分离产蛋白酶的芽孢杆菌菌株的分离方案
一株碱性蛋白酶产生菌的分离与应用
ｗｉ ｔｉ ｒ ｉ ｈ ｗｅ ｈ ｔ ｅ ｗａ ｆ１ ， ｗｈ ｃ ｓ ２ｔ ｓ ｉｈ ｒ ａ ｈｅｄ ｔｒ ｅ ｔ ａ ｄ ｗ ｔ ｏ ｅ ｒ ｉｓ ｈ ｔ ｈ ｓ ｔ ｎ ｓ ｏ ｄｔ ａ ｔ Ｒｉ ｓｏ ８ ｓａ ｈ ｉｈＷａ ｉ ｍｅ ｈ ｇ ｅ ｔ ｎｔ ｅｅ ｇ ｎ ｄ ｅ ｉ ｈ ｔ ｒ ｔ ｎ ． ｈ ｓ ｄ ｈ ｓａ Ｋｅ ｒ ｓ ｃ ｍｅｌ ｐ ｎ ｎ ａｋ ｌ ｅｐ ｏ ｅ ｓ ； ａ ｉ ｕ ｙｗｏ ｄ ： ａ ｌ ａｓ ｏ ｉ ； ｌ ａｉ ｒ ｔａ ｅ ｂ ｃｌ ｓ ｉ ａ ｎ ｌ
Ａｂｔａ ｔ Ａ Ｇ十Ｕ ｉ ｏ Ｂ ｃｌ ｓ ｎｍｅ Ｊ 一 ， ｓ ｓｌｔｄｆｏ ｔｅｓ ｉａｏｍｄａｌ ｉｍｉ ｉ ｈ ｑａ ｏ ， ｅｙ ｎ Ｈｕ ａ ｒｖｎ ｅ ｓｒ ｃ： Ｓ ａ ｆ ａ ｉｕ ， ａ ｄＳ Ｐ５ ｗａ ｉｏａｅ ｒ ｍ ｈ ｏｌ ｒｔ ｎ ｌ ｌｏｌ ｌ ｎＺ ｅ ｉｏＴ ｗｎ Ｌ ｉａ ｇ， ｎ ｎＰ ｏ ｉｃ． ｌ
１ ＿ 仪器与设备 ．２ １
Ｂ －０ Ｃ培养箱 ， Ｗ－ Ｊ１Ｄ超净工 作台， ２ ＭＪ４０ Ｓ Ｃ ．Ｆ ７２ 型分光光度计 ，Ｓ Ｙ １０ Ｃ 摇 床，ＷＳ — 白度仪， Ｋ －１２ ＢＬ Ｓ ４ ０均质机 ，Ｘ —Ｉ Ｇ－０ Ｌ ＪＩＢ离心机 。
１ ． 主要试剂 ．３ １
摘要：从湖南耒阳哲桥镇茶籽油榨油坊 内采集土壤样品，分离筛选 出能耐受茶皂素并产生碱性洗涤用蛋白酶的菌株。通过对 筛 选 出的菌株进行初步形态鉴定、蛋白酶活力测定和污布去污效果比较 ，挑选 出一株符合要求的菌株，命名为 ＳＰ５ Ｊ一。该菌株 为革兰氏 阳性产芽孢杆 菌，无荚膜，能耐受茶皂素，产生碱性蛋白酶，其酶活力为 １０ＵｍＬ ５ ／ ，将其添加到清洗剂中并测定去污能力，试验表 明：污布去污值 Ｒ 达到 １，是平行菌株去 污力的 ２倍。 ｉ ８ 关键词：油茶皂素；碱性蛋 白酶；芽孢杆菌
产弹性蛋白酶芽孢杆菌的筛选与鉴定
Ａｂ ｔａ ｔ ｒｍ ｈ ｏｌ ｎ ｓ ｔｗａｅ ａ ｌ ｅ ｒｔ ｅｓａ ｇ ｔｒ ｏ ｓ ，ｍ ｉ ａ ｔｒ ｎ ｅ ｒｆｃｏ ｓｒ ｃ ：Ｆ ｏ ｔ ｅｓ ｉ ａ ｄ ｗａ ｅ ｔｒｓｍｐｅ ｎ ａ ｈ ｌｕ ｈ ｅｈ ｕ ｅ ｓ ｌ ｆｃｏ ｙ ａ ｄｂ ｅ ａ ｔ— ｋ
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供 不 应求 ， 重影 响 了弹性 蛋 白酶 的应 用 。 因此筛 严
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
分离产蛋白酶的芽孢杆菌菌株的分离方案PPT课件
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四. 如何检验筛选所得的菌株是 所需的目的菌种
• 芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，可用革兰氏染色法初步判定， 且其在酪蛋白平板上会产生水解圈，并且其菌种有体积 较大，表面干燥、粗糙、不透明等特征，较易和其它菌 种分辨。还可以利用显微镜观察比较其形态特征来判定 是否为芽孢杆菌。
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试管放入75—80℃水浴中热处理10min，以杀死 非芽孢细菌及其他微生物。 • 取热处理过的悬液100—200μL，涂布接种到牛肉 膏白胨培养基平板，将平板倒置，于30—32℃培 养24—48小时。
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• 对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、 不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色， 选出芽孢杆菌菌落。
分离产蛋白酶的芽孢杆菌菌株 的分离方案
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一．筛选模型的选择及原因
• 芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌，并且广泛存 在于土壤中，且其性质稳定，可较容易与其它 细菌分离，繁殖速度快，体积较大，在培养时 可抑制有害菌生长。而且对人体无害，可代谢 生产多种酶和有机酸。
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谢谢您的指导
THANK YOU FOR YOUR GUIDANCE.
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汇报人：XXXX 日期：20XX年XX月XX日
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二．取样环境及原因
