海洋弧菌褐藻胶裂解酶的分离纯化及性质
褐藻胶裂解酶基因alyB的重组表达及性质研究
褐藻胶裂解酶alyB基因的重组表达及其性质研究摘要褐藻胶裂解酶是通过β-消去机制降解褐藻胶，它不但作为工具酶用于褐藻寡糖的制备，而且本身具有一定的药用价值。
然而，由于褐藻胶裂解酶分离纯化困难以及酶活性低等原因，迄今为止没有一种产业化的褐藻胶裂解酶。
因此，寻找高活力的新褐藻胶裂解酶具有重要的理论意义和明确的应用前景。
本文利用pET24a（+）建立了alyB的高效表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了重组表达。
重组AlyB用DEAE Sepharose Fast Flow柱离子交换层析纯化为电泳纯，其分子量通过SDS-PAGE电泳分析为35.6 kDa，与其理论分子量一致。
重组AlyB反应最适pH值为7.5，最适反应温度为40℃。
AlyB在60℃100mM PB (pH7.5)中保存1h后，会失去约90%的活性。
Ba2+、Mg2+、K+、(NH4)2SO4和EDTA显著地增强AlyB的活性。
关键词：褐藻胶裂解酶；重组表达；性质The expression and Characterization of Gene alyBencoding Alginate LyaseAbstractAlginate lyase degrades alginate through beta-elimination mechanism. It is not only a tool for the preparation of alginate oligosaccharides, but also has some medicinal value. However, because of difficulties in purification of alginate lyase and its low activity, none of the industrialized alginate lyase is found so far . Therefore, search for new highly dynamic alginate lyase has important theoretical value and specific prospect. Using pET24a（+）as an efficient expression vector of alyB, the recombinant gene is expressed in E. coli BL21 (DE3).The recombinant AlyB is purified to electrophoretic homogeneity by DEAE Sepharose Fast Flow chromatography, and the molecular weight of AlyB is estimated to be 35.6 kDa by SDS-PAGE, consistent with its theoretical molecular weight. AlyB exhibites optimum pH at 7.5 and optimum temperature at 40℃. After preserved for 1h at 60℃in 100mM PB (pH 7.5), AlyB loses about 90% of its activity. Ba2+, Mg2+, K+, (NH4)2SO4 and EDTA significantly enhance the activity of AlyB.Key words ：Alginate lyase Expression Characterization目录第一章引言 (4)1、褐藻胶 (4)1.1 褐藻胶的基本结构 (4)1.2 褐藻胶的来源 (5)1.3 褐藻胶寡糖及褐藻多糖生物活性研究 (5)1.4 褐藻多糖在细菌生物膜中的生物功能 (6)2、褐藻胶裂解酶 (7)2.1 褐藻胶裂解酶的来源 (7)2.2 褐藻胶裂解酶的底物特异性 (8)2.3 褐藻胶裂解酶的分类 (8)2.4 褐藻胶裂解酶的作用机制 (9)2.5 褐藻胶裂解酶的活性测定方法 (9)2.6 褐藻胶裂解酶的生物学功能 (10)2.7 褐藻胶裂解酶的应用 (11)3、小结 (12)第二章褐藻胶裂解酶AlyB的制备及分离纯化 (13)1、实验材料 (13)1.1菌株与培养基 (13)1.2 试剂 (13)1.3 仪器 (13)2、实验方法 (14)2.1 AlyB的制备 (14)2.2 AlyB的纯化 (14)2.2.1 硫酸铵沉淀 (14)2.2.2 DEAE Sepharose Fast Flow柱离子交换层析 (14)2.3 酶活的紫外吸收法测定 (14)3、结果 (15)3.1 AlyB分离纯化 (15)3.1.1 硫酸铵沉淀 (15)3.1.2 DEAE Sepharose Fast Flow柱离子交换层析 (15)3.2 褐藻胶裂解酶AlyB的性质分析 (15)3.2.1 温度对酶活性的影响 (15)3.2.2 pH对酶活性的影响 (16)3.2.3 EDTA、金属离子对酶活性的影响 (16)4、讨论 (17)参考文献 (19)第三章致谢 (22)第一章引言近年来，伴随着海洋热，越来越多的人开始关注海洋，尤其关注海洋药物的开发及研究。
褐藻胶裂解酶及其裂解产物的研究进展
食品研究与开发２００６．Ｖｏｌ．２７．ＮＯ．１１褐藻胶是褐藻酸盐、褐藻酸及其衍生物的统称，是从海带、马尾藻、巨藻等褐藻间质中提取的多糖聚合物。
主要由１，４－β－Ｄ－甘露糖醛酸（Ｍ）及其Ｃ５差向异构体１，４－α－Ｌ－古罗糖醛酸（Ｇ）两种糖醛酸单体聚合而成。
聚合方式有四种：可以由多聚β－Ｄ－甘露糖醛酸（ＰｌｏｙＭ）或多聚α－Ｌ－古罗糖醛酸（ＰｌｏｙＧ）构成均聚物，也可以由ＭＧ交替（ＰｏｌｙＭＧ）或Ｍ、Ｇ以不同比例随机构成杂聚物［１］。
近年来，褐藻胶的开发利用引起了人们广泛重视，对褐藻胶裂解酶及其降解产物的研究成为热点。
本文就这两方面作较为详细的总结与阐述。
１褐藻胶裂解酶１．１来源褐藻胶裂解酶主要有三个来源：第一类是动物源的褐藻胶裂解酶，包括海洋软体动物和棘皮动物等。
１９８４年，国内的朱仁华等［２］从朝鲜花冠小月螺、单齿螺和褐疣荔枝螺３种海螺中分离得到褐藻胶裂解酶的粗酶提取液，用粘度法测定了酶活力，尤以朝鲜花冠小月螺的分解活性最高。
１９８７年，Ｋｌｏａｒｅｇ等［３］从海兔内脏中制备出褐藻酸酶，用于墨角藻合子的去壁，制备出了原生质体。
１９８９年，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等［３］从海螺、鲍的内脏中制备出褐藻解壁酶，用于某些褐藻的细胞解离。
第二类是植物源的褐藻胶裂解酶，包括巨藻、泡叶藻、掌状海带、克氏海带等海藻。
１９６６年，ＬｉｎＹ．Ｔ．等［４］从海洋褐藻ＦｕｃｕｓｇａｒｄｎｅｒｉＳｉｌｖａ中分离提纯出褐藻酸酶。
１９９９年，Ｋｒａｉｗａｔｔａｎａｐｏｎｇ等［５］自腐败海藻ｋｏｍｂｕ中分离出一株褐藻胶酶高产菌Ｎ－１，并对其降解酶基因进行了克隆和测序。
第三类是微生物源的褐藻胶裂解酶，包括海洋细菌、土壤细菌和真菌等。
１９８４年，Ｊｅｆｆｒｅｙ等［６］以褐藻酸钠为惟一碳源，从土壤和海水中分离出产生褐藻酸裂解酶的芽孢杆菌，胞外酶表现出明显的内切甘露糖醛酸裂解酶性质，酶的分子量约为４０ｋＤ。
２００１年，Ｉ－ｗａｍｏｔｏ［７］等人研究发现埃氏别单胞菌（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．）可以产生一种褐藻酸胞内裂解酶，分子量为３３．９ｋＤ，ｐＩ为３．８，在ｐＨ７．５￣８．０时，具有最高活性。
褐藻酸裂解酶的结构、性质及应用
褐藻酸裂解酶的结构、性质及应用Hee Sook Kim，Choul-Gyun Lee and Eun Yeol Lee摘要褐藻胶是一种线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸（M）与其差向异构体α-L-古洛糖醛酸（G）通过1，4糖苷键连接形成不同的结构。
褐藻酸裂解酶因其高粘度及凝胶作用可作为一种食品添加剂来改善食品的质地。
该酶可以通过β-消除机制裂解糖苷键来降解褐藻胶，产生一个具有非还原末端的结构。
褐藻寡糖已被发现具有促进人内皮细胞生长以及巨噬细胞细胞因子释放的作用。
褐藻胶可以通过褐藻酸裂解酶的内切及外切作用，降解为含有不饱和键的单糖。
因此，在不久的将来，褐藻酸裂解酶有潜力作为生物催化剂，以褐藻胶作为可再生资源生产生化试剂及生物燃料。
本文介绍了不同的褐藻酸裂解酶的结构、功能并对褐藻酸裂解酶的应用前景进行了讨论。
关键词褐藻胶；褐藻酸裂解酶；褐藻寡糖；不饱和单糖1 介绍褐藻胶是一种线性多糖，其中其中β-D-甘露糖醛酸（M）与其差向异构体α-L-古洛糖醛酸(G)通过1.4糖苷键按照不同顺序连接而成，其中α-L-古洛糖醛酸是β-D-甘露糖醛酸的C5异构体。
