褐藻酸裂解酶的结构、性质及应用

褐藻酸裂解酶的结构、性质及应用Hee Sook Kim，Choul-Gyun Lee and Eun Yeol Lee摘要褐藻胶是一种线性多糖，由β-D-甘露糖醛酸（M）与其差向异构体α-L-古洛糖醛酸（G）通过1，4糖苷键连接形成不同的结构。

褐藻酸裂解酶因其高粘度及凝胶作用可作为一种食品添加剂来改善食品的质地。

该酶可以通过β-消除机制裂解糖苷键来降解褐藻胶，产生一个具有非还原末端的结构。

褐藻寡糖已被发现具有促进人内皮细胞生长以及巨噬细胞细胞因子释放的作用。

褐藻胶可以通过褐藻酸裂解酶的内切及外切作用，降解为含有不饱和键的单糖。

因此，在不久的将来，褐藻酸裂解酶有潜力作为生物催化剂，以褐藻胶作为可再生资源生产生化试剂及生物燃料。

本文介绍了不同的褐藻酸裂解酶的结构、功能并对褐藻酸裂解酶的应用前景进行了讨论。

关键词褐藻胶；褐藻酸裂解酶；褐藻寡糖；不饱和单糖1 介绍褐藻胶是一种线性多糖，其中其中β-D-甘露糖醛酸（M）与其差向异构体α-L-古洛糖醛酸(G)通过1.4糖苷键按照不同顺序连接而成，其中α-L-古洛糖醛酸是β-D-甘露糖醛酸的C5异构体。

