荧光定量PCR检测技术
荧光定量PCR检测技术
如果检测到荧光信号超过域值被认为是 真正的信号，它可用于定义样本的域值 循环数（Ct）。 Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域
值时所经历的循环数。
什么是C(t)值
C(t)
Threshold（域值）
为什么要引入C(t)值
Endpoin
96 replicates of B7 gene molecular beacon
1 、采用闭管检测，不需 PCR 后处理， 并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩 增和检测一次同时完成。不需开盖，不
产生污染，避免了假阳性。
FQ-PCR与普通PCR的区别
2 、探针与被检 DNA 序列特异杂交， 增强了特异性。
A、上下游引物和探针三道关卡控制其 特异性； B、引物和探针都比较长，退火温度较 高，非特异性扩增几率减少。
FQ-PCR与普通PCR的区别
5、可以多重检测。
如果检测两种以上的基因片断，可以对各个 基因分别设计探针和引物，在不同的反应管 中进行TaqMan检测，或者将各自的探针分 别标记不同的荧光信号，在同一个反应体系 中检测多个基因片断。
二、SYBR荧光染料原理
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧 光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入 链中的SYBR染料分子不会发射任何荧 光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。
FQ-PCR与普通PCR的区别
3、可定量结果，准确灵敏地反应了 病原体的感染和治疗恢复情况。
FQ-PCR与普通PCR的区别
4、光谱分析仪直读结果，自动分析， 增强了 灵敏性和客观性。能够实时检测，即一边PCR， 一边检测PCR的结果，而不需要在PCR结束之 后进行核酸电泳来显示PCR反应的结果，（因 此实时荧光PCR检测技术操作更简单；也避免 了核酸电泳非常难以回避的化学污染和核酸污 染等严重问题）；
荧光定量PCR技术
03
结果重复性差
可能原因包括实验操作不规范、仪器 故障等。解决方案包括规范实验操作 、定期维护和校准仪器等。
05
荧光定量PCR技术在生物医学 研究中的应用
基因表达水平检测
绝对定量
通过标准曲线对未知模板进行定量分析，确 定基因的表达量。
相对定量
比较不同样本间基因表达的差异，常用于研究基因 在不同组织、不同发育阶段或不同处理条件下的表 达模式。
光信号的特性，实现对PCR产物的实时监测。
02
第二代荧光定量PCR技术
引入了特异性更高的荧光探针（如TaqMan探针），提高了检测的准确
性和特异性。
03
第三代荧光定量PCR技术
在第二代技术的基础上，进一步改进了荧光探针的设计，引入了多种荧
光基团和猝灭基团，实现了多重荧光定量PCR检测。
应用领域及意义
研究微生物与环境因素的相互作用
荧光定量PCR技术可用于研究微生物与环境因素（如温度、pH值、营养物质等）的相互 作用，揭示微生物在环境中的适应机制和生态功能。
食品安全领域应用
检测食品中的病原微生物
荧光定量PCR技术可用于快速、灵敏地检测食品中的病原微生物，如沙门氏菌、大肠杆菌等，保 障食品安全。
评估食品中的转基因成分
重复性原则
设计合理的实验重复和对照，以验证结果的 稳定性和可靠性。
定量准确性原则
选择合适的荧光定量方法和标准曲线，确保 目标序列的准确定量。
样品准备与DNA提取方法
样品准备
收集待测样品，如组织、细 胞、血液等，并进行适当的 处理，如研磨、裂解等，以
释放DNA。
DNA提取方法
根据样品类型和实验需求选 择合适的DNA提取方法，如 酚氯仿抽提法、试剂盒法等 ，以获得高质量的DNA模板
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
荧光定量PCR服务
荧光定量PCR服务荧光定量PCR（qPCR）是一种基于荧光信号进行定量分析的PCR技术，被广泛应用于遗传学研究、药物研发、病原微生物检测等领域。
qPCR能够快速、准确、灵敏地检测和定量特定的DNA序列，使其成为分子生物学实验室中不可或缺的工具之一、以下是关于荧光定量PCR服务的详细介绍。
一、技术原理qPCR是PCR技术的一种改进和扩展，它通过引入特定的荧光染料来监测反应过程中生成的PCR产物。
在PCR扩增过程中，荧光探针与特定的靶序列以及引物结合，生成荧光信号。
通过检测荧光信号的强度，可以判断靶序列的起始模板数量。
与传统的PCR相比，qPCR能够提供更加准确和精确的定量结果。
二、服务内容1.标准曲线法定量这是最常用的qPCR定量方法之一，通过构建标准曲线来确定靶序列的起始模板数量。
我们提供标准曲线法定量服务，客户只需提供样品DNA或RNA，并告知需要定量的靶序列。
我们将根据靶序列设计引物和荧光探针，构建标准曲线，进行PCR扩增和荧光信号检测。
最终，我们将利用标准曲线来计算样品中靶序列的起始模板数量。
2.绝对定量绝对定量是通过与已知模板数量的标准品进行比较，来准确计算样本中靶序列的起始模板数量。
我们提供绝对定量服务，客户只需提供需要定量的靶序列样本和已知浓度的标准品。
我们将使用标准品和样本一同进行PCR扩增和荧光信号检测，并根据已知模板数量和荧光信号强度计算样本中靶序列的起始模板数量。
3.相对定量相对定量是通过与内参基因进行比较，来获得样本中靶序列的相对表达水平。
我们提供相对定量服务，客户只需提供需要定量的靶序列样本和内参基因样本。
我们将同步进行靶序列和内参基因的PCR扩增和荧光信号检测，并根据两者之间的荧光信号强度比值计算靶序列的相对表达水平。