这两种糖醛酸可以形成聚甘露糖醛酸和聚古洛糖醛酸以及甘露糖醛酸与古洛糖醛酸的随机聚合物。
褐藻胶在自然界存量丰富，其作为藻类植物的组成成分，占到了藻类植物干重的44%。
一些细菌也可以合成褐藻胶。
目前，褐藻胶主要用作食品添加剂来改变食物的质感，也被用作固定细胞及组织的介质。
商品级的褐藻胶可通过从海洋大型藻类中提取的方式生产。
褐藻酸裂解酶通过β-切割糖苷键来降解褐藻胶，生产多种以不饱和糖醛酸作为非还原末端的寡糖以及不饱和糖醛酸单体。
多种褐藻酸裂解酶已从海藻、海洋无脊椎动物、海洋及部分土壤微生物中分离得到。
褐藻酸裂解酶可以依据底物特异性分为PM特异性、PG特异性、PMG特异性。
对于相应的底物特异性，褐藻酸裂解酶具有内切酶与外切酶两种活性。
褐藻寡糖已经显现出许多引人注目的生物活性，它可以促进人内皮细胞的生长以及巨噬细胞细胞因子的释放。
海洋弧菌(Vibrio sp.QD-5)褐藻胶裂解酶基因的r克隆和生物信息学分析
海洋弧菌(Vibrio sp.QD-5)褐藻胶裂解酶基因的r克隆和生物信息学分析晁雅熙;王淑艳;吴谡琦;陈颢【摘要】以海洋弧菌(Vibrio sp.QD-5)的基因组为模板,使用设计的褐藻胶裂解酶引物进行PCR扩增.将目的基因克隆至pet-22b(+)载体后进行测序.测序结果显示,基因aly-I I的大小为2170 bp,预测编码含有723个氨基酸的蛋白质.对该蛋白质进一步进行了生物信息学分析.利用ProtParam和ProtScale对蛋白质的理化性质进行分析,结果表明,蛋白质Aly-II的理论分子质量为85.6 kDa,理论等电点为5.1,并且是一种亲水性蛋白.利用软件MEG 6.0对蛋白质Aly-II进行系统发育分析,结果显示,蛋白质Aly-II很可能是PL-17家族的褐藻胶裂解酶.利用同源建模法构建蛋白质Aly-II的三维结构,Aly-II含有2个结构域,分别为(α/α)6 toroid结构域和β-sheet结构域.%Using designed specific primers,the target aly-I I gene was amplified by PCR from the genomic DNA of Vibrio sp.QD-5,cloned into pet-22b(+)vector and then sequenced.The result showed that the cloned gene was 2170 bp,encoding 723 amino acid residues.The bioinformatics analysis of Aly-II protein was further conducted using ProtParam and ProtScale to analyze the physical and chemical properties of the protein.The theoretical molecular weight and pI of Aly-II were 85.6 kDa and 5.1,respectively.The protein had hydrophilic property.The phylogenetic trees were constructed by MEG 6.0 and phylogenetic a-nalysis showed that,Aly-II was most likely an alginate lyase of PL-17 family.The three-dimensional struc-ture of Aly-II was constructed using homology modelingmethod.The structure of Aly-II displayed that it contained two domains,i.e.,(α/α)6 toriod domain andβ-sheet domain.【期刊名称】《海洋科学进展》【年(卷),期】2018(036)002【总页数】11页(P290-300)【关键词】Vibrio sp.;褐藻胶裂解酶;基因克隆;生物信息学分析【作者】晁雅熙;王淑艳;吴谡琦;陈颢【作者单位】国家海洋局第一海洋研究所,山东青岛 266061;国家海洋局第一海洋研究所,山东青岛 266061;国家海洋局第一海洋研究所,山东青岛 266061;国家海洋局第一海洋研究所,山东青岛 266061【正文语种】中文【中图分类】Q939.97褐藻胶是一类主要存在于褐藻细胞壁中的水溶性酸性多糖,由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸组成,2个单体之间通过α-1,4-糖苷键可组成3种不同的褐藻胶分子,分别为多聚甘露糖醛酸(poly M)、多聚古洛糖醛酸(poly G)和杂聚物(poly GM)[1]。
