HPPD 酶及其抑制剂构效关系的研究进展

朱有全 男，38 岁，博士生，现从事高效 HPPD 酶抑制剂开发及构效关系研究。 *联系人 国家自然科学基金资助项目(29832050) 2003-04-22 收稿

化学通报 2004 年 第 67 卷
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有关 HPPD 提纯、晶体结构、在动植物体内的作用机制及其构效关系等方面的研究概况作一综述。
下，晶胞参数为 a=76.60 Å，b=142.75 Å，c=159.44 Å。
活性中心铁离子
图 2 晶体结构图 Fig.2 The active-site pocket of HPPd
图 3 模拟 HPPD-HPP 络合图 Fig.3 The binding model of HPPD-HPP
由图 1 可以看出，水平方向两个单体呈面背平行结合，上下通过 N-端结合，形成四聚体， 四个活性反应中心，当其中一个活性中心与底物结合时，相应会引起酶空间结构的变化，使水 平对称的另一活性中心的活性受到影响，活性降低，影响程度视抑制剂与酶结合的程度。这与 文献[9]所做的工作相符合：由于 DKN(diketonitrile)与 HPPD 二聚体为紧密结合，严重影响了另 一个的活性中心与 DKN 的结合反应，致使其与二聚体 HPPD 的化学计量比为 1/1。而与 HPPD
为 27.6%，R 因子为 21.9%，计算采用的衍射范围为 20.0～2.4Å，测定结果表明，具有非晶体 222
对称性，每个单体表面积为 2600Å2，晶包中包括 11119 个非氢原子、4 个铁原子、4 个二乙基
汞分子、4 个乙酸酯分子和 482 个水分子。晶体属正交晶系，空间群为 P212121；在 100K 条件
富马酸乙酰乙酯酶缺乏活性积累的琥珀酰基乙酰乙酸乙酯等体内物质，形成对肝肾有毒的代谢
物(即酪氨酸病产生的根本原因)。HPPD 抑制剂的使用，抑制了催化降解过程的发生，进而抑制
了有毒(副)产物的形成，从而达到了治疗疾病的目的[16]。
HPPD 在植物体内将 HPP 催化转化为 HGA 这一过程可能的反应机制，主要有：(1)Witkop

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HPPD 酶及其抑制剂构效关系的研究进展
朱有全 胡方中 杨华铮*
(南开大学元素元素有机化学研究所 有机化学国家重点实验室 天津 300071)
徐海珍
(天津师范大学化学与生命科学学院 天津 300074)
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摘 要 植物体中的对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)酶对动植物的生长发育起着至关重要的 作用。本文综述了 HPPD 酶的晶体结构、作用机制及其抑制剂的作用机制、构效关系。
关键词 对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD) 抑制剂 构效关系
Reviews on 4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase Enzyme and the Structure-activity Relationships of its Inhibitors
Zhu Youquan, Hu Fangzhong, Yang Huazheng*
三酮部分
A
O
B
C
O
O R1 R2
R6
R3
环己二酮
R4
酮系统和其它等四部分，如右图所示。 4.1 苯环部分结构上的变化对化合物抑制能力的影响
R5
苯环部分
Lee 等[26]通过测定一系列的 2，X-二氯代化合物和 2，X，Y-三氯代化合物的活性发现，2,4-
二氯代、2,3,4-三氯代模式效果最好，2,4,5-三氯代效果最差。经进一步对一系列 2-氯(或硝基)-4-
1 HPPD 的提纯和活性分析
纯 HPPD 可以从动物肝、玉米、细菌等生物体中纯化来获得[9~11]。 HPPD 活性的分析通常采用的方法有：(1)测定 HPP 转化为 HGA 所消耗的氧气量[12,13]；(2) 测定释放的 14CO2 的量[10]；(3)分光光度法[11]；(4)用高效液相法测定生成的 HGA 的量[7,14]。
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4 HPPD 抑制剂的构效关系
HPPD 抑制剂和 HPP 在作用体系中，在氧气和铁离子存在下，竞争性地与 HPPD 活性中心
铁离子键合成配合物，抑制效果与抑制剂和酶的结合程度有关[18,23,24]。依据现有文献报道，HPPD
抑制剂主要有如下几类。
O
R1
O O
2 HPPD 的晶体结构
Laurence 等 [15] 采 用 SIRAS 方 法 测 定 了
Pseudomonas fluorenscens HPPD 的晶体结构。结果显
示，该酶以四聚体形式存在且通过两两 N-端相结合
形成上下对称的聚合结构，如图 1 所示。每一结构单
元都包含有两个重复的βαββα结构。正如图 2 所示，
深入的研究，有助于通过有效的抑制剂与酶结合的模拟，针对性地合成抑制剂目标分子，如图
3 所示。
O
O
SO 2CH 3
O
O
Cl
O
CH3
O
CN
DKN
H3C CF 3
O
S
CH3
RPA 206740 O
3 HPPD 及其抑制剂在动植物体内的作用机制
HPPD 在人及其它哺乳动物体内的主要作用是促进酪氨酸的代谢，但它还能够催化代谢因
2

