第三章 第二节蛋白质理化性质

Un-ionized form
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Tab. Weak acid groups of the amino acids present in proteins
α-Carboxyl
Conjugate Acid R-COOH
Conjugate Approximate pKa
R-COO-
2.1±0.5
Non-α-carboxyl (Asp,Glu)
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热变性： 50-60℃以上加热引起的蛋白质变性。 可逆、不可逆；多数为凝聚和沉淀的不可逆变性。 次级键变化。
• 酸和碱变性：酸和碱与蛋白质上的碱性或酸性氨基酸残基相互作用，
使维持蛋白质构型的分子内有利的荷电吸引力变成静电排斥作用，因 而导致结构松散。
• 蛋白质一般在pH 4-10范围内稳定（等电点附近比较稳定），超过这
生物化学性质改变：蛋白质变性后，分子结构 伸展松散，易为蛋白质水解酶所分解。
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变性蛋白质
变性的可逆性 可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构
可以恢复原状。 不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结
构不能恢复原状。
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4．变性的可逆性
轻度变性可逆，过度变性不可逆。
胃蛋白酶加热至80℃－90℃时，变性、 无消化蛋白质的能力，失去溶解性。如 将温度下降到37℃，就复性，又恢复溶 解性和消化蛋白质的能力。但如变性时 间加长，条件加剧，变性程度加深，就 成为不可逆变性。
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3．等电点的测定
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4. 等离子点 等离子点是蛋白质在不含其它溶质的纯水中，蛋白质
所带净电荷为零时的溶液的pH值。等离子点是一个特 征常数。
蛋白质在纯水中的等电点为等离子点.
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（三 ）电泳
含义： 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定 向移动的现象称为电泳。 影响电泳速度因素：带电粒子的大小，形状， 所带的静电荷多少、介 质的pH，粒子强度、粘度；
R-SH
R-S-
12.5 8.3
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2. 等电点 在某一pH值时，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即
净电荷为零，此时溶液的pH值就是蛋白质的等电点。 特有的等电点----是鉴别蛋白质的指标之一。
等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关。
蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系:
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蛋白质在等电点的溶解度最小
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可逆的沉淀反应
蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起 沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶 剂中，并保持其天然性质而不变性。
用于提纯蛋白质。
不可逆沉淀反应
蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变 性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。
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（七）沉降作用
沉降：溶液中的颗粒或溶质在重力或离心力作用下发性不能输送 O2,酶变性失去催化作用。
物理性质改变，如：溶解度降低，粘度升高， 失去结晶能力，旋光值改变。
化学性质改变，如：蛋白质变性时，有些原来 在分子内部包藏而不易与化学试剂起反应的侧 链活性基团，由于结构的伸展松散而暴露，易 与化学试剂反应。一些侧链基团暴露（如-SH 、咪唑基、-OH），可测定基团增加 。
• 变性理论
次级键二、三级结构的结合力--破坏--肽链从紧密有序结构→松 散无序的结构--理化和生物性质改变--蛋白质变性本质。
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2．变性的因素
物理因素: 加热、加压、紫外线、X-射线、激烈摇荡或搅拌、超声波 等。
化学因素: 酸（单宁酸）、碱、有机溶剂（丙酮、酒精）、 蛋白变性剂（尿素、盐酸胍）、重金属盐等。
蛋白质的亲水胶体溶液稳定：表面形成“水化层”； 在非等电点时带有同种电荷，相斥不聚合
胶体溶液具有布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、吸附能力，不能透过半透 膜等特性。
蛋白质胶体溶液的稳定性与分子量大小、带的电荷和水化作用有关。
构成生物细胞的原生质，是异常复杂的非均一性胶体系统。
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（二）酸碱性质和等电点
1. 蛋白质分子的可解离基团
蛋白质分子为兼性分子： 蛋白质分子中含有多个可解离的酸性或碱性基团:（酸性基
团主要是C末端羧基及酸性氨基酸侧链的羧基，碱性基团有N 末端的氨基及碱性氨基酸侧链的氨基、胍基及咪唑基）。
NH3+ | Pr-COO-
Dipolar ion (or zwitterion)
NH2 | Pr-COOH
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（五）凝固作用
变性蛋白质互相凝聚或互相穿插在一起的现象称蛋白质的凝固。
加热凝固
将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生 凝固(coagulation)而沉淀。