1株产褐藻胶裂解酶海洋细菌的分离鉴定及其酶学性质
９ ７ ， Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ登 录 号 为 ＨＭ１ ３ ０ ９ １ ９ ； 该 酶 具 有 同时 降 解 高 古 罗糖 醛 酸 聚 合 物 和 高甘 露 糖 醛 酸 聚 合 物 的 能 力 ， 其 最适作用 ｐ Ｈ 和温度分别为 ７ ． ５和 ４ Ｏ℃ ， Ｍｇ 、 Ｎａ 、 Ｆ ｅ ”、 Ｍｎ 。 等对 酶 活 力 有 促 进 作 用 ， Ｚ ｎ ” 有抑制 作用 ， １ ． ０
关键 词 海 洋 细 菌 ；交替 假 单 胞 菌 ；１ ６ Ｓ ｒ Ｒ ＮＡ； 褐 藻胶 裂解 酶 ；酶 学 性 质
中 图 分 类 号 Ｑ ９ ３ ６ 文 献 标 志 码 Ａ
Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏｎ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏｆ ａ ｎ ａ ｌ ｇ ｉ ｎ ａ ｔ ｅ ｉ ｙ ａ ｓ ｅ － ｐｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ ｍ ａ ｒ ｉ ｎｅ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ａ ｎｄ ｉ ｔ ｓ
浙 江大 学 学 报 （ 农业与生命科学版） ３ ９ （ ４ ） ： ３ ８ ７ ￣３ ９ ５ ， ２ ０ １ ３
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｚ ｈ ｅ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ．＆ Ｌｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ． ｈ ｔ ｔ ｐ： ／ ／ ｗｗｗ． ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｓ ． ｚ ｊ ｕ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ ／ ａ ｇ ｒ Ｅ— ｍａ ｉ ｌ ： ｚ ｄ ｘ ｂ ｎ ｓ ｂ ＠ｚ ｊ ｕ． ｅ ｄ ｕ． ｃ ｎ ＤＯＩ ： １ ０． ３ ７ ８ ５ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ． １ ０ ０ ８ — ９ ２ ０ ９ ． ２ ０ １ ２ ． １ １ ． ３ ０ ０
海洋细菌 Pseudoalteromonas sp. 01中新型褐藻胶裂解酶AlyPC1的研究
海洋细菌 Pseudoalteromonas sp. 01中新型褐藻胶裂解酶AlyPC1的研究张红秀;刘晓华;刘伟治【期刊名称】《中国海洋大学学报(自然科学版)》【年(卷),期】2024(54)2【摘要】为挖掘新型褐藻胶裂解酶,使其开发成为制备褐藻寡糖的工具酶,本研究中表征了来源于海洋细菌Pseudoalteromonas sp.01的褐藻胶裂解酶AlyPC1。
本文作者在生物信息学分析的基础上,对AlyPC1进行了重组表达及酶学性质的研究。
序列比对结果显示,AlyPC1是PL7家族第五亚家族的一个褐藻胶裂解酶。
酶学性质研究发现:AlyPC1最适反应温度为35℃,将AlyPC1置于5~30℃孵育1 h,仍保留80%以上的酶活;在Tris-HCl缓冲液中,AlyPC1最适反应pH为8.0,当pH在7.5~9.0之间时,酶活保留了90%以上,证明AlyPC1具有良好的温度稳定性以及宽泛的pH耐受性;反应体系中NaCl的含量为200 mmol/L时,AlyPC1的酶活最高;乙二胺四乙酸(EDTA)以及一些金属离子如Mn 2+、Zn 2+和Ni 2+等能够明显抑制AlyPC1的活性。
AlyPC1能够降解褐藻胶、polyG以及polyM三种底物,因而说明AlyPC1是一种双功能褐藻胶裂解酶。