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二聚体结合较为松弛的 RPA206740 的实验结果显示，与二聚体的化学计量比为 1.2:0.5，即抑制
剂/活性中心的摩尔比为 1.2/1，这就是由于二者的结合能力差,导致蛋白质空间构型变化较小，
反应中心趋于全部参与，且抑制剂浓度的提高有利于平衡向络合物方向进行。因此，对酶结构
基化以及羧甲基的 1、2-迁移的反应过程机制。该反应六配位过渡态假设结构也获得 Laurence
等[15]报道的 HPPD 活性中心配位结构的佐证。
-O
O
O
H3C
H3C OH
Fe(II)
En
O
Fe
O
O
O
O
O
O-
-O
H+
OH
O
COO-
H
OH CO2
COO-
O
O O
En Fe(IV) O
OH
-O
O
En
Fe(IV)
Key words 4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase(HPPD), Structure-activity relationships, Inhibitor
对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPPD)存在于各种生物体 中 并 被 提 取 出 来 [1] ， 它 是 一 种 铁 - 酪 氨 酸 蛋 白 [2] ， 在 植 物 体 内 可 将 对 羟 基 丙 酮 酸 (4hydroxyphenylpyruvate, HPP)催化转化为尿黑酸(2,5-dihydroxyphenylacetate, HGA)[3]，进而转化为 光合作用中电子传递所需要的重要物质质体醌和生育酚[4,5]，其中质体醌还是影响八氢番茄红素 去饱和酶催化的关键辅助因素[6]，同时，该酶的抑制剂 NTBC(2-(2-nitro-4-trifloromethylbenzoyl)cyclohexane-1,3-dione)临床上已经应用于治疗酪氨酸病，对人体无不良作用。鉴于其上述重要作 用和特点，使之成为继 ALS、ACC 以及 Protox 之后的又一新的除草剂靶标酶和临床上治疗酪 氨酸病靶标酶[7]。由于该酶抑制剂用于除草方面时具有广谱、高效、残留低、环境相容性好、 使用安全的特点，且尚未发现有关其抗性的报道[8]，这更加引起人们对其抑制剂及其构效关系 研究的重视，并进行了广泛的研究。为了使 HPPD 抑制剂的研制更具有针对性，本文对近年来
Abstract The crystal structure of 4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase(HPPD) enzyme, mechanism of action of HPPD enzyme and its inhibitors and structure-activity relationships of its inhibitors were reviewed.
三酮类、苯甲酰间苯二酚类在水中均能以烯醇形式存在且具有抑制 HPPD 和产生白化症状的作
用，在结构上和间苯二酚类具有极其相似的特点，通过合成相应的化合物证明苯甲酰乙烯醇结
构是 HPPD 抑制剂的基本结构，且需具有足够的酸性， PKa<6。
由于 HPPD 抑制剂起源于三酮类化合物，对 HPPD 抑制剂构效关系的研究也主要集中于三酮类。影响抑制 活性的结构部分可分为：苯环部分、环己二酮部分、三
O
O
En Fe(II) OH
O OH
O+
OH
OH
H3C
由于 HPPD 抑制剂在植物体内直接抑制了 HPP 转化为 HGA，间接抑制质体醌和生育酚甚
至类胡萝卜素的生成，最终导致植物的白化直至死亡。
从 HPPD 抑制剂在动植物体内作用机制可以看出，其对人畜是安全的，发展y Laboratory of Elemento-Organic Chemistry, Institute of Elemento- Organic Chemistry, Nankai University, Tianjin 300071)
Xu Haizhen
(College of Chemistry and Life,Tianjin Normal University, Tianjin 300074)