选择一块处于生活区或河道旁污染较少且 腐殖质较厚的地块，取表层一下5—10cm 处的土样，这样可以保证土壤中含有可以 作用于蛋白质的微生物，并且可以避免污 染物对菌种活性的影响。
产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离一、教学目标及基本要求1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。
由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。
2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。
利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。
有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件(
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。
采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。
通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。
在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。
关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition*基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。
猪肠道中产蛋白酶解淀粉芽孢杆菌的筛选、鉴定及其酶学性质的初步研究
猪肠道中产蛋白酶解淀粉芽孢杆菌的筛选、鉴定及其酶学性质的初步研究宁豫昌;张晓静;乔宏兴【摘要】试验从健康猪肠道中筛选得到一株高产蛋白酶的芽孢杆菌MY-6菌株,通过形态学观察、生理生化试验和糖醇发酵试验、16S rDNA序列扩增与比对、Biolog鉴定等方法鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌.并研究了蛋白酶活力与细菌生活周期的动态关系,pH、温度、金属离子和蛋白酶抑制剂对蛋白酶活力的影响及蛋白酶对不同底物的水解性能.结果显示,MY-6菌株蛋白酶的合成与其芽孢形成同步,均开始于对数生长期的前期,该菌株所产蛋白酶的最适作用条件为:40 ℃、pH7.0,Ca2+和Mn2+对蛋白酶活力有明显的促进作用,PMSF能够完全抑制该蛋白酶的活力,说明该蛋白酶属丝氨酸蛋白酶,蛋白酶对鱼粉蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、酪蛋白的酶解物TCA可溶性肽含量分别为0.83、0.67、0.58和0.38 μmol/g.结果提示,解淀粉芽孢杆菌MY-6菌株可作为改善蛋白质消化的益生性芽孢杆菌的初步选择.%A Bacillus strains,MY-6 strain which secreted high amount of protease was isolated from healthy pig's intestines,and it was identified as Bacillus amyloliquefaciens by the methods of morphological observation,biochemical tests,16S rDNA sequence amplification and comparison,biolog identification.In order to get an initial understanding of the enzymatic properties of its protease,the dynamic relationship between protease activity and bacterial life cycle,effects of pH,temperature,metal ions and inhibitors on protease activity,and the protease hydrolysis of different substrates were investigated.The results showed that,the protease synthesis of MY-6 strain was synchronized with its spore formation whichbegan in the early stage of the exponential growth phase.The optimum conditions for the protease was 40 ℃ and pH 7.0,Ca2+ and Mn2+ had a intensive