同时,AlyPC1以内切的形式降解褐藻胶,产生二糖、三糖以及四糖。
【总页数】6页(P84-88)【作者】张红秀;刘晓华;刘伟治【作者单位】中国海洋大学海洋生命学院海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q557【相关文献】1.1株产褐藻胶裂解酶海洋细菌的分离鉴定及其酶学性质2.海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究3.从海洋中分离的弧菌QY102褐藻胶裂解酶的纯化和性质研究4.海洋细菌A78的鉴定及褐藻胶裂解酶特性的研究5.海洋细菌来源低温褐藻胶裂解酶的分泌表达和酶学性质研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
海洋生物中重要酶类的纯化与鉴定
海洋生物中重要酶类的纯化与鉴定随着人们对海洋资源的深入开发和研究，发现海洋中存在着许多珍贵的生物资源，其中包括很多重要酶类。
酶是一种生物催化剂，对于化学反应速度的加速、生物物质的合成和降解、代谢调控等方面都起着至关重要的作用。
因此，海洋中的酶类资源具有广阔的研究和应用前景，是现代生物技术和药物研究领域中不可缺少的重要资源。
然而，海洋中的生物资源非常复杂，要从中提取和纯化出目标酶类，需要经过一系列复杂的操作和检测步骤。
下面将介绍海洋生物中重要酶类的纯化与鉴定。
一、酶类的来源与分类酶类来源于自然界中的各种生物，包括动物、植物和微生物等。
根据其作用特性和结构特征，可以将酶类分为多种类型，如水解酶、氧化酶、还原酶、转移酶、异构酶等。
在海洋生物中，也存在着各种类型的酶类，如蛋白酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶等。
二、酶类的纯化方法酶类的纯化是指将海洋生物中的目标酶类从其他杂质分离出来，得到较为纯净的酶制剂的过程。
酶类的纯化方法一般分为物理方法和化学方法两种。
1.物理方法物理纯化方法主要包括离心、摇床、超滤等。
其中，离心法是通过不同的离心速度将混合物中的细胞碎片、代谢产物等不同大小和密度的物质分离开来，从而得到目标酶类。
摇床法是利用水平振荡将混合物分成不同重量的层次，从而将目标酶类分离出来。
超滤法则是利用不同的孔径大小过滤膜将不同分子量的物质分离出来。
2.化学方法化学纯化方法主要包括沉淀分离、离子交换、凝胶过滤、亲和层析等。
其中，沉淀分离法是利用加入一些沉淀剂，将想要分离的酶类沉淀下来。
离子交换法则是利用具有活性的离子交换树脂将混合物中的酶分离。
凝胶过滤法是利用具有孔隙的聚合物凝胶将不同分子大小的物质分离开来。
亲和层析则是利用与目标酶类有特异性结合的亲和剂纯化出目标酶制剂。
三、酶类的鉴定方法酶类的鉴定是指对酶制剂的纯度、活性、稳定性等指标进行测试分析，以确定是否满足制药或其他生物技术应用的要求。
常用的酶类鉴定方法主要包括以下几种：1.测定酶的活性：通过测定酶对某种底物的反应速度来确定酶的活性水平。
褐藻胶裂解酶的研究进展
褐藻胶裂解酶的研究进展罗丹丹;薛永常【摘要】褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸及其C5差向异构体α-L-古洛糖醛酸结合而成的线性高分子多糖。
褐藻胶裂解酶通过β消去机制能将褐藻胶降解成具有生物活性的褐藻寡糖。
褐藻寡糖因具有独特的促进生长、增强植物抗性、抑菌等生理活性而日益受到人们的关注。
简要概述了褐藻胶裂解酶的来源分类、结构功能、酶学性质、褐藻寡糖的应用等方面的研究进展，为褐藻胶裂解酶在工业生产的应用提供理论依据。
%Alginate lyases can catalyze the degradation of alginate , a complex copolymer of L-guluronate and its C5 epimer D-mannur-onate, withβ-elimination mechanism and yield alginate oligosaccharides .Alginate oligosaccharide has many kinds of biological activi-ties, such as promoting growth , enhancing resistance in plant and bacteriostasis , so that they have