高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量
可乐中咖啡因含量的测定(徐艳清)
浙江科技学院生物与化学工程学院仪器分析实验报告姓名：徐艳清学号：3110422005 班级：化工专升本111班实验名称：饮料中咖啡因的高效液相色谱分析——外标法定量一、实验目的<1）熟悉高效液相色谱仪的结构，并熟悉其分析操作；<2）理解反相化学键合相色谱法的原理与应用；<3）学习高效液相色谱保留值定性方法和归一化法定量。
二、实验原理咖啡因属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7—三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
咖啡因在咖啡中的含量约为 1.2%~1.8%，在茶叶中约为 2.0~4.7%。
可乐饮料、止痛药等含咖啡因。
咖啡因的分子式为，其化学结构式如下图：在化学键合相色谱法中，若采用的流动相极性大于固定相极性，则称为反相化学键合相色谱法。
该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。
本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，即为一种反相色谱法。
由于在一定的实验条件下，同一组分的保留值保持恒定，因此在同种条件下，将发酵产物中各组分的保留时间与标准品对照，即可确定该组分存在与否。
本实验采用峰面积进行含量计算。
通过紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，在根据试样中的咖啡因峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。
三、实验步骤(1>将配制好的流动相于超声波清洗器上脱气15min；(2>系统除气泡：大流速泵抽；装柱子：小流速装柱；(3> 平衡：流速由小至大，配比缓慢增加至压力恒定；(4>精密配制含咖啡因浓度为约1mg•mL-1的咖啡因甲醇溶液。
将此甲醇稀释为含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg•mL-1等5份对照溶液；(5>根据前述色谱条件，将仪器调节至进样状态，待仪器流路与电路条件达到平衡状态后，色谱工作站记录的基线呈平直，即可进样分析；(6>依次分别吸取5μL的5份对照品溶液进样分析，记录色谱数据；(7>将可乐试样稀释一倍，经超声波脱气后，精密吸取5μL可乐试样，进样分析，记录色谱数据；(8>实验完成后，按要求关好仪器。
高效液相色谱法测定咖啡因
四、注意事项
1、流动相和样品溶液需过滤后使用。 2、流动相还进样器。 5、实验结束后要冲洗系统和色谱柱。
五、数据处理
1、根据标准溶液色谱图进行咖啡因成分的定性；
2、绘制标准曲线并打印；
2、计算样品中咖啡因含量。
End！
O H3C N CH3 N N CH3
O
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。
二、实验原理
色谱法
利用混合物不同组分在固定相和流动相中 分配系数(或吸附系数、渗透性等)的差异，使不
同组分在作相对运动的两相中进行反复分配，
实现分离的分析方法。
色谱法分类
色谱法
气体
超临界流体
液固色谱 （LSC）
液体
液液色谱 （LLC） 胶束电动色谱 （MEKC）
气固色谱 超临界流体色谱 （GSC） (SFC) 气液色谱 （GLC）
键合相色谱 亲和色谱 吸附色谱 (BPC) (AC) （LSC） 尺寸排阻色谱 离子交换色谱 毛细管电色谱 (SEC) (IEC) (CEC)
进样口 高压泵
色谱柱 检测器
流动相溶剂
仪器分析实验
高效液相色谱法测定饮料中的 咖啡因
主要内容
一、实验目的 二、实验原理
三、实验步骤
四、注意事项
五、数据处理
一、实验目的
1、学习高效液相色谱法分离咖啡因的原理。
2、练习高效液相色谱仪的基本操作。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析
的基本方法。
二、实验原理
咖啡中含咖啡因约1.2～1.8%，茶叶中含2.0～4.7%，可 乐饮料和APC药片中均含有咖啡因。 其分子式为C8H10O2N4，结构式：
废液
饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析
实验八饮料中咖啡因含量的高效液相色谱分析一、实验目的1．进一步熟悉和掌握高效液相色谱议的结构。
2．巩固对反相液相色谱原理的理解及应用。
3．掌握外标法定量及Origin软件绘制标准曲线。
二、实验原理咖啡因又称咖啡碱，属于黄嘌呤衍生物，化学名为1，3，7－三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，是使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2％～1.8％，在茶叶中约为2.0％～4.7％。
可乐饮料、止痛药片等均含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，结构式为：NN N NOO3H3C CH3在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。
反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。
本实验采用反相液相色谱法，以C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中的咖啡因峰面积，由其标准曲线算出其浓度。
三、实验仪器和试剂1.岛津LC-20A高效液相色谱仪2. 咖啡因（AR），超纯水由纯水机制得，甲醇为色谱纯，配溶液的甲醇为分析纯。
3. 咖啡因标准溶液的配制（1）标准贮备液配制含咖啡因1000 ug/mL的甲醇溶液（实验室准备）。