三、优势和保障1.高精度和准确度：我们的荧光定量PCR设备和试剂具有高灵敏度和特异性，能够提供高质量的数据结果。
2.严格的实验设计和操作：我们的技术团队拥有丰富的经验和专业知识，在实验设计和操作过程中严格按照相关标准和流程进行，确保结果的准确性和可靠性。
荧光定量PCR技术在基因检测中的应用
荧光定量PCR技术在基因检测中的应用引言PCR技术是分子生物学中的重要工具，是一种基于DNA模板进行体外扩增的技术。
PCR技术的发展促进了基因检测的发展，而荧光定量PCR技术作为PCR技术的升级版，在基因检测中有着广泛的应用。
本文主要介绍荧光定量PCR技术的原理、特点、优势及在基因检测中的应用。
一、荧光定量PCR技术的原理荧光定量PCR技术是PCR技术发展的一种变化，它通过测量PCR扩增反应体系中所含荧光染料的荧光强度，来确定扩增产物的数量。
荧光定量PCR技术的基本原理如下：1、往PCR反应体系中添加荧光染料在PCR扩增反应体系中加入荧光染料，如SYBR Green。
SYBR Green是一种具有振动激发的荧光染料，它可以与DNA双链结合并发出荧光信号。
2、采用实时荧光检测技术实时荧光检测技术可以实时测量PCR反应体系中SYBR Green 的荧光强度，并将其转换为扩增产物的相对数量信息。
每个PCR扩增周期结束后，都会利用荧光探针检测扩增产物的浓度，然后显示在计算机上。
3、荧光定量PCR技术的成本较高荧光定量PCR技术的成本较高，因为它需要使用专门的仪器和荧光染料。
二、荧光定量PCR技术的特点荧光定量PCR技术有以下特点：1、高灵敏度荧光定量PCR技术可以检测非常少量的DNA分子，甚至可以检测单个分子。
2、高精度荧光定量PCR技术具有高精度，可以检测极少数的基因。
3、高通量荧光定量PCR技术可以进行高通量分析，可以同时检测多个基因。
4、多重分析荧光定量PCR技术可以进行多重分析，可以同时检测不同基因的表达情况。
5、简单操作荧光定量PCR技术的操作简单，无需非常复杂的实验技能，实验人员可以很快地掌握技术。
三、荧光定量PCR技术的优势荧光定量PCR技术在基因检测中有以下优势：1、快速高效荧光定量PCR技术只需要很少的时间就可以完成分析，可以大大缩短实验周期。
2、高精度高灵敏度荧光定量PCR技术具有高精度和高灵敏度，并且可以进行多重分析。
荧光定量pcr
荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
原理PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
荧光定量PCR 实验步骤：样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
荧光定量PCR技术
荧光定量PCR技术荧光定量PCR技术（Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的多样性分析方法，它能够对DNA 分子进行定量分析。
本文将介绍荧光定量PCR技术的原理、优势以及应用领域。
一、原理荧光定量PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的，它通过添加与PCR产物相关联的荧光探针，利用荧光信号的定量变化来确定PCR反应中目标DNA的含量。
具体原理如下：1. 引物设计：根据目标DNA序列，设计一对特异性引物。
这两个引物分别作为PCR反应中的前向引物和反向引物，可以在PCR扩增的过程中特异性地结合到目标DNA序列的两端。
2. 荧光探针选择：为了检测PCR扩增产物的数量，需要选择一个荧光探针来标记目标DNA。
常用的荧光探针包括TaqMan探针、Molecular Beacons以及SYBR Green等。
3. 扩增过程：在PCR扩增过程中，前向和反向引物将目标DNA序列作为模板进行扩增。
同时，荧光探针与PCR扩增产物结合，并通过荧光信号被激发发出荧光。
4. 荧光检测：荧光定量PCR装置能够检测到荧光强度的变化，并根据标准曲线进行定量计算。
荧光信号的强度与PCR扩增产物的数量成正比。
二、优势荧光定量PCR技术相比于传统PCR技术具有以下优势：1. 高灵敏度：荧光定量PCR技术可以检测到极低浓度的目标DNA，其灵敏度通常可达到单拷贝水平。
2. 高特异性：由于设计特异性引物和荧光探针，荧光定量PCR技术对目标DNA的选择性很高，几乎不会产生假阳性结果。
3. 定量精确：通过荧光信号强度的定量变化，荧光定量PCR技术能够准确测定PCR扩增产物的数量，从而实现对目标DNA的定量分析。
4. 速度快：相比于传统的定量分析方法，荧光定量PCR技术的反应时间更短，结果可以在几个小时内得到。
三、应用领域荧光定量PCR技术在生物医学研究、疾病诊断和基因表达分析等领域得到了广泛的应用：1. 基因表达分析：荧光定量PCR技术可以定量检测不同基因在细胞或组织中的表达水平，为基因功能研究提供有力支持。
荧光定量pcr技术
荧光定量pcr技术1荧光定量PCR技术荧光定量PCR技术是一项临床检测技术，可以用于电子细胞学、遗传学分析和生物学研究的诊断和治疗，是现代分子生物学研究的重要技术和工具。
它可以用来快速准确测定微量的基因突变物，是一种重要的分子生物学技术。
2基本原理荧光定量PCR的基本原理是利用特定的核酸引物与靶序列结合能够将二碱基添加物体（TAMRA)附着到反应碱基处，当DNA聚合酶催化DNA模板反应完成后，产生大量逐渐增多（cumulative）的双链DNA分子，每一个Tama DNA分子会发出特定波长的荧光，可以以气运及成像仪检测曲线。
由此可以研究基因表达量或检测基因突变。
