福林酚测定法

福林酚测定法
试剂碱性铜试液取氢氧化钠10g，碳酸钠50g,加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液。

临用前，合并两液，并加水至500ml。

操作法⑴对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3ml的溶液。

⑵供试品溶液的制备照各药品项下的方法制备。

⑶标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分别置具试管中，各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液（取福林试液中的贮备液1→16）4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴中10分钟，在650nm的波长处测定吸收度；同时以0号管作为空白。

以吸收度作为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

⑷测定法精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜试液起，依法测定，自标准曲线上查得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数。

二）试剂与器材
1.试剂
（1）试剂甲：
（A）10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）。

溶解于500毫升蒸馏水中。

（B）0.5克硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。

（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2 MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。

冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。

稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。

使用时用标准NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。

（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或γ—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250μg/ml左右。

牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。

2. 器材
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）秒表
（4）试管16支
（三）操作方法
1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250μg/ml）。

用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～2 5℃）放置10分钟。

再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。

这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。

然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。

以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。

注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。

全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。

待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。

每分钟测一个样品。

进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。

表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。

最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

Folin—酚试剂法实验表
2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。

通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。

即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。

如上表中的8、9、10试管。

根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。

因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。

四、改良的简易Folin—酚试剂法
（一）试剂
1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。

2. 试剂乙：与前面的基本法相同。

临用时加蒸馏水稀释8倍。

3. 标准蛋白质溶液：同基本法。

（二）操作步骤
测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。

只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。

在55℃恒温水浴中保温5分钟。

用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。

改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。