effects on the protease activity,PMSF could completely inhibit the activity of protease,indicating that the protease was a serine protease.The content of TCA soluble peptides for protein hydrolyzate fishprotein,soybean protein,corn protein and casein was 0.83,0.67,0.58 and 0.38 μmol/g,respectively.In conclusion,Bacillus amyloliquefaciens MY-6 strain could be used as an initial selection of probiotic Bacillus to improve protein digestion.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)008【总页数】10页(P2398-2407)【关键词】猪;解淀粉芽孢杆菌;蛋白酶;酶学性质【作者】宁豫昌;张晓静;乔宏兴【作者单位】河南牧业经济学院,郑州 450046;河南牧业经济学院,郑州 450046;河南牧业经济学院,郑州 450046【正文语种】中文【中图分类】S828猪属于杂食性单胃动物，营养物质消化主要依靠胃内的化学消化，其消化道中微生物消化作用比反刍动物弱，对饲料中蛋白质的消化吸收率较低[1]。
产蛋白酶芽孢杆菌的筛选及其发酵对豆粕的影响
Keywords: Bacillus; protease; fermented soectron microscopy; X-ray diffraction
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180808-073
中图分类号：TS209
本研究筛选到1 株高产蛋白酶的芽孢杆菌，通过形态 学、生理生化鉴定，以及进化树的构建，结果显示其是 1 株暹罗芽孢杆菌。研究芽孢杆菌发酵对豆粕化学成分的 变化以及对豆粕蛋白的微观结构影响，本实验可为进一步 研究微生物发酵对豆粕蛋白结构影响提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与培养基 脱脂豆粕 吉林华展生物工程有限责任公司；脱脂
乳粉 新西兰恒天然集团。 改良LB液体培养基：酵母浸粉3 g/L、蛋白胨
10 g/L、氯化钠10 g/L、葡萄糖3 g/L，121 ℃高压灭菌 20 min。改良LB固体培养基：改良LB液体培养基添加
16 g/L琼脂粉。豆粕发酵培养基：10 g豆粕（过20 目 筛）、0.2 g红糖、10 g蒸馏水，搅拌均匀，115 ℃高压灭 菌15 min。脱脂乳固态培养基：脱脂乳粉50 g/L、琼脂粉 1.5 g/L，115 ℃高压灭菌15 min。 1.2 仪器与设备
24 h at 37 ℃ and at a water content of 50%. Moreover, the SEM images revealed that fermentation significantly changed
the microstructure of soybean meal protein, making it looser. The X-ray diffraction patterns showed that the backbone of
芽孢杆菌的分离鉴定2
芽孢杆菌的分离与鉴定实验器材：铲子（1）,盆（1）,电子天平（1），洗耳球(1)，接种勾和环（1）,1ml吸管（7）,玻璃涂棒（1）,平皿（12）,250ml带玻璃珠三角瓶（1）,双层纱布（1）,试管（7），标签纸（1）,恒温箱，显微镜（4）。
实验试剂：无菌水，1mol/L NaOH、1mol/L HCL、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、复红液、5%孔雀绿、沙黄、乙醚、吲哚试剂、40%NaOH、肌酸牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏1g，蛋白胨2g，Nacl 1g，水200ml，ph7.2，琼脂3.0-4.0g；生孢培养基：0.1%蛋白胨，0.1%葡萄糖，0.07%酵母粉，0.02%硫酸镁晶体（七水），0.02%硫酸铵，0.1%磷酸氢二钾（3水），1.5%琼脂；一、土壤中芽孢杆菌的筛选A.培养基配置步骤：（1）称量：按比例称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，共置于烧杯中；（2）溶解：先加入适量无菌水，加热使其溶解，再补足水至总量；（3）调pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCL调PH至7.6；（4）过滤：用滤纸过滤；（5）融化琼脂：加入3.5克琼脂，继续加热至完全溶解，补足因加热蒸发失去的水分；（6）分装与包扎：摆斜面（7）灭菌：121℃，灭菌20minB.实验步骤：（一）采集土样: 每个采样点选取土壤较肥沃、有代表性的地块约0．2 cm2，五点法采集。