3结构图荧光定量PCR是由PCR反应体系、荧光检测系统和生物计算机软件三部分组成的。
PCR反应体系主要由PCR反应管，DNA聚合酶，引物，核酸模板，dNTP，反应矿物液等构成，而荧光检测系统由荧光检测仪、光学模块、滤波器和细节探查器等组成，生物计算机软件则含有数据处理和分析工具等。
4操作步骤（1）准备试剂=将相应的引物、模板酶、模板、等试剂准备完毕（2）反应杯=将试剂放入反应杯中（3）添加活性=加入活性DNA复制酶并完成反应（4）添加TAMRA探针=添加探针的复制物（5）样品吸附=将样品放入荧光PCR仪，待样品被荧光PCR仪件计数（6）数据处理=将获取的数据处理为连续变化线，并进行准确定量5应用荧光定量PCR技术最早用于病毒感染或突变的检测，后来也被广泛用于人类基因组学研究和生物分子临床检测。
荧光定量PCR技术可用于检测癌症的基因突变，诊断免疫过敏症状，检测病毒杂交异体，以及测定各种人体疾病的基因感染活性等多方面应用。
此外，还可用于分离基因扩增及基因电泳，核酸转录检测，组织学，血清学等技术领域。
6优势荧光定量PCR是一种灵敏而稳定的数据测定方法，能快速、准确地检测极微量的样品，具有视觉化简易性、灵活多变，还可同时检测多个基因样品。
此外，选用的引物和探针也极为可靠，重复性强，可以有效控制背景噪声，为分子诊断技术的发展做出巨大贡献。
荧光定量pcr的原理
荧光定量pcr的原理荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测DNA的技术，它结合了PCR和荧光探针技术，可以快速、高效地定量检测DNA样本。
荧光定量PCR的原理主要包括PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个部分。
首先，PCR扩增是荧光定量PCR的基础。
PCR是一种体外扩增DNA的技术，通过反复的热循环使得DNA序列得以扩增。
在荧光定量PCR中，扩增反应中加入了荧光标记的引物和探针，当PCR反应进行到特定的温度时，探针与目标DNA结合，导致荧光信号的释放。
PCR扩增的循环次数越多，荧光信号累积的越多，从而可以定量检测目标DNA的含量。
其次，荧光信号检测是荧光定量PCR的关键步骤。
在PCR扩增过程中，荧光信号会随着DNA的扩增而不断累积。
荧光信号的检测可以通过实时荧光定量PCR仪器来完成，这些仪器可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号强度，并将其转化为荧光信号曲线。
通过监测荧光信号曲线的变化，可以准确地测定目标DNA的含量。
最后，数据分析是荧光定量PCR的最后一步。
通过实时荧光定量PCR仪器获取的荧光信号曲线，可以通过计算机软件进行数据分析。
软件可以根据标准曲线和样本曲线的荧光信号强度来计算目标DNA的含量，从而实现对目标DNA的定量检测。
总的来说，荧光定量PCR的原理是通过PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个步骤来实现对目标DNA的定量检测。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。
希望通过本文的介绍，读者能够对荧光定量PCR的原理有一个清晰的了解，并能够在实验中正确应用这一技术。
荧光定量PCR检测技术
PCR扩增前
荧 光
完好探针
荧 光 淬
物
上游引物
质
灭 物
质
模板负链
PCR扩增时
DNA合成
探针水解，释放荧光
TaqMan® 探针
Donor dye (Reporter)
Acceptor dye (Quencher)
未结合的探针
Light Taq Light
Energy transfer
光发射或者以热量形式散失
前或向后）的序列，或重新选择一个探针， 再寻找合适的引物。
荧光定量PCR检测技术
（FQ-PCR, Fluorescence quantitative PCR）
实时荧光定量PCR技术
所谓real-time FQ-PCR技术，是指 在PCR反应体系中加入荧光基因，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进 程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。
是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂 交技术相结合的定量PCR方法。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切 酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬 灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到 荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产 物形成完全同步。
TaqMan检测技术
探针、引物与目的片段结合，FRET
Light Emission
Taq
Taq 水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离
TaqMan检测技术的设计
与普通PCR的设计基本相同，区别 在于引物与探针的设计一般需要特 定的软件，如美国ABI公司开发的 Primer Express软件。
荧光定量PCRPPT课件
仪器设备
确保PCR仪、荧光检测器 等设备正常运行，并按照 实验要求进行参数设置。
实验设计
根据研究目的和样本特性， 设计合理的荧光定量PCR 实验方案。
样本处理
样本收集