attracted more and more people′s at-tention.In this paper some research progress in the classification , structure, function, enzymatic properties of alginate lyase and the application of alginate oligosaccharides were reviewed .It will provide a theoretical basis for its application in industrial production .【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2016(033)006【总页数】4页(P95-98)【关键词】褐藻胶;褐藻胶裂解酶;褐藻寡糖【作者】罗丹丹;薛永常【作者单位】大连工业大学生物工程学院，大连116034;大连工业大学生物工程学院，大连116034【正文语种】中文【中图分类】Q939.9褐藻胶是存在于褐藻细胞壁及细胞间质的水溶性酸性多糖，由β-D-甘露糖醛酸及其C5差向异构体α-L-古洛糖醛酸两种糖醛酸单体通过1,4糖苷键随机聚合而成[1]。
褐藻胶裂解酶
褐藻胶裂解酶
褐藻胶裂解酶是一种能够分解褐藻胶的酶类物质，其作用是将褐藻胶的高分子链断裂为低分子量的寡糖和单糖，可用于食品、医药、化妆品等领域。
褐藻胶裂解酶可分为内切酶、外切酶和转移酶等不同类型。
其中，内切酶能够在褐藻胶分子的内部水解出多种不同长度的低分子量寡糖，而外切酶则能够从褐藻胶分子的末端以糖基水解的形式释放出单糖。
转移酶则可将胶链上的碳水化合物从一个位置转移到另一个位置，形成不同结构的多糖。
目前，褐藻胶裂解酶已经成为一种非常有前景的生物技术产品，可以为人类健康和经济发展带来很好的效益。
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ΙΣΣΝ 2
生物化学与生物物理学报
≤×
≤
≤
° ≠≥ ≤ ≥ ≤
ΧΝ 2
±
海洋弧菌褐藻胶裂解酶的分离纯化及性质
宋 凯 于文功 3 韩 峰 韩文君 李京宝
≤×
≤
≤
° ≠≥ ≤ ≥ ≤
∂
Ταβλε 3 Συβστρατε σπεχιφιχιτψ οφ αλγινατε λψασε φρο µ ς ιβριο σπ . ΘΨ101
≥∏ ≥∏
° °
√√
利用自制的
和
对酶的底物特
异性进行初步研究 结果表明 ςιβριο σπ ± ≠ 产
生的褐藻胶裂解酶对两种底物具有相同的活性 表
为一个酶活
力单位 ∀
温度对酶活性的影响 酶液分别在 ε !
ε ! ε ! ε ! ε ! ε ! ε ! ε 下保温
迅速冷却至 ε 紫外吸收法测定酶活性 同
时 分别测定酶液在不同温度下的活性 以确定酶
反应的最适温度 ∀
对酶活性的影响 缓冲液体系为
° 2柠 檬 酸
∗
°2
°
∗
× 2≤
∗
甘氨酸2
∗
∀酶分
别溶于上述缓冲液中 ε 保温
Ταβλε 1 Α συ µ µ αρψ οφ αλγινατε λψασε πυριφιχατιον (φρο µ 4 .0 Λ χυλτυρε)
× °∏
≤∏ ∏ ∏
≥
⁄∞ ∞ ≥
ƒƒ
≥∏ ¬
×
≥
√
√
∏∏
2 √
°∏ 2
Φιγ .5 Εφφεχτσ οφ διφφερεντ π Η ον αλγινατε λψασε
°
产品 ⁄
∏
°
! 2 ≤ 冷冻离心机为
公
司产 品
≥
为 ≥≠ ∞ ∞ 公司产
品 × 2 2 ƒ 摇床为 ×
≥
∏2
≤ 产品 ∀其他试剂均为国产分析纯试剂 ∀
1 2 方法
产酶菌株的筛选和培养 取海带糜烂部
分 用褐藻胶唯一碳源的选择性培养基进行富集培
养 ∗ 周 平板划线分离单克隆 连续培养 代
液体发酵进行复筛 紫外吸收法检测酶活性
σπ ± ≠ 为海洋细菌 生存环境中的高盐浓度可
能导致了 ≤ 对于这种酶获得最大活性是必须
的 ∀也可能 ≤ 通过破坏包围在底物褐藻酸钠附
近的水分子 或者通过影响褐藻胶2酶复合物的电 荷起到促进酶活性的作用≈ ∀
在酶的热稳定性实验中 发现粗酶液 硫酸铵
沉淀的酶液 中酶的热稳定性较高 ∀当在 ε 保温
粗酶仍然保持了 的酶活性 而纯化的酶
中国海洋大学海洋药物与食品研究所 青岛
摘要 从海带糜烂物中分离到一株高产胞外褐藻胶裂解酶的海洋弧菌 ςιβριο σπ . ± ≠
利用硫酸铵沉淀 !