（2）标准系列溶液用上述贮备液配置含咖啡因10 ug/mL，20 ug/mL，40 ug/mL，50 ug/mL，60 ug/mL的甲醇溶液，备用。
4. 试样市售的可口可乐和百事可乐四、实验条件）颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm1. 色谱柱（XDB-C182. 流动相甲醇 : 水 = 60 : 40，流量 0.5-1 mL/min3. 检测器紫外光度检测器，270 nm4. 进样量 10 uL五、实验步骤1.制备所需的流动相，有机溶剂用0.45µm的有机滤膜过滤，水溶液用0.45µm 的水滤膜过滤，于超声波发生器上脱气20 min.2. 将配置好的分析试样分别过滤后于超声波发生器上脱气15 min.3. 打开A泵、B泵、检测器、柱温箱及电脑的电源开关。
【开题报告】高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
开题报告应用化学高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量一、选题的背景和意义咖啡因（Caffeine ）是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱。
茶、咖啡、可乐这三大非酒精饮品和许多功能饮料都有咖啡因成分。
适量摄入咖啡因对人体是有益的，如可以缓解工作压力，起到提神醒脑作用等。
但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它也有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状，虽然其成瘾性较弱，戒断症状也不十分严重。
因此也被列入受国家管制的精神药品范围。
所以每人每天咖啡因的摄入量不宜过高。
摄入咖啡因量可分为以下等级:成人每天摄入80 ～250 mg 咖啡因( 1.1 ～3.5 mg/kg·d- 1 ) 为低摄入量, 300 ～ 400 mg ( 4 ～6 mg/kg·d- 1 )为中摄入量，超过500 mg(7mg/kg·d- 1 )为高摄入量。
滥用咖啡因通常也有吸食和注射两种形式，其兴奋刺激作用及毒副反应、症状、药物依赖性与苯丙胺相近。
咖啡因是受国家管制的精神药品。
作为中枢兴奋药中的清醒药,低、中摄入量时能够振奋精神、提高注意力、增强自信心、提高工作效率、减少疲乏感、增强识别能力、提高瞬时口头记忆力。
而高摄入量的咖啡因可引起焦虑、烦躁、失眠、易怒及精细运动功能受损。
作为中枢神经系统兴奋药，小剂量能兴奋大脑皮质，改善思维活动,提高对外界的感应性。
大剂量则可兴奋延髓的呼吸中枢和血管运动中枢,增加呼吸频率和深度。
已有研究表明大量摄入咖啡因容易上瘾,导致慢性中毒,引起众多严重后果,如影响睡眠, 引起局部缺血性心脏病，出现心律不齐、心悸及心动过速，降低女性受孕率，提高孕妇自然流产率和致畸率，引发阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝脏、胃、肾等器官,诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤疾病等。
目前测定咖啡因的方法很多,如薄层色谱法、紫外分光光度法和高效液相色谱法。
前两种方法样品预处理过程比较复杂； HPLC法灵敏、快速、准确,样品预处理较简单,可广泛用于咖啡因含量的测定，对于确保人类健康有着重要的意义。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单 丁酸、咖啡酸、蔗糖等）相比，咖啡因为弱极性化合物 。
高效液相色谱法测定饮 料中咖啡因的含量
2020年8月1日星期六
102.2 实验原理
• 咖啡又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称 为l,3,7-三甲基黄嘌呤，是由茶叶或咖啡中提取而得的 一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡 中含咖啡因约为l.2%～1.8%，茶叶中约为2.0%～4.7%。 可乐饮料、APC药片均含咖啡因。其分子式为C8H10O2N4, 结构式为：
•102.4 注意事项
• （1）钢瓶的工作压力，一定要控制在所规定范围 内，不得超压工作。必须切记，保障安全。 • （2）实验结束后，检查仪器是否正常，关闭是否 正确。
•102.5 问题讨论
•
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
•
（2）在色谱分析中为什么常采用相对校正因子
fi？
•102.6 参考答案
• 5．将进样阀从装载（LOAD）位转向进样（ 1NJECT0位，同时按标记钮(MARKER)，使在记录纸上打 开进样信号。 • 6．当咖啡因的色谱峰出完后，按照步骤4～5连续 操作2次，使最低浓度的标准试液获得3张色谱图。 • 7．按标准试液浓度增加的顺序，按步骤4～6操作 ，使每一种标准样获得3个数据。 • 8．取2 mL咖啡饮料试液放入25 mL容量瓶中（或 取5 mL茶液放入50 mL容量瓶中），分别用流动相稀释 至刻度。 • 9．按步骤4～6操作，分析饮料试液（咖啡或茶） 。
作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量
实验一、高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量一、实验目的：1、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理；2、掌握高效液相色谱仪的操作；3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量的基本方法；4、掌握标准曲线定量法。