这两种糖醛酸可以形成聚甘露糖醛酸和聚古洛糖醛酸以及甘露糖醛酸与古洛糖醛酸的随机聚合物。

褐藻胶在自然界存量丰富，其作为藻类植物的组成成分，占到了藻类植物干重的44%。

一些细菌也可以合成褐藻胶。

目前，褐藻胶主要用作食品添加剂来改变食物的质感，也被用作固定细胞及组织的介质。

商品级的褐藻胶可通过从海洋大型藻类中提取的方式生产。

褐藻酸裂解酶通过β-切割糖苷键来降解褐藻胶，生产多种以不饱和糖醛酸作为非还原末端的寡糖以及不饱和糖醛酸单体。

多种褐藻酸裂解酶已从海藻、海洋无脊椎动物、海洋及部分土壤微生物中分离得到。

褐藻酸裂解酶可以依据底物特异性分为PM特异性、PG特异性、PMG特异性。

对于相应的底物特异性，褐藻酸裂解酶具有内切酶与外切酶两种活性。

褐藻寡糖已经显现出许多引人注目的生物活性，它可以促进人内皮细胞的生长以及巨噬细胞细胞因子的释放。

因此，褐藻酸裂解酶作为制备功能性褐藻寡糖的生物催化剂引起了人们的注意。

褐藻酸裂解酶自身也可作为药物增强抗生素对铜绿假单胞菌的杀菌功效来治疗囊胞性纤维症。

不饱和的褐藻寡糖及不饱和糖醛酸单体可由褐藻酸裂解酶催化裂解得到。

本文讨论了褐藻酸裂解酶及其应用，特别是分析与对比了不同褐藻酸裂解酶的结构和功能，也讨论了褐藻胶及褐藻酸裂解酶在未来的应用前景。

图1褐藻胶的化学结构。

褐藻胶是一种由β-D-甘露糖醛酸与其C5异构体α-L-古洛糖醛酸通过β-1.4糖苷键按照不同顺序连接形成的直链多糖。

2 褐藻胶褐藻胶是一种带有阴离子的多糖，由PM、PG、PMG组成，pKa 1.5~3.5。

褐藻胶的生物功能主要是作为藻类的结构支撑物，其机械强度及弹性受到古洛糖醛酸单体含量的影响。

随着古洛糖醛酸单体含量的增加，胶体强度逐渐增大。

较低的古洛糖醛酸单体含量会使褐藻胶更有弹性。

商品级的褐藻胶可从海藻中提取出来，广泛用于食品工业和生物技术。

褐藻胶可作为凝胶剂生产凝胶状食品，增加冰淇淋的粘度，也可作为化妆品的增稠剂。

褐藻胶也可用作减肥食品的配料，因为它不能被胃肠道消化，不能作为能量来源。

褐藻胶可以结合二价阴离子，如钙离子和镁离子，产生凝胶作用。

由于褐藻胶凝胶能力不受温度影响并具有生物相容性，因而在许多生物技术的应用中，它被用于固定细胞。

一般来说，高含量的古洛糖醛酸可以形成强胶体粘度。

溶剂的pH对凝胶的形成影响显著，因为不同的pH可改变糖醛酸上离子的排布。

褐藻胶在医学中应用广泛。

它可作为治疗消化不良药物的制剂辅料，可用于烧伤和创伤的敷料，因为它可以消除或较小疼痛。

褐藻胶也可用作牙科的矫形材料。

褐藻胶还有许多其他方面的应用，例如作为螯合剂消除人体内的重金属及放射性毒素。

由于不与染料发生反应，它还可以作为增稠剂用于活性染料的染色过程。

3 褐藻酸裂解酶3.1 褐藻酸裂解酶在褐藻胶的生物合成与生物降解中的功能多种褐藻酸裂解酶已从海洋交足类生物、褐藻、小球藻病毒、海洋及土壤微生物中发现并被克隆和表征。

褐藻酸裂解酶在不合成褐藻胶与合成褐藻胶的生物中都被发现，在不合成褐藻胶的生物中，褐藻酸裂解酶在同化褐藻胶作为碳源的过程中起着重要作用。

海洋及土壤微生物具有多于一种的褐藻酸裂解酶来降解结构复杂的褐藻胶。

一些海洋动物在其消化道内也存在褐藻酸裂解酶来降解褐藻胶并将其作为碳源。

在能够合成褐藻胶的微生物中，褐藻酸裂解酶在褐藻胶的生物合成与生物降解中都起着重要作用。

对于产酶微生物的遗传研究已经揭示了褐藻酸裂解酶的基因位于其他褐藻胶合成酶基因的片段上，在褐藻胶的生物合成中，褐藻酸裂解酶似乎对于控制聚合物长度与优化聚合反应起到一定作用。

在合成褐藻胶的铜绿假单胞菌的粘膜上，褐藻酸裂解酶可以通过降解生物膜上的褐藻胶来促进细菌的扩散。

固氮菌产生的褐藻酸裂解酶可能与其孢子萌发有关。

在细胞休眠期，凝胶形式的褐藻胶是胞囊外被保护层的一部分，在萌发期，褐藻酸裂解酶对于胞囊的破坏是必要的。

一些微生物可以使用褐藻胶作为碳源。

此条件下，微生物可依靠褐藻酸裂解酶对β-1.4糖苷键的裂解作用降解褐藻胶，产生具有非还原末端结构的寡糖。

褐藻胶聚合物通过内切酶的作用降解为具有非还原末端的糖醛酸，内切型褐藻酸裂解酶具有降解PM、PG、PMG的多种活性。

褐藻寡糖可以通过外切型褐藻酸裂解酶的作用进一步降解为单糖。

这些单糖可在无酶催化的条件下生产DEH，然后转化为KDG，通过依赖NADPH的KDE转化酶的作用，将KDG转化为KDPG。

之后，KDPG被KDPG醛缩酶分解为丙酮酸与3-磷酸甘油醛这一糖酵解途径的重要中间体。

一般来讲，依靠褐藻胶生长的微生物使用胞外的褐藻酸裂解酶降解褐藻胶，然后将裂解产物转运至细胞质中，并通过细胞代谢来吸收它们。

例如鞘脂单胞菌等一些细菌可使用细胞周质中的ABC超家族转运系统直接吸收褐藻胶聚合物。

负责吸收褐藻胶的外膜蛋白被证实在其表面有一个凹陷。

整个转运系统包括三个部分，在细胞表面一个直径0.02～0.1μm的凹陷，细胞质间隙的褐藻胶结合蛋白以及在细胞膜上的ABC超家族转运系统。

当褐藻胶被运转至细胞质内之后，它被胞浆中的内切型与外切型褐藻胶裂解酶降解，在鞘脂单胞菌中，多种褐藻酸裂解酶存在于胞浆中。

而对于棕色固氮菌，褐藻酸裂解酶存在于细胞周质表面。

图2褐藻胶被内切型与外切型褐藻酸裂解酶通过β-消除机制降解。

不饱和单糖可由外切型褐藻酸裂解酶降解褐藻胶或褐藻寡糖的方式得到，这种单糖可在没有酶催化的条件下转化为4-脱氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸。