取5～10cm深土壤，每一个土样约500 g。
将土样放入无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型，4℃保存备用。
（二）土壤悬液制备：称取10g土样，放入盛有99ml无菌水并带有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡摇晃20min，使土样与水充分混合，将细胞分散，两层纱布过滤，然后将锥形瓶置于90℃水浴锅，加热20min，制备成土壤悬液。
（三）土壤悬液稀释：用一支1ml的无菌吸管从锥形瓶吸取过滤的土壤悬液1ml加入盛有9ml 无菌水的大试管中，震荡均匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一只盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1 、 10-2 、 10-3、 10-4、10-5、 10-6 不同的稀释度。
蛋白酶产生菌细菌的分离与鉴定
蛋白酶产生菌细菌的分离与优化一、研究背景及进展蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。
皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。
蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。
临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。
加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。
二、实验方案1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株B1 分离自污水河的土壤；B9 为B1 物理诱变后所得的菌株。
1.1.2 药品弹性蛋白、刚果红弹性蛋白 Sigma 公司产品。
1.2 培养基1.2.1 细菌富集培养基(% W/V)蛋白胨1.0，酵母膏0.5，NaCl 1.0，pH7.0，121℃灭菌20min。
1.2.2 初筛培养基(% W/V)弹性蛋白0.80，葡萄糖0.10，酵母膏0.10，K2HPO4 0.10，KH2PO4 0.05，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，115℃灭菌30min。
1.2.3 发酵培养基(% W/V)干酪素3.00，葡萄糖4.00，玉米提取液0.1，K2HPO4，0.20，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，11℃灭菌30min。
1.3 胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选方法1.3.1 细菌富集培养称取土样1 g ，加入细菌富集培养基中，送摇床培养，150r/min，37℃培养48h。
同时做两个平行实验。
1.3.2 分离将富集土壤悬液按每级稀释10 倍的次序得到10－ 3、10 － 4、10 － 5 的系列稀释液，再依次分别从各稀释度试管中各吸取0.2ml 稀释液，加到相应的培养皿内，用涂棒涂匀。
每个稀释梯度做两个平行试验，3 7 ℃培养箱倒置培养48h。
土壤中产蛋白酶芽孢杆菌的筛选
土壤中产蛋白酶芽孢杆菌的筛选一、实验目的要求1、了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术2、掌握从土壤中筛选产蛋白酶菌株的原理及方法3、学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法4、培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力二、实验基本原理土壤微生物类群在全球自然生态系统中具有不可替代的作用，它推动着生态系统的能量流动和物质循环，是生态系统的重要组成部分。
芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，多数为碱性菌，主要分布于土壤、动植物体及水体中。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
从而得到所需的菌株。
并且自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
水解圈与菌落直径的比值，被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