采集具有代表性的样本， 并妥善保存以备后续实验。
样本处理
将样本进行适当的处理， 如细胞分离、DNA/RNA 提取等，以获得足够的核 酸模板。
荧光信号检测
在PCR循环过程中，实时监测荧光 信号的变化，收集数据以供后续分 析。
结果分析
数据处理
结果应用
对荧光定量PCR实验数据进行处理， 如阈值设定、循环阈值（Ct值）计算 等。
将荧光定量PCR实验结果应用于后续 的研究或实际应用中，如基因表达分 析、病原体检测等。
结果解读
根据实验目的和预期结果，对荧光定 量PCR实验结果进行解读，并评估其 可靠性。
02
该技术利用荧光染料或荧光探针 标记特异性检测目标，通过荧光 信号的累积和检测，实现对目标 序列的实时定量分析。
荧光定量PCR技术的原理
在PCR反应过程中，随着DNA 的合成，荧光染料或荧光探针与
DNA结合，产生荧光信号。
随着DNA的扩增，荧光信号也 相应增强，通过实时监测荧光信 号的变化，可以计算出目标序列
基因突变检测
总结词
荧光定量PCR技术可用于检测基因突变，通过对基因序列的变异进行分析，有助于遗传性疾病的诊断、药物疗效 评估和个性化治疗。
详细描述
荧光定量PCR能够高特异性地检测基因序列的变异，包括点突变、插入和缺失等。通过比较正常组织和病变组织 的基因突变差异，有助于了解疾病的发生和发展机制，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。同时，基因突变检 测还可用于药物疗效评估和个性化治疗方案的制定。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于分子生物学的实验技术，可以对DNA或RNA目标序列进行定量分析。
本文将介绍荧光定量PCR的原理和结果分析，包括实验步骤、PCR曲线的解读以及测定目标序列的相对表达水平等。
一、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR技术主要基于PCR的原理，即通过模板DNA的逐渐扩增，来定量分析起始模板DNA或RNA的数量。
在实验中，荧光定量PCR通常使用DNA合成酶来合成目标序列的拷贝，通过在每个扩增周期后测量荧光信号的变化，来定量反应的进程。
1.准备试剂和反应体系：包括引物、合成的目标序列等。
2.PCR反应：在热循环PCR仪中，通过一系列不同温度的循环，使模板DNA的扩增合成逐渐发生。
3.荧光信号检测：通过在每个循环后侦测荧光信号的变化，来定量PCR反应的进程和模板DNA的数量。
4.数据分析：通过荧光信号的变化来计算模板DNA或RNA的相对表达水平。
二、荧光定量PCR结果分析1.PCR曲线的解读在荧光定量PCR反应中，通常会绘制荧光信号与PCR循环数的关系图即PCR曲线。
根据PCR曲线的形状，可以得到以下几个关键结果：(1)阈值循环数（Ct）：阈值循环数是PCR曲线上荧光信号超过背景信号的循环数。
Ct值越小，目标序列的初始模板数量越多。
(2) 扩增效率（Efficiency）：扩增效率可以通过计算PCR曲线斜率的反向值得到，通常表达为百分比。
扩增效率越高，说明PCR反应的有效性越好。
(3)Ct值偏移：Ct值偏移是指实验组与对照组（如阴性对照或基准组）之间的Ct值差异。
Ct值偏移的大小可以用于计算相对表达水平。
2.相对表达水平的测定相对表达水平是指在不同实验条件下，目标序列在不同组织或细胞中的表达量相对比较和定量分析。
常用的计算方法有：(1)∆∆Ct法：通过计算实验组与对照组的相对Ct值差异来获得相对表达水平。
∆∆Ct值越大，目标序列的表达水平差异越明显。
荧光定量PCR
荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。
其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。
荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。
2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。
因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。
TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。
在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。
只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。
荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。
cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。
2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。
3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。
4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。
荧光定量PCR技术
荧光定量PCR技术张淡如一、基本原理所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