二、实验原理：咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。
可乐、APC药片中均含有咖啡因。
其分子式为C8H10O2N4，分子量为结构式：用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统，以紫外检测器进行检测。
在整个实验过程中，流动相流速和泵的压力是恒定的，测定他们在色谱图上的保留时间和峰面积后，可直接用保留时间定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
三、仪器和试剂1、仪器Agilent 1200高效液相色谱仪；色谱柱（C18）：4.6mm×150mm、粒径5μm；平头微量进样器：10μl2、试剂：1 咖啡因（A.R.）、甲醇（色谱纯）、超纯水、可口可乐（瓶装）、雀巢咖啡②1000μg/mL咖啡因储备液：将咖啡因在110℃下烘干1小时，准确称取0.1000g咖啡因，用超纯水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，待用。
四、实验内容：1、色谱条件：柱温：室温；流动相：甲醇／水＝60：40流速：1.0mL/min 检测波长：275nm2、咖啡因标准系列溶液配制：分别用吸量管吸取1000μg/mL咖啡因储备液1.0、2.0、2.0、4.0、5.0mL于5只50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，浓度分别为20、40、60、80、100 μg/mL3、样品前处理：①将25mL可口可乐置于100mL烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min，以赶净二氧化碳。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量【开题报告】
毕业设计开题报告应用化学高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量一、选题的背景和意义咖啡因（Caffeine ）是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱。
茶、咖啡、可乐这三大非酒精饮品和许多功能饮料都有咖啡因成分。
适量摄入咖啡因对人体是有益的，如可以缓解工作压力，起到提神醒脑作用等。
但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它也有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状，虽然其成瘾性较弱，戒断症状也不十分严重。
因此也被列入受国家管制的精神药品范围。
所以每人每天咖啡因的摄入量不宜过高。
摄入咖啡因量可分为以下等级:成人每天摄入80 ～250 mg 咖啡因( 1.1 ～3.5 mg/kg·d- 1 ) 为低摄入量, 300 ～ 400 mg ( 4 ～6 mg/kg·d- 1 )为中摄入量，超过500 mg(7mg/kg·d- 1 )为高摄入量。
滥用咖啡因通常也有吸食和注射两种形式，其兴奋刺激作用及毒副反应、症状、药物依赖性与苯丙胺相近。
咖啡因是受国家管制的精神药品。
作为中枢兴奋药中的清醒药,低、中摄入量时能够振奋精神、提高注意力、增强自信心、提高工作效率、减少疲乏感、增强识别能力、提高瞬时口头记忆力。
而高摄入量的咖啡因可引起焦虑、烦躁、失眠、易怒及精细运动功能受损。
作为中枢神经系统兴奋药，小剂量能兴奋大脑皮质，改善思维活动,提高对外界的感应性。
大剂量则可兴奋延髓的呼吸中枢和血管运动中枢,增加呼吸频率和深度。
已有研究表明大量摄入咖啡因容易上瘾 ,导致慢性中毒,引起众多严重后果,如影响睡眠, 引起局部缺血性心脏病，出现心律不齐、心悸及心动过速，降低女性受孕率，提高孕妇自然流产率和致畸率，引发阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝脏、胃、肾等器官,诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤疾病等。
目前测定咖啡因的方法很多,如薄层色谱法、紫外分光光度法和高效液相色谱法。
前两种方法样品预处理过程比较复杂； HPLC法灵敏、快速、准确,样品预处理较简单,可广泛用于咖啡因含量的测定，对于确保人类健康有着重要的意义。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量在日常生活中，饮料是我们常见的饮品之一。
而咖啡因作为许多饮料中的一种重要成分，其含量的测定具有重要的意义。
高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于分析化学领域的技术，它能够准确、快速地测定饮料中咖啡因的含量。
咖啡因，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，是一种天然存在于咖啡、茶、可可豆等植物中的生物碱。
由于其具有兴奋神经中枢、提高警觉性和缓解疲劳等作用，被广泛添加到各种饮料中，如咖啡、茶饮料、可乐等。
然而，过量摄入咖啡因可能会对人体健康造成一定的影响，如失眠、焦虑、心悸等。
因此，准确测定饮料中咖啡因的含量对于保障消费者的健康和权益至关重要。
高效液相色谱法是一种基于液体流动相和固定相之间的分配作用来分离混合物中各组分的方法。
它具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，适用于各种复杂样品的分析。
在测定饮料中咖啡因的含量时，高效液相色谱法通常采用反相色谱模式，即以非极性的固定相和极性的流动相进行分离。
首先，样品的前处理是测定的关键步骤之一。
对于饮料样品，一般需要进行适当的稀释和过滤，以去除其中的杂质和颗粒物，避免对色谱柱造成堵塞和污染。