三、实验材料和试剂器具和其他用具：盛有9ml无菌水试管4支、培养皿10个、锥形瓶250ml、500ml各一个、无菌移液管4根、吸管、玻璃涂棒、电子天平、水浴锅、恒温培养箱、烧杯、报纸、土壤样品、高压灭菌锅、记号笔、显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、尺子。
试剂：蛋白胨、牛肉膏、Nacl、琼脂、脱脂奶粉、酵母膏、葡萄糖、(NH4)2SO4、MgSO4.7H2O、K2HPO4、香柏油、二甲苯。
（注：牛奶平板、牛肉膏蛋白胨培养基、淡薄培养基）革兰氏染色：革兰氏染色、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液芽孢染色：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液1、取样在家畜饲养的地方，从地表下10~15cm的土壤中用无菌小铲取土样，并记录取样的地理位置。
2 、采集取一小方土样均匀在纸上，然后再纸的四角和中心各取2g土壤样品，混匀形成10g土样。
3 、灭菌将10g土样放入100ml无菌水中并置于250ml的三角瓶中，然后放入水浴锅中加热（80℃）处理10min。
实验十一 产蛋白酶菌株的筛选
实验十一产蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。
一基本原理⏹自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
⏹水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
⏹碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
⏹原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。
二实验目的⏹学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法⏹学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术⏹掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法三实验器材1 菌株从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株2 溶液和试剂蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等3 仪器和用品三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸四操作步骤1 培养基和试剂的配制（1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶（2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
高产蛋白酶纳豆芽孢杆菌的分离筛选与鉴定
高产蛋白酶纳豆芽孢杆菌的分离筛选与鉴定孙妍;王加启;奚晓琦;卜登攀;魏宏阳;周凌云【摘要】以北京、大连和日本3个产地的纳豆产品为试验材料,从中筛选可用于畜禽生产的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)蛋向酶高产菌株.先通过酪蛋白平板初筛得到9株芽孢杆菌,再以N1型纳豆芽孢杆菌为模式菌株,对初筛得到的菌株进行菌落和菌体形态观察、生理生化鉴定,确定有5个菌株为纳豆芽孢杆菌.测定5个菌株48 h发酵液中蛋白酶活性,结果表明:菌株NB1为蛋白酶高产菌株,发酵液中蛋白酶活性为19.41 U·mL-1,产蛋白酶特性在6代内可保持稳定.【期刊名称】《沈阳农业大学学报》【年(卷),期】2010(041)002【总页数】6页(P175-180)【关键词】纳豆;纳豆芽孢杆菌;蛋白酶;筛选;鉴定【作者】孙妍;王加启;奚晓琦;卜登攀;魏宏阳;周凌云【作者单位】中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室,北京,100193【正文语种】中文【中图分类】Q939.11.8纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）是1906年SAWAMURA从日本传统大豆发酵食品——纳豆中分离得到一种产蛋白酶益生菌[1]。
除了具有抗菌、调节肠道微生物平衡、提高免疫力等益生功能，纳豆芽孢杆菌在增殖过程中还可以产生大量蛋白酶，能够提高畜禽体内消化酶活性[2]，促进消化道生长发育[3]，提高饲料的消化利用率[4]。
微生物学练习题(第四章-微生物营养和培养基)
“微生物学”练习题第四章-微生物的营养和培养基一、选择题1、在含有下列物质的培养基中，大肠杆菌首先利用的碳源物质是（）。
A、蔗糖B、葡萄糖C、半乳糖D、淀粉2、下列物质中可用作生长因子的是（）。
A、葡萄糖B、纤维素C、NaClD、叶酸3、大肠杆菌属于（）型微生物。