二、操作方法2.1样品RNA的抽提1）收集菌液，将菌体转移至1.5 mL离心管or 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2）加入1 mL Trizol，用1 mL移液器吹至液体澄清且无细胞团块，颠倒混匀10次，室温静置5 min；3）加入0.2 mL氯仿，颠倒混匀10次，室温静置5 min；（离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
）4）4℃，12000 r m-1离心15 min后小心取出上层水相（约400 μL）至新的1.5 mL离心管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min；5）4℃，12000 r m-1离心15 min后去上清(此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块)，向沉淀中加入1 mL预先冰冷的75%乙醇（用DEPC水配制），4℃，7500 r m-1离心洗涤沉淀5 min；去上清，沉淀室温干燥5-10 min，加入10-20 μL DEPC水进行溶解。
（试管壁上洗下来）注意事项：超净台、枪等用DNase RNase away 擦拭，操作过程要在低温，人少的环境中进行。
2.2反转录1)去除基因组DNA反应按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA 样品。
荧光定量pcr技术及在动物疫病检测中的应用
荧光定量pcr技术及在动物疫病检测中的应
用
荧光定量PCR技术，简称“qPCR”是一项核酸定量分析技术，是
将PCR技术与荧光技术有机结合用于定量联合检测，是一种普遍被广
泛应用的实时定量核酸方法。
此技术可以用来定量探测和监测低浓度
的目标序列，能够明确定量探测细菌文库中的特定DNA或者RNA片段，并得出相应的结果，从而在核酸水平上更快更准确地鉴别目标片段。
结合荧光定量PCR技术在动物疫病检测中的应用，它可以在不牺
牲动物的前提下快速鉴定和定量检测疫病介质，从而实现迅速的微生
物检测，为检测疫情提供有力保障，改善疫情诊断和防控水平。
此外，荧光定量PCR技术还可以准确检测微生物中同单种、多种或突变类型
的比例，提供更准确的疫情评估，改善宠物和野兽的疫控措施。
此外，qPCR技术还可以用来准确评估细菌、病毒和真菌病原体的活性，以指
导治疗和手术咨询，准确检测抗生素对特定菌种敏感性等。
总之，荧光定量PCR技术具有快速准确、易操作、低成本等优势，使得它很好地解决了动物疫病领域检测需求，为动物疫情防控和宠物
治疗提供了一种新的重要方法，受到越来越多人的关注。
荧光定量pcr技术
荧光定量pcr技术
荧光定量PCR（Polymerase Chn Reaction）技术是一种
基于PCR原理的分子生物学技术，通过在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光信号的量化来测定靶标DNA的数量。
荧光定量PCR技术相比传统的定量PCR技术具有更高的灵敏度和准确性。
它可以实现对低浓度目标DNA的定量检测，并且可以同时检测多个靶标DNA。
荧光定量PCR技术的基本原理是，将待测样品中的DNA
模板与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，然后通
过PCR反应，在每一个PCR循环中，荧光探针与靶标DNA结合并发生剪切反应，荧光信号释放出来并被检测仪器检测到。
荧光定量PCR技术常用的荧光探针有TaqMan探针、Molecular Beacon探针和Scorpion探针等。
这些探针一般由专门设计的两个引物和一个含有荧光染料和荧光抑制
剂的short oligo组成。
通过检测荧光信号的增强程度，荧光定量PCR技术可定量反映靶标DNA的初始量。
通常采用标准曲线法或计算相对表达法来进行定量结果的分析。
荧光定量PCR技术在医学诊断、基础生物学研究和遗传学分析等领域得到了广泛应用，有助于快速、准确地检测和定量目标DNA。
荧光定量PCR技术简介
一、荧光定量PCR技术的基础理论
7、mRNA差异表达的相对定量分析
两种相对定量的分析方法：双标准曲线法和Delta-delta Ct法。
一、荧光定量PCR技术的基础理论
7、mRNA差异表达的相对定量分析
（1）、双标准曲线法 所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对 定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相 对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。
二、引物及Taqman探针的设计
4、Taqman探针及引物合成时注意事项
（1）、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成； （2）、先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，电泳检测PCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特 异性扩增情况，必要时进行PCR产物的测序验证； （3）、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多 以外的损失； （4）、探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm的探针终浓度， 25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量PCR仪上检测， 95℃，2min; 95℃，20s，60℃，20s，40个cycles；看荧光本底 和光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量 较差，建议重新合成。