对于一些含有较多色素和糖分的饮料，可能还需要进行萃取或固相萃取等净化处理，以提高分析的准确性和可靠性。
在进行高效液相色谱分析时，需要选择合适的色谱柱、流动相、检测波长等条件。
常用的色谱柱有 C18 柱，其具有良好的分离性能和稳定性。
流动相通常由水和有机溶剂（如甲醇、乙腈）组成，并添加适量的酸（如磷酸、乙酸）来调节 pH 值，以改善色谱峰的形状和分离效果。
检测波长一般选择在 270 280nm 之间，因为咖啡因在这个波长范围内有较强的吸收。
仪器设备方面，高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统和数据处理系统组成。
输液系统负责输送流动相，使其以稳定的流速通过色谱柱；进样系统用于将样品准确地引入色谱柱；色谱柱是分离的核心部件；检测系统用于检测分离后的组分，并将其转化为电信号；数据处理系统则对检测信号进行采集、处理和分析，最终给出样品中咖啡因的含量。
仪器分析-高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量
反相高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因的含量前言：本次实验报告在前言中简单阐述HPLC 基本原理，介绍HPLC 仪器的结构特点和应用范围；研究对象的化学结构、理化常数和文献报道测定方法。
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。
可乐、APC 药片中均含有咖啡因。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式：N N N NCH 3CH 3CH 3OO一、仪器与试药高效液相色谱仪（日本岛津）。
咖啡因对照品；甲醇为色谱纯；百事可乐（康师傅乌鲁木齐饮品有限责任公司）；红牛（红牛维他命饮料有限公司）；叶尔羌茶（新疆叶尔羌茶有限责任公司）。
二、方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱：C18（4.6x150mm ，5µm ），流动相：甲醇:水=30:70，测定波长280nm ，柱温30℃，流速：1ml/min ，进样量：10μL 。
2.2 系统适用性实验 取供试品20µL 进样，记录色谱图，咖啡因峰的保留时间为 4.253 min ，各峰与相邻峰的分离度为 ，拖尾因子为 ，符合药典规定，理论塔板数按咖啡因峰计算大于2000。
对照品及供试品的色谱图如下：⑴ 对照品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0510152025303540455055mVDetector A Ch1:280nm1.4981.6104.3005.112⑵ 供试品的色谱图0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min01234567891011121314mVDetector A Ch1:280nm 0.8001.5182.1582.3284.3425.1022.3 溶液制备精密称取咖啡因对照品10mg ，加甲醇定容至10ml 。
实验二 高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量
高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量1. 实验目的和要求1.1 熟悉高效液相色谱仪的结构。
1.2了解反相高效液相色谱的原理与应用。
1.3掌握外标定量法。
2. 实验原理咖啡因属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%~1.8%，在茶叶中约为2.0~4.7%。
可乐饮料、止痛药等含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：在化学键合相色谱法中，若采用的流动相的极性大于固定相极性，则称为反相化学键合相色谱法。
该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。
本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，即为一种反相色谱法。
通过紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度以最小二乘法进行线性回归，作出标准曲线，在根据试样中的咖啡因峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。
3. 实验仪器与试剂3.1 仪器高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器）超声波清洗仪分析天平3.2 试剂咖啡因对照品甲醇（色谱纯）纯净水3.3 试样市售可乐。
4. 实验步骤4.1 色谱条件色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm流动相：甲醇-水（60：40，v/v）流速：0.8mL·min-1检测波长：254nm柱温：30℃进样量：10μL4.2 操作步骤●精密配制含咖啡因浓度为约1mg·mL-1的咖啡因甲醇溶液。
●将上述溶液用甲醇稀释为含咖啡因浓度分别为20、40、80、160、320 μg·mL-1等5份对照品溶液。
●根据前述色谱条件，将仪器调节至进样状态，待仪器流路与电路条件达到平衡状态后，色谱工作站记录的基线呈平直，即可进样分析。
●依次分别吸取10μL的5份对照品溶液进样分析，记录色谱数据。
●将可乐试样20mL经超声波脱气后，精密吸取10μL可乐试样，进样分析，记录色谱数据。
实验二___高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量