A、光能无机自养B、光能有机异养C、化能无机自养D、化能有机异养4、化能无机自养微生物可利用（）为电子供体。
A、CO2B、H2C、O2D、H2O5、用来分离产胞外蛋白酶菌株的酪素培养基是一种（）。
A、基础培养基B、加富培养基C、选择培养基D、鉴别培养基6、下列培养基是合成培养基的是（）。
A、LB培养基B、牛肉膏蛋白胨培养基C、麦芽汁培养基D、查氏培养基7、一般酵母菌适宜的生长pH为（）。
A、5.0~6.0B、3.0~4.0C、8.0~9.0D、7.0~7.58、一般细菌适宜的生长PH为（）。
A、5.0~6.0B、3.0~4.0C、8.0~9.0D、7.0~7.59、对厌氧微生物正常生长关系最大的物理化学条件是（）。
A、pH值B、渗透压C、氧化－还原势D、水活度10、高氏1号培养基适合培养（）。
A、细菌B、放线菌C、酵母菌D、霉菌11、下列关于微生物的营养，说法正确的是（）。
A、同一种物质不可能既作碳源又作氮源B、凡是碳源都能提供能量C、除水以外的无机物仅提供无机盐D、无机氮源也能提供能量12、适合细菌生长的C/N比为（）。
A、5:1B、25:1C、40:1D、80:113、被运输物质进入细胞前后物质结构发生变化的是（）。
A、主动运输B、扩散C、促进扩散D、基团转位14、EMB培养基对大肠杆菌群有显著的鉴别力，主要是依据的原理是（）。
A、发酵蔗糖产酸B、发酵乳糖产酸C、伊红，美蓝分别显色D、伊红，美蓝结合后显色15、富集土壤真菌用的常用选择性培养基是（）。
A、酵母菌富集培养基B、Ashby无氮培养基C、LB培养基D、马丁氏培养基16、蓝细菌的营养类型为（）。
产角蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选与鉴定
产角蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选与鉴定
韩学易;陈惠;胥兵;赖欣
【期刊名称】《农技服务》
【年(卷),期】2008(025)004
【摘要】从长期堆积腐烂羽毛的土壤中分离出一株能降解羽毛角蛋白的细菌,经形态学观察和生理生化试验,初步鉴定为短小芽孢杆茸,且命名为短小芽孢杆茵B-15.【总页数】2页(P121-122)
【作者】韩学易;陈惠;胥兵;赖欣
【作者单位】四川农业大学生命科学与理学院,四川雅安,625014;四川农业大学生命科学与理学院,四川雅安,625014;四川农业大学生命科学与理学院,四川雅
安,625014;四川农业大学生命科学与理学院,四川雅安,625014
【正文语种】中文
【中图分类】X703
【相关文献】
1.产纤维素酶芽孢杆菌C-36的分离筛选及其鉴定 [J], 高凤菊;陈惠;吴琦;梁如玉;韩学易;官兴颖
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林芝产弹性蛋白酶嗜碱芽孢杆菌的分离及鉴定
ｓ ｕ ｈｅ ｏｓ ’ ｓｉａｄｓｗ ｇ ｆ ａｉ ｏ ｎｉ ｙ ｇｈ， ｎ ｏ ｔ ． ｈ ｔ （ Ｃ ｏ ｙｒｌｓ ｆ ｌｓｎｆｒ ｄ ｌ ｇｔｒ ｕｅＳ ｏ ｎ ｅ ａｅｏ ｙ Ｔ ｗ Ｎ ｉ ｃｉａｄｉ ｌ ｅ ｉ Ｔ ｅｒ ｉ Ｈ ） ｆ ｄ ｙｉ ｏ ａｔ ｍｅ ａ ｈ ｌ Ｂ ｎ ｎ ｓａｄｔ ａｏ Ｈ ｏ ｓ ｅ ｉ ｏ ｔ ｎｐｒｎ ｉ ｌ ｄａ ｅｅ ｅｄａ ｅ ｒ ｆｔ ｏ ｎ ｅｌ ｇｓ ａ ｓａｃ ｂｅｔＴａｓａｅ ｔ ｉ ｌ ｄａ ｅ ｒａｄ ｒ ｓａｅ ｔ ｒ ｅ ｉ ｔ ｔ ｔ ｉｍ ｔ ｅｃｌ ｙｉ ｔ ａ ｅｔ ｓ ｅｅｒｈｏｊｃ． ｒｎｐｒｎ ｒ ｅ ｉｍ ｔ ｎ ａ ｃ ｃ ｍ ｒｏ ｈ ｅｏ ｈ ｏ ｓｈ ｒ ｒ ｃｃ ｅ
第４ ７卷 （ 第 １５研 ） 昆 ６
马 长 中等 ： 林芝 产 弹性 蛋 白酶 嗜碱 芽 孢 杆 菌 的分 离 及 鉴 定
５ ３
业 的发展 具有 重要 的意义 。
１ 材料 与方 法
１１ 材 料 ． １ ． 主 要 试 剂 ．１ １
株在 平板 上 的弹性 蛋 白水解 圈和菌 落 ，把 平板 上 的 菌 落 直 径 和弹 性 蛋 白水 解 圈 直 径 之 比值 （ Ｃ） 大 Ｈ 最 的 菌落 编号 为 Ｂ 以它作 为 研究 对 象 ， Ａ， 进行 形 态学
２ 结果 与分 析
２１ 形 态 学鉴定 结果 ．
２１１ 个体 形态 特征 ．．
菌株 Ｂ ｚ Ａ 的个 体形 态 如 图 １ 。该菌 为 革 兰 氏 阳
分 离 培 养基 ［ 用 Ｈ ｒ ｏｈ 培养 基 ， ａ １ 改 ６ ３ 采 ｏｉ ｓｉ ｋ ＮＣ量
为 ５／。 ｇＬ
性 菌 ，菌体 呈直 杆状 ，两端 钝 圆 ，宽Ｘ 为 ０５ｘ ～ 长 ．１ ｍ ０８￣ １ ３ ．ｐ ｍｘ ． ｍ～ ｍ。芽孢 中生 、 圆状 。无 荚膜 。 ２ 椭
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选组别：第*组班级：生工**班组员：***指导老师：***一、实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌二、实验内容蛋白酶产生菌的分离三、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。