一、荧光定量PCR技术的基础理论
1、荧光定量PCR技术概论
荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通 过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。 系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。
一、荧光定量PCR技术的基础理论
相对定量： 2
-△△CT
法
二、引物及Taqman探针的设计
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实时荧光定量PCR原理
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数 方式增加的，随着反应循环数的增加，最终 PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入 平台期。
在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧 光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此 用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。
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利用电泳定量
荧光定量PCR检测技术
（FQ-PCR, Fluorescence quantitative PCR）
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实时荧光定量PCR技术
所谓real-time FQ-PCR技术，是指 在PCR反应体系中加入荧光基因，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进 程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。
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（一）选择靶基因
TaqMan技术主要用于检测，所以其扩增 的基因必须是特异的，如：
某种病原微生物所共有的保守基因 （检测某种病原微生物）；
某个血清型所特有的基因序列 （区分检测某个血清型）；
选择决定毒力强弱的基因 （区分强毒和弱毒）.等。
（二）选择探针
选择探针需要同时满足以下条件： 1、在靶基因的保守区域 2、G+C含量在40%以上； 3、相同碱基连续不超过4个；
4、Tm值在71±2℃;
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（二）选择探针
5、内部自身配对较少； 6、5’端不为G； 7、G数目比C数目少；
如果6和7难以满足的时候，就要考 虑用互补序列作探针。
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（三）选择引物
探针选好之后，在探针的上下游分别选 择合适的引物序列，引物应满足如下的 条件:
1、在靶基因保守和无二级结构的区域； 2、与探针所在区域不重叠；
11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference
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实时荧光定量PCR原理
在real-time Q-PCR中，对整个PCR反 应扩增过程进行了实时的监测和连续地 分析扩增相关的荧光信号，随着反应时 间的进行，监测到的荧光信号的变化可 以绘制成一条曲线。
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标准曲线
如何定量
未知样品的C(t) 值
定量
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荧光化学
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分 为两种：荧光探针和荧光染料。
荧光探针：TaqMan荧光探针 荧光染料：SYBR荧光染料
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一、TaqMan检测技术原理
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入 一个特异性的荧光探针，该探针为一寡 核苷酸，与扩增片断内部某一段系列相 同或互补，两端分别标记一个报告荧光 基团和一个淬灭荧光基团。
光发射或者以热量形式散失
探针、引物与目的片段结合，FRET
Light Emission
Taq
Taq 水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离
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TaqMan检测技术的设计
与普通PCR的设计基本相同，区别 在于引物与探针的设计一般需要特 定的软件，如美国ABI公司开发的 Primer Express软件。