高效液相色谱法分析饮料中咖啡因的含量院（系）生化系年级2009级专业制药工程姓名吴雄辉学号0940902007课程名称基础化学实验报告实验日期2011年12月日实验地点3L 5楼指导教师夏湘黄玉一．实验目的（1）熟悉高效液相色谱仪的结构，理解反相HPLC的原理和应用；（2）掌握外标定量法。
二．实验原理咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7-三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神亢奋。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%-1.8%，在茶叶中约为2.0-4.7%。
可乐饮料、止痛药等均含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：在化学键合相色谱法中，若采用的流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法。
该方法是目前应用最为广泛的色谱方法。
本实验采用C18键合相色谱柱分离饮料中的咖啡因，用紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作标准曲线，再根据试样中咖啡因的峰面积，由标准曲线计算出试样中咖啡因的浓度。
三．实验用品仪器：高效液相色谱仪、恒流泵、超声波清洗仪、紫外光检测器等。
试剂：甲醇（分析纯）、咖啡因（分析纯）、二次蒸馏水咖啡因标准溶液的配制：（1）标准储备液配制含咖啡因1000ug/mL的甲醇溶液，备用。
（2）标准系列溶液用上述备用液配制含咖啡因20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL、160ug/mL、320ug/mL的甲醇溶液，备用。
试样市售的可口可乐和百事可乐。
四．实验条件（1）色谱柱长150mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合物，颗粒度10μm 的固定相（2）流动相甲醇-水（60：40），流量0.6m/mim（3）紫外光度检测器测定波长254mm，灵敏度0.08（4）进样量10μL五．实验步骤（1）将配制好的流动相置于超声波清洗仪上脱气15min；（2）根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡时，色谱工作六站或记录仪的基线呈平直，即可进样；（3）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，并记录各色谱仪的数据；（4）分别将约20mL的可口可乐和百事可乐试样置于25mL的容量瓶中，用超声波清洗仪脱气15min；（5）依次分别吸取10μL的可乐试样进样，记录各色谱仪的数据；（6）试验结束后，按要求关好仪器。
高效液相色谱法测定可乐中咖啡因含量
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（ ｃ ｏ ｌ ｆＰｈ ｒ ｃ ｕ ｉａ ｃｅ ｃ ｓ ｉ ｉｇ Ｍ ｅ ｉａ Ｕｎ ｖ ｒ ｉｙ Ｓ ｈ ｏ ａ ｍａ ｅ ｔ ｌＳ ｉｎ ｅ ，Ｊｎ ｎ ｄ ｃ ｌ ｏ ｃ ｉｅ ｓｔ ，Ｒｉｈ ｏ ２ ６ ２ ） ｚ ａ ７ ８ ６
Ｋｅ ｒ ｓ Ｈｉ ｈ ｐ ｒｏ ｍａ ｃ ｉ ｕ ｄ ｃ ｒ ｍａ ｏ ｒ ｐ ｏ ａＣａ ｆ ｉ ｅ ｙｗｏ ｄ ： ｇ ｅ ｆ ｒ ｎ ｅ ｌ ｉ ｈ ｏ ｔ ｇ ａ ｈ Ｃ ｌ ｆｅ ｎ ｑ
咖啡 因又称 咖啡 碱 ， 遍 存在 于咖 啡 、 叶 等 普 茶 食 品 中， 也作为 食 品 添加 剂 ， 添 加 于可 乐 型 饮 料 常 中。食 品 中咖 啡 因 的 测定 方 法 很 多 ， 离 心 萃 取一 有
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的含量
• 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光 度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他 组分（如：单丁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配 制的浓度不同的咖啡因标准溶液也注入色谱系统。如流 速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在
色谱图上的保留时间tR（或保留距离）或峰面积A后，可 直接用tR定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工
•
（2）在色谱分析中为什么常采用相对校正因子
fi？
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的 含量
•102.6 参考答案
• （1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。 • 答：反相柱n-C18,是将非极性物质n-C18烷（正构
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单 丁酸、咖啡酸、蔗糖等）相比，咖啡因为弱极性化合物。
作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因的 含量
•102.3 操作流程
• 1．标准储备液的配制：准确称取25.0 mg咖啡因标准试 剂，用配制的流动相溶解，转入100 mL容量瓶中，稀释至刻 度。 • 2．用标准储备液配制质量浓度分别为25 g/mL，50 g/mL，75 g/mL，100 g/mL，125 g/mL系列标准溶液。 • 3．启动泵，打开检测器，设置泵的流速为2.3 mL/mm， 检测器的灵敏度设在0.08 AUFS，打开记录仪，将纸速设在1 cm/min。当流动相通过色谱柱约5～10 min．记录仪上基线稳 定后，开始进样。 • 4．将进样阀放在半截（LOAD）位时，用注射器取25 L 浓度最低的标准样（比进佯阀上定量管多5 L以上)，注入进 样阀中。