将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。
也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
四、实验材料和用具1.材料：土壤样品2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
五、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2配制200mL奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2脱脂奶粉 3g，配制200mL（二）分离1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。
2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。
3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h.4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
（三）筛选1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。
蛋白酶产生菌的分离
蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。
也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。
本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。
1 实验材料1.1 实验样品校园内土壤样品1.2实验仪器与材料牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。
2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法1.称量按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。
2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
3.调pH4.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
5．包扎塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
6．灭菌将上述培养基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 15-20min高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
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分离产蛋白酶的芽孢杆菌菌株的分离方案
一．取样环境及原因
选择一块污染较少且植被丰富，腐殖质较厚的地块，取表层一下5—10cm处的土样，这样可以保证土壤中有多种类和多数量的高活性的微生物，并且可以避免污染物对菌种的影响。
二．筛选流程
1)将采集的土壤样品用无菌水制备1:10的土壤悬液。
2)取1:10土壤悬液5mL，注入已灭菌的试管中，将试管放入75—80℃水浴中
热处理10min，以杀死非芽孢细菌及其他微生物。
3)取热处理过的悬液100—200μL，涂布接种到牛肉膏白胨培养基平板，将平板倒置，
于30—32℃培养24—48小时。
4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，
做芽孢染色，选出芽孢杆菌菌落。
5)从芽孢杆菌菌落处分别挑取少许菌苔，接种到含酪蛋白的斜面培养基上，再点接于含酪
蛋白的平板，30—32℃培养24—48h，测定平板上菌落苔直径和水解圈的直径。
6)筛选出水解圈于菌落直径比值大的菌落进行发酵培养，取发酵液进行酶活力测定。
再取
发酵液酶活力大的菌落进行接种培养。
三．筛选模型的选择及原因
芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌，并且广泛存在于土壤中，且其性质稳定，可较容易与其它细菌分离，繁殖速度快，体积较大，在培养时可抑制有害菌生长。
而且对人体无害，可代谢生产多种酶和有机酸。
四．如何检验筛选所得的菌株是所需的目的菌种
芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，可用革兰氏染色法初步判定，且其在酪蛋白平板上会产生水解圈，并且其菌种有体积较大，表面干燥、粗糙、不透明等特征，较易和其它菌种分辨。
还可以利用显微镜观察比较其形态特征来判定是否为芽孢杆菌。