箭头所指为相应的褐藻酸裂解酶的酶切位点。

3.2褐藻酸裂解酶的结构褐藻酸裂解酶是多糖裂解酶系的一种，多糖裂解酶系可归类为22个家族，依据对其初级结构疏水区域的分析，褐藻酸裂解酶属于七个家族，PL-5、PL-6、PL-7、PL-14、PL-15、PL-17、PL-18。

大多数细菌所产的褐藻酸裂解酶属于PL-5与PL-7家族，两种外切型褐藻酸裂解酶A1-IV （来源于鞘脂单胞菌）以及Atu3025（来源于根瘤农杆菌）被归类为PL-15家族。

依据基因克隆及测序分析，PL-5与PL-7序列的相似性得到了对比。

基因序列的对比揭示了PL-5与PL-7序列的相似性相对较低。

然而，精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、酪氨酸等对催化作用的有重要影响的氨基酸在酶的活性中心大量存在。

A1-Ⅲ、A1-Ⅱ、AL Y-1、Atu3025的三维结构已通过X射线衍射晶体分析技术探明。

来源于鞘脂单胞菌的A1-Ⅲ酶包含351个氨基酸残基。

该酶具有PG特异性。

在研究该酶的三维结构时发现，其结构几乎全部有α-螺旋以及一个位于（α-α）6-管道部位的通道式缝隙组成。

这种（α-α）6-管道结构的特征与在葡萄糖淀粉酶和纤维素酶中发现的结构类似。

与A1-Ⅲ相比，PL-7家族的褐藻酸裂解酶含有大量的β-串联并在β-折叠区有一个深的缝隙。

这种折叠与β-葡聚糖酶中的类似。

来源于鞘脂单胞菌的A1-Ⅱ被进一步进行了突变分析，与ALY-1相似，A1-Ⅱ也有大量的夹层状的β-折叠，这些氢键网络与在活性中心的三个毗连的β-折叠形成的结合部分已被证明对控制酶的活性具有重要作用。

通过定点突变技术，发现在褐藻酸裂解酶A1-Ⅲ、A1-Ⅱ、AL Y-1的催化位点上，酪氨酸、组氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺、精氨酸的含量很高。

据推测，这些氨基酸形成了酶的催化活性中心。

最近，PL-15家族的外切型褐藻酸裂解酶Atu3025的结构已被查明。

Atu3025可从分子外部降解褐藻胶、低聚糖形成不饱和单糖。

Atu3025含有一个（α-α）6-管状的结构中心，反向平行的β-折叠层作为其基本支架。

一个长度较短的α-螺旋位于管道结构上。

在中心结构域与C端结构域连接处的一个构象变化被证明对于外切降解作用非常重要。

图3 PL-5与PL-7褐藻酸裂解酶的多序列对比。

红框表示位于活性位点的重要氨基酸，如精氨酸、天冬酰胺/谷氨酰胺、组氨酸和酪氨酸。

图4来源于铜绿假单胞菌的褐藻酸裂解酶A1-III、A1-II的三维结构以及与三糖底物结合的活性位点。

A1-III结构几乎全部有α-螺旋以及一个位于（α-α）6-管道部位的通道式缝隙组成。

但是A1-II含有大量的β-串联并在夹层状的β-折叠区有一个深的缝隙。

两者的活性中心都含有酪氨酸、组氨酸、天冬酰胺及精氨酸。

其蛋白结构已被Phyton Molecular Viewer显示出来。

3.3 褐藻酸裂解酶的性质褐藻酸裂解酶具有不同的底物特异性，其底物特异性被酶分子的氨基酸序列以及底物中单糖的排布所决定。

褐藻胶有四种不同的类型连接构成，分别是M-M、M-G、G-G、G-M，每种连接方式都可具有不同的长度。

褐藻酸裂解酶可以根据他们的底物特异性分类。

PG特异性的裂解酶优先降解PG结构，而PM 特异性的裂解酶优先降解PM结构。

一些褐藻酸裂解酶已被证实具有PMG特异性。

迄今为止，大多数的褐藻酸裂解酶表现出PM特异性。

虽然褐藻酸裂解酶可被归类为PG裂解酶、PM裂解酶、PMG裂解酶，但他们通常对另一种糖醛酸聚合物表现出较低的活性。

一些褐藻酸裂解酶表现出PM、PG双重活性。

从酶切方式上来看，褐藻酸裂解酶可分为内切型酶与外切型酶。