试验2高效液相色谱法测定可乐中的咖啡因含量
实验2、高效液相色谱法测定可乐中的咖啡因含量一、实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作；2、掌握标准曲线法（外标法）定量分析的方法；3、掌握UV检测器的工作原理及应用范围。
二、实验原理根据朗伯－比尔定律（A=abc）：在一定浓度范围内，样品中被测组分的含量与响应值（峰面积或峰高）成正比。
用标准物质配制一系列不同浓度的标准样品，在一定的色谱条件下，分别测定标准样品和试样的峰面积，以标准溶液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，采用最小二乘法回归得到被测样品标准曲线的方程；将测得试样的峰面积代入方程，计算得到试样中咖啡因的含量。
三、仪器、试剂及色谱条件仪器：Agilent 1200 HPLC；C18高效液相色谱柱，Φ 4.6mm×15cm，填料粒度5μm；紫外光检测器（DAD）；微量进样器（25μL）；色谱条件：流动相：甲醇：水=65：35（V/V），1mL/min；检测波长：254nm；色谱柱温度：30℃；进样量：10μL。
试剂：无水甲醇、咖啡因（均为分析纯试剂）、市售可乐、超纯水。
四、实验步骤1、流动相的配制：甲醇、水分别须经0.45微米有机膜、水相膜过滤后使用；2、流动相脱气：将流动相置于超声波清洗器上脱气15min（本机配自动脱气装置，脱气过程略）；3、标准溶液的配制：配制咖啡因含量为20、40、80、160、320μg/mL的甲醇溶液；4、按仪器操作说明打开计算机和主机，进入色谱工作站，设定色谱条件；5、启动色谱系统，调整仪器基线，待基线稳定即可进样；7、用进样器分别抽取10.0μL系列标准液及样品，排出注射器中气泡，插入六通阀的进样孔进样，仪器自动开始采集、保存数据；8、实验结束后，用纯甲醇清洗色谱柱及进样器，关闭仪器。
五、数据处理及实验结果以标准溶液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，采用最小二乘法回归得到标准曲线方程，计算可乐中咖啡因的含量，实验结果见下表。
HPLC测定可乐中咖啡因含量实验结果表六、思考题1、标准曲线法定量准确度的影响因素有哪些？2、为什么流动相必须要经过脱气、过滤处理？3、紫外检测器适合于分析那些种类的物质？实验、GC-MS定性分析混合溶剂的成分一、实验目的1、学习GC-MS的基本操作；2、掌握GC-MS的构成及工作原理；3、了解谱库检索法定性分析有机化合物的方法。
高效液相色谱法测定饮料中咖啡因和含量
液 相
色
行校正，这就是校正因子的意义。由于校正因子f′与色谱
谱 法
测
操作条件有密切关系，不易准确测定（不是一个定植），因
定 饮
料
此，在色谱分析中采用相对校正因子fi，既被测物质i和标
中 咖
啡
准物质s绝对校正因子的比。
因 的
含
量
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
高 效
液
构式为：
相 色
谱
法
测
定
饮
料
中
咖
啡
因
的
含
量
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
大
学
通
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光
用 化
度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他
学 实
组分（如：单丁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配
验 技
制的浓度不同的咖啡因标准溶液也注入色谱系统。如流 术
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
大
学
通
用
102.6 参考答案
化 学
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
实 验
答：反相柱n-C18,是将非极性物质n-C18烷（正构
技 术
烷烃）键合到硅胶基质上，分离过程中以极性溶剂为流 8/9
高
动相，实现弱极性化合物的分离。与其他组分（如：单
料
中
咖
啡
因
的
含
量
在线答疑：yanjie@ wy-fxhx@
大
学
通
用
102.5 问题讨论
化 学
（1）解释用反相柱n-C18测定咖啡因的原理。
高效液相色谱法测定咖啡因
吸取待测样品进样分析，根据其峰面积，依据标准曲 线计算样品中咖啡因含量。
四、注意事项
1、流动相和样品溶液需过滤后使用。 2、流动相还需脱气。 3、基线平稳后才能进样分析。 4、进样前要清洗微量进样器。 5、实验结束后要冲洗系统和色谱柱。
仪器分析实验
高效液相色谱法测定饮料中的 咖啡因
主要内容
一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤 四、注意事项 五、数据处理
一、实验目的
1、学习高效液相色谱法分离咖啡因的原理。 2、练习高效液相色谱仪的基本操作。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析
的基本方法。
二、实验原理
咖啡中含咖啡因约1.2～1.8%，茶叶中含2.0～4.7%，可 乐饮料和APC药片中均含有咖啡因。
色谱柱 检测器
保留值定性分析
校准曲线法定量分析
mi fi Ai 或 mi fi hi
三、实验步骤
1、溶液的配制： 分别取1、2、3、4、5 mL 100 μg mL-1的咖啡因标准
储备液，以超纯水稀释至50 mL，即得到20、40、60、80、 100 μg mL-1的标准溶液。 2、绘制标准曲线：
五、数据处理
