲醛蒸汽。
甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交
杂交（变性探针） 洗膜
放射自显影或化学发光
四、核酸分子杂交实验因素的优化
a．处理膜时应戴手套并用平头镊子操 作，膜切角。 b．去离子水完全润湿膜，浸入变性转 移液至少5分钟。 c.制作转印“三明治”，用玻棒赶出其 间滞留的气泡。 d.DNA转移持续进行8-24小时。
毛细管虹吸转移法
滤纸 NC滤膜
凝胶
滤纸
重物 玻璃板 吸水纸 支持物
转移缓冲液
电转移法
–
电极
凝胶支持夹 海绵
➢将电泳凝胶移至碱性溶液中浸泡，使DNA变性，再用中性 pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。
4、将DNA转移至尼龙膜
将凝胶中单链DNA片段转移到固相支持物上。注意保持各 DNA片段的相对位置不变 。
用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC 膜）、尼龙（Nylon）膜、PVDF膜、化学活化膜和滤纸等 。
酶标法
碱性磷酸酶(AP)：
BCIP（5-溴-4氯-3吲哚磷酸盐-4-甲基胺蓝） NBT（四氮唑蓝）
酶标法
辣根过氧化物酶(HRP)： ➢DAB（二氨基联苯胺）→棕色 ➢TMB（四甲基联苯胺）→蓝色
地高辛标记
基本原理：
地高辛（ Digoxigenin，DIG）即异羟基洋地黄毒甙，是一 种类固醇半抗原，来源于植物（Digitalis purouren 和Digitalis lanta）的花和叶中。 DIG 可以与dUTP反应形成DIG-dUTP， 通过酶促法插入到合成的DNA探针中。通过酶标记的抗地高辛 抗体来实施检测。
非放射性探针的标记 ➢根据标记物的性质分：
▪生物素标记核酸 ▪酶标核酸 ▪半抗原标记核酸
➢根据标记方法分：
▪酶促反应标记法 ▪化学修饰标记法
生物素标记——酶促法
基本原理：
以生物素化的脱氧核 苷三磷酸（Bio-11-dUTP, Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP） 等代替相应脱氧核苷三磷 酸，经DNA聚合酶作用掺 入新合成的DNA。可以采 用切口平移法和随机引物 延伸法进行。
▪ 切口平移法（nick translation） ▪ PCR法 ▪ 随机引物延伸 ▪ DNA快速末端标记 ▪ T4多核苷酸激酶标记DNA 5’末端
(1)切口平移标记法（nick translation）
由DNaseⅠ和大肠 杆菌DNA聚合酶Ⅰ 共同完成。
DNaseⅠ：在双链 DNA上随机打开若 干个单链切口，产 生3’-OH端
生物素标记——化学修饰法（光敏法）
基本原理：
光敏生物素分子侧链上连接的芳香基叠氮化合物 具光敏感性，在一定波长的光照射下，光敏基团可活 化为芳香基硝基苯，很易与腺嘌呤N7 位氨基特异结合， 形成生物素化的核酸探针。
酶标法
使用交联剂戊二醛将辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸 酶（AP）标记在DNA上，再通过酶促反应使其无色底物转变成 有颜色的产物
7、杂交、洗膜
加入标记的探针DNA（预先热变性成为单链DNA分子）。 杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行，杂交过夜。 然后在较高温度下用盐溶液洗膜。 离子强度越低，温度越高。
8、放射性自显影检测
（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。 （二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶带 固定，合上暗盒。 （三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据 信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。
3、琼脂糖凝胶电泳和碱变性
➢ 先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长短进 行分离，然后进行杂交 。
➢ 琼脂糖凝胶电泳可分辨70－80000bp的DNA片段。DNA样 品与上样缓冲液混匀，上样。
➢ DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构
➢ 为了有效地实现DNA片段转移，最好将DNA片段控制在 2kb以下。若DNA片段大于15kb，将电泳凝胶浸泡在0.25M 的HCl溶液约10分钟作脱嘌呤处理，打断DNA片段。