加热首先使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散 状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露， 进而凝聚成凝胶状的蛋白块。
个范围就会发生变性。少数酶，如溶菌酶和RNA酶对酸比较稳定，它 们只在pH低于2.0的情况下才发生变性。
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尿素和盐酸胍变性(常用蛋白质变性剂)： 分子中与氮原子结合的氢原子具有与蛋白质形成氢键的
能力。 变性剂浓度为6mol／L，大多数蛋白质分子都由折叠构
型变成完全伸展的构型。蛋白质寡聚体都离解为亚基． 有些蛋白质还发生凝聚或沉淀。
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（4）生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质
蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)及某些酸(如三氯醋酸、过氯 酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样 蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。
临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可 用于检验尿中蛋白质。
COO-
Ag+
+ P NH3
COOAg
重金属有杀菌的 作用--它能沉淀 蛋白质。
蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于 等电点为宜。因为此时蛋白质分子有较多的负离子易与重金属离子结合成盐。重金属 沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分 离制备不变性的蛋白质。
当带电分子匀速移动时： F = F’
∴ q·E = 6πrηυ 电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度：
υ m=
E
q m=
6πrη
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(四) 变性作用（denaturation） 1．变性的概念和理论
概念：变性是指蛋白质受物理或化学因素的影响，使蛋白质分 子原有的特定的空间结构发生改变，从而导致蛋白质性质的改 变以及生物活性的丧失。
等电聚焦 (IEF isoelectric focusing ) 在电解槽中放入两性电解质载体（carrier ampholytes），当通
以直流电时，即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度。当把两 性大分子放入此体系，不同的大分子即移动并聚焦于相当其等电点 的pH的位置。
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称 IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持 物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解 质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和 连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当 迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。
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沉降系数的测定
沉降系数通过分析离心机测定。 通常只需要几十毫克甚至几十微克样品，配制成1~2毫升 溶液，装入分析池，以几小时的分析离心，就可以获得一 系列的样品离心沉降图。 沉降图：定性分析
测定各组分的沉降系数、估计分子大小 样品纯度检定、不均一性测定
组分的相对含量测定。
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测定原理
恒定的离心力场，测定样品颗粒的沉降速度
电场对带电分子的作用力
F=q • E
球状分子，粘滞力F’的服从Stokes定律，即：F’=6πrηυ r-球状分子半径，η-缓冲液粘度，υ-电泳速度(υ= d / t，单位时间 粒子运动的距离，cm / s )。
F’大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有 关，并与带电分子的移动速度成正比。
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（六）沉淀作用
在一定的理化因素影响下，蛋白质稳定的亲水胶体颗
粒因失去电荷和脱水，甚至变性，则以固体形式从溶 液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。
…… …
… O
H-OH
… C -NH
O
C -N·H
-
H-OH
NH2 H-OH
-OH H-OH
蛋白质分子含有肽键，NH2、-COOH、-OH等， 可与水分子形成氢键而形
表面活性剂变性 低浓度SDS可使蛋白质变性 十二烷基硫酸钠SDS 的脂肪族长链可与蛋白质内部的非极性基团相互作用，而 带负电荷的硫酸根可溶于水中。导致蛋白质分子的构型发生变化。寡聚体离 解成亚基，亚基由球状变成细杆状。杆状的SDS-蛋白质复合物、其表面分布 着大量的SDS 负电基团，易溶于水。
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3 变性蛋白质的特性
各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混合蛋白质组分的分离。
（2）脱水剂 酒精、丙酮等对水的亲和力很大，可以夺取水化膜中的H2O，
故蛋白质的水化膜被破坏，使蛋白质沉淀出来。
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（3）重金属盐
蛋白质可以和Hg2+、Cu2+、Pb2+、Ag+等重金属离子结合成不 溶性蛋白质。
+ P NH3
蛋白质大分子溶液在一定溶剂中超速离心时可发生沉降。
沉降速度：指离心时，蛋白质分子在单位时间内下沉的距 离。
dr ν=
dt
t：时间（sec） r：下沉的距离（cm）
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沉降速度与向心加速度之比值即为蛋白质的沉降系数S。
沉降常数（沉降系数）：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度