离子交换层析 ! 凝胶过滤层析等方法从发酵液中分离纯化了褐藻胶裂解酶
∀≥⁄≥2° ∞ 电泳结果表
明 该酶分子量为 ⁄ ∀酶反应最适 为
最适反应温度为 ε ∀ !≤ ! 对酶活性有促进作用
∀
讨论 ⁄ ∏
ςιβριο σπ ± ≠ 为利用褐藻胶唯一碳源的选 择性培养基从海带的糜烂部分筛选到的一株高产胞
外褐藻胶裂解酶的海洋细菌 ∀该菌株在以褐藻胶为
唯一碳源的培养基中生长迅速 单克隆在 ε 振
荡培养
即可明显降低发酵液的黏度 同时在
处出现显著的吸收峰 证明有大量褐藻胶
被降解 ∀
通过硫酸铵沉淀 !离子交换层析及凝胶过滤层
×
∏
2 .2 Σ∆Σ2ΠΑΓ Ε 电泳 经过硫酸铵沉淀 !离子交换层析以及凝胶过滤
层析收集的酶液 进行 ≥⁄≥2° ∞ 电泳 如图 所 示 ∀ 电泳结果表明纯化后的样品只有一条带 达到 电泳纯水平 ∀根据分子量标准进行计算 分子量大 约为 ⁄ ∀
Φιγ .3 Σ∆Σ2ΠΑΓ Ε οφ αλγινατε λψασε πυριφιεδ φρο µ
的 但是由于酶的性质的差异 即使同一种属来源
的褐藻胶裂解酶 其受金属离子的影响也是不同
的 ∀本研究从 ςιβριο σπ . ± ≠ 中纯化到的褐藻胶
裂解酶 在 ≤ 浓度为
≤ ≤ 浓度为
时 活性最高
的 ≤或
的 ≤ ≤ 都会降低酶的活性 与已报道的
几种 弧 菌 来 源 的 酶 明 显 不 同≈ ∗ ∀由 于 ςιβριο
藻胶裂解酶
是通过 Β 消去机制降解褐藻
胶 ∀近年来 随着寡糖降解和分离技术的发展 褐藻
寡糖巨大的应用潜力越来越受到关注≈ ∗ ∀褐藻胶
的酶解法 反应条件易控制 底物特异性高 在寡
糖制备各方面明显优于化学和物理降解 因此褐藻
胶裂解酶已成为目前研究的热点 ∀
来自于海洋细菌的褐藻胶裂解酶不但作为工具
酶用于褐藻寡糖的制备≈ 而且本身具有一定的
脱组分 图 ∀紫外吸收法检测酶活性 发现酶活性集
中在
梯度处 大量收集活性组分 ∀
Φιγ . 1 Χηρο µ ατογραπηψ οφ χρυδε ενζψµ ε φρο µ ς ιβριο σπ .