1、根据标准溶液色谱图进行咖啡因成分的定性； 2、绘制标准曲线并打印； 2、计算样品中咖啡因含量。
End！
气体
超临界流体
液体
气固色谱 （GSC）
气液色谱 （GLC）
超临界流体色谱 (SFC)
液固色谱 （LSC）
液液色谱 （LLC）
胶束电动色谱 （MEKC）
吸附色谱
键合相色谱
亲和色谱
高效液相色谱法测定可口可乐中咖啡因的含量--
高效液相色谱法测定可口可乐中咖啡因的含量姓名：学号：前言高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广、色谱柱可反复使用的特点。
咖啡因（Caffeine ）是日常饮料中主要成分，据查验，1g雀巢咖啡含35咖啡因，1g茶含20-35mg，而1000ml可乐饮料中含90-100mg[1]。
咖啡因亦称咖啡碱，是一种甲基黄嘌呤，属生物碱类物质，化学名称为l，3，7一三甲基一3，7一二氢一1H一嘌呤一2，6一二酮水合物，化学式C。
H。
N。
0：，相对分子质量为194．2，易溶于水、乙醚、氯仿、二氯甲烷，能溶于乙醇、丙酮、醋酸乙酯，难溶于乙醚和苯，熔点为235～237℃，白色结晶粉末，无臭，味苦，有风化性[2]。
咖啡因是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种生物碱，属黄嘌呤类，药理作用相似，咖啡因的中枢兴奋作用较强，临床主要用作中枢兴奋药。
适度地使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。
但是，大剂量或长期使用也会对人体造成损害，特别是它也有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等各种戒断症状，被列入受国家管制的精神药品范围。
化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
常用来测定咖啡因的方法有滴定法[3]，紫外分光光度法[4]，高效液相色谱法[5]，气相色谱法[6]，毛细管电泳法[7]等。
1试剂、仪器和药品仪器：KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司；AL204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；Waters-2695高效液相色谱仪（美国；试剂：甲醇为色谱纯、超纯水；样品：可口可乐饮料(市售)；对照品：咖啡因(原料药)；2色谱条件1.色谱柱：INERTSIL-ODS-SP-18( 4.6×150mm，5um)；2.流动相：甲醇：水=35:65（V/V）；3.流速：1ml/min；4.检测波长：270nm；5.柱温：25℃。
实验一高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因
实验一高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因咖啡因(caffeine)又名咖啡碱，属甲基黄嘌呤化合物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤，具有提神醒脑等刺激中枢神经作用，但易上瘾。
为此，各国制定了咖啡因在饮料中的食品卫生标准，美国、加拿大、阿根廷、日本、菲律宾规定饮料中咖啡因的含量不得超过200 mg/L，我国到目前为止咖啡因仅允许加入到可乐型饮料，其含量不得超过150 mg/kg，为了加强食品卫生监督管理，建立咖啡因的标准测定方法十分必要。
高效液相色谱法(HPLC)是可乐型饮料、咖啡和茶叶以及制成品中咖啡因含量的测定方法，简单、快速、准确。
HPLC法检出限:可乐型饮料为0.72mg/L;茶叶、咖啡及其制品为1.8 mg/100g。
一、实验原理咖啡因的甲醇液在286nm波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。
二、试剂1 甲醇HPLC试剂2 乙腈HPLC试剂3 三氯甲烷分析纯（必要时需重蒸）4 超纯水18. 2 M5 无水硫酸钠分析纯6 氯化钠分析纯7 咖啡因标准品纯度98%以上三、仪器和设备1 液相色谱：型号2 色谱柱Bondapak TMC 18 (30 cm X 3.9 mm id)3 预柱RESA VETMC184 超声清洗器(CQ250)5 混纤微孔滤膜四、分析步骤1 试样处理（1）可乐型饮料a 脱气：试样用超声清洗器在40℃下超声5 minb 过滤：取脱气试样10.0 mL，通过混纤微孔滤膜过滤，弃去最初的5mL，保留后5mL备用。
（2）咖啡、茶叶及其制成品：称取1g已经粉碎且小于30目的均匀试样或液体试样放入100 mL烧杯中，先加2 mL～3 mL超纯水，再加25 mL三氯甲烷，摇匀，在超声处理机上萃取1 min(30 s二次)，静置30 min，分层。
将萃取液倾入另一100 mL 烧杯。
在试样中再加20 mL三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤，弃去试样，合并二次萃取液，加入少量无水硫酸钠和5 mL饱和氯化钠，过滤，滤入50 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容至50 mL。
高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因
高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因摘要：目的研究了高效液相色谱法直接测定饮料中咖啡因的新方法。
方法采用Hypersil ODS 柱，以甲醇+乙酸铵（0.02mol/L）=15+85 作流动相，流速 1.0mL/min，检测波长207nm，柱温30℃。
结果6min 内将咖啡因与基体分离，咖啡因含量与峰面积在10～200μg/mL 范围呈线性关系，相关系数r=0.9998；回收率范围为97.4％～101.4%。