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探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切 酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬 灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到 荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产 物形成完全同步。
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TaqMan检测技术
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是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂 交技术相结合的定量PCR方法。
PCR的高效扩增特性ຫໍສະໝຸດ 核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性
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实时荧光定量PCR
定义
利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控
目的
对起始模板进行定量
优点
灵敏，重复性，动态范围宽，高通量
原理
Ct 值与起始模板浓度的对数成. 比例
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实时荧光定量
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
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实时荧光定量PCR原理
利用已知起始拷贝数的标准品可作出 标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝 数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要 获得未知样品的Ct值，即可从标准曲 线上计算出该样品的起始拷贝数。
Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域
值时所经历的循环数。 .
什么是C(t)值
C(t)
Threshold（域值）
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为什么要引入C(t)值
96 replicates of B7 gene molecular beacon
Ct
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Endpoin
实时荧光定量PCR原理
研究表明，每个模板的Ct值与该模 板的起始拷贝数的对数存在线性关 系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
原理示意图
荧 光
完好探针
荧 光 淬
物
上P游C引R物扩增前 质
灭 物
质
模板负链
DNA合成
PCR扩增时
探针水解，释放荧光
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TaqMan®
Donor dye (Reporter)
Acceptor dye (Quencher)
探针
未结合的探针
Light Taq Light
Energy transfer
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（三）选择引物
3、与靶基因其他区域配对较少； 4、G+C含量在40%以上； 5、相同碱基连续不超过4个；
6、Tm值比探针Tm值低10±1℃;
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（三）选择引物
7、探针与两条引物之间的各种组合形成 的二聚体都较少，特别是引物3’端与探针 配对很少；
8、PCR扩增片断在70—250个碱基之间。 如果找不到合适的引物，可调整探针（向
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实时荧光定量PCR原理
在PCR反应早期，产生荧光的水平不能 与背景明显地区别，而后荧光的产生进 入指数期、线性期和最终的平台期，因 此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推 断模板最初的含量。
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实时荧光定量PCR原理
为了便于对所检测样本进行比较，在real-time QPCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值 （threshold）。
以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号 （baseline），荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
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实时荧光定量PCR原理
如果检测到荧光信号超过域值被认为是 真正的信号，它可用于定义样本的域值 循环数（Ct）。