ΘΨ101 ον α ∆ Ε ΑΕ Σεπηαροσε Φαστ Φλοω χολυ µ ν
×∏
⁄∞ ∞ ≥
作用 ∀当在底物中加入一定浓度的 ≤ 时 对酶
活有促进作用 ∀实验表明 当底物中 ≤ 浓度为
时 酶的活性最高 为未加 ≤ 时的
但是当 ≤ 浓度超过
时 酶的
活性受到一定抑制 ∀
Ταβλε 2 Εφφεχτσ οφ ρεαγεντσ ον ενζψµ ε αχτιϖιτψ
≤
√√
Φιγ .4 Οπτιµ αλ τεµ περατυρε ανδ τηερµ αλ σταβιλιτψ οφ τηε αλγι2
ε 保存菌种 ∀选择性培养基
褐藻酸钠
≤
°
°
≥
≥
ij
∀
在已筛选到的产酶菌株中 选酶活力较高的菌
株 ± ≠ 为研究对象 ∀根据 ≥ ⁄ 序列及生
理生化指标分析鉴定为 ςιβριο σπ ∀挑取单克隆接
种到含 培养基的
离心管中 ε
振荡培养
以 的比例接种到含
培养基的
三角瓶中
ε
振荡
_中__国__科__技__论__文__在__线____________________________________________w_w_w_._p_a_p_e_r_._e_d_u_._c_n_
ƒ ! 以及 ∞⁄× 对酶活性有抑制作用 ∀酶的底物专一性初步分析结果表明 该酶具有降解多聚古罗糖醛酸
≈
及多聚甘露糖醛酸≈
的活性 ∀
关键词 海洋弧菌 褐藻胶 褐藻胶裂解酶 纯化 酶学性质
褐藻胶是一种来源丰富 !用途广泛的酸性海洋
多糖 由 Α2 Λ2古罗糖醛酸 及 Β2 ∆2甘露糖醛酸 随机组合形成的线性高分子量聚合物≈ ∀褐
在酶学性质研究方面 纯化的褐藻胶裂解酶具
有降解
和
的活性 ∀至今为止 从细
菌 !藻类 !软体动物中分离纯化到的褐藻胶裂解酶
大多数为具有降解
或
的活性≈ ∀
而同时具有降解
与
活性的褐藻胶
裂解酶 据文献报道 只有 ≥ 菌 Αλτερο µ ονασ σπ 株 2 以及 ≠ 洋细菌 Αλτερο µ ονασσπ . 株
ΘΨ1 0 1
≥ ⁄≥2° ∞
∏
≥∏
√
≥ ⁄≥
ς ιβριο σπ . ¬
2 .3 褐藻胶裂解酶的性质分析 温度对酶活性的影响 在不同温度下对
酶活性进行测定发现 酶反应的最适温度约为
ε ≈图
酶的热稳定性实验结果如图
酶的活性在 ∗ ε 之间基本稳定 而超过
ε 以后 酶活性随着温度的升高而降低 ∀
对酶活性的影响 在不同 下测定
≤×
≤
≤
° ≠≥ ≤ ≥ ≤
∂
培养
收集培养液 ∀
酶的分离纯化 发酵培养液在 ε
γ 离心
除菌体 ∀于上清液中缓慢加
入硫酸铵至 饱和度 ε 静置
ε
γ 离心
弃去上清液 沉淀溶于
磷酸盐缓冲液 ε 透析过夜 ε
γ 离心
取上清液 即为粗酶液 ∀
粗酶液上样于以
磷酸盐缓
冲液平衡的 ⁄∞ ∞ ≥
ƒ ƒ 柱进行离子
交换层析 ∀层析柱体积为
酶活性 发现大约
时酶活性最高 低于
时 酶活性随着 的升高而逐渐升高 高
于 时 酶活性随着 的升高而逐渐降低≈图
∀酶 活 性 在
∗ 之间较稳定≈图
∀
∞⁄× ! 金 属 离 子 对 酶 活 性 的 影 响
∞⁄× !金属离子对酶活性的影响实验结果如表
所示 ∀
! ≤ 对于酶的活性有促进作用 而
! ƒ ! 以及 ∞⁄× 对于酶的活性有抑制
ƒƒ
2
∏×
≤
)
π
√
ο
凝胶过滤层析
⁄∞ ∞2≥
ƒ
ƒ 纯化组分上样于 ≥∏ ¬
凝胶过滤柱
分部收集洗脱组分 图 ∀对收集物进行活性检测
大量收集活性组分 ∀
Φιγ .2 Χηρο µ ατογραπηψ οφ ∆ Ε ΑΕ Σεπηαροσε Φαστ Φλοω ρυν2οφφ
φραχτιονσ ον α Συπερδεξ 75(10/ 30) χολυ µ ν
在 ε 保温 酶活性迅速丧失 同时 发现粗酶