结论该法准确，样品处理简单。
咖啡因在我们的日常生活中并不少见，它被作为食品添加剂而广泛地应用于饮料中。
除咖啡外，含咖啡因的饮料非常多，其中一类是饮料中天然存在的咖啡因，如可可、茶，另一类是将咖啡因添加在饮料中，如某些汽水、果汁。
1、咖啡咖啡有提神醒脑的效果，因为其中含有咖啡因。
在美国，差不多75％被服用的咖啡因是来自咖啡。
一般来说，市场上一杯普通中杯装即磨咖啡，含有150至200毫克咖啡因，一袋速溶咖啡中咖啡因约为66毫克。
2、茶我们常喝的各种绿茶、红茶、乌龙茶等，都含有咖啡因。
茶中咖啡因含量与泡茶方法、时间有关，绿茶的咖啡因含量从每杯（约227克）30毫克至50毫克不等。
红茶平均每杯含咖啡因约47毫克。
3、汽水很多汽水饮料以及功能性饮料都含有咖啡因，一罐330毫升的可乐咖啡因含量约有33毫克。
由于某些功能性饮料含有咖啡因，会刺激中枢性神经，因此不是所有人群都适宜喝功能性饮料，儿童尤其应注意。
4、巧克力巧克力中的咖啡因含量相对较少，以至于人们常常将其忽略。
一块约40克的牛奶巧克力含有相当于6毫克的咖啡因，另外，巧克力味及咖啡味的牛奶、雪糕、乳酪等也可能含有咖啡因。
咖啡因属黄嘌呤衍生物，化学名称为1，3，7—三甲基黄嘌呤，是从茶叶或咖啡中提取的一种生物碱。
咖啡因在咖啡中的含量约为1.2%~1.8%，在茶叶中约为2.0~4.7%。
可乐饮料、止痛药等含咖啡因。
咖啡因的分子式为C8H10O2N4，其化学结构式如下图：饮料中咖啡因含量的测定方法一般有紫外分光光度法和高效液相色谱法两种。
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高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量
一、实验目的：
1、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理；
2、掌握高效液相色谱仪的操作；
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量的基本方法；
4、掌握标准曲线定量法。
二、实验原理：
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。
它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。
可乐、APC 药片中均含有咖啡因。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，分子量为结构式： N N
N N CH 3CH 3
CH 3O
O
用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统，以紫外检测器进行检测。
在整个实验过程中，流动相流速和泵的压力是恒定的，测定他们在色谱图上的保留时间和峰面积后，可直接用保留时间定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
三、仪器和试剂
1、仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪；
色谱柱（C 18）：4.6mm ×150mm 、粒径5μm ；
平头微量进样器：20μl
2、试剂：
① 咖啡因（A.R.）、甲醇（色谱纯）、超纯水、可口可乐（瓶装）、雀巢咖啡
② 1000μg/mL 咖啡因储备液：将咖啡因在110℃下烘干1小时，准确称取0.1000g 咖啡因，用超纯水溶解，转移至100mL 容量瓶中，定容至刻度，待用。
四、实验内容：
1、色谱条件：
柱温：室温； 流动相：甲醇／水＝40：60
流速：0.8 mL/min 检测波长：275 nm
2、咖啡因标准系列溶液配制：
分别用移液枪吸取1000μg/mL 咖啡因储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 于5只10mL 容量瓶中，用超纯水定容至刻度，浓度分别为10、20、40、60、80、100 μg/mL 。
（已完成）
3、样品前处理：
①将25mL可口可乐置于100mL烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min，以赶净二氧化碳。
②准确称取咖啡0.10g，用水溶解定容至50mL。
③将2份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），弃去前过滤液，取
续滤液，待用。
④分别取5mL可乐、咖啡溶液用0.45 μm的滤膜过滤，然后注入1.5mLEP管备用。
4、绘制工作曲线：
待液相色谱仪基线平直后，分别注入咖啡因标准系列溶液20.0μl，重复两次，要求两次所得的咖啡因色谱峰面积基本一致，记下峰面积与保留时间。
（已完成）
5、样品测定：分别注入样品溶液20.0μL，根据保留时间确定样品中咖啡因色谱峰的位置，重复两次，记下咖啡因色谱峰峰面积。
五、结果处理：
1、确定标准样咖啡因和样品中咖啡因的保留时间及记录不同浓度下其峰面积；
2、根据咖啡因标准系列溶液的色谱图，绘制咖啡因峰面积与其浓度的关系曲线。
3、根据样品中咖啡因色谱峰的峰面积，由工作曲线计算可口可乐、咖啡中咖啡因含量
（分别用μg/m L和mg/g表示）
六、注意事项：
1、液体样品必须经过处理，不能直接进样，虽然操作简单，但会影响色谱柱的寿命。
2、不同牌号的茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取样品可酌量增减。
3、为获得良好结果，样品和标准溶液的进样量要严格保持一致。
七、思考题：
1、用标准曲线法的优缺点是什么？
2、解释用反相色谱柱测定咖啡因的理论基础。
3、在样品干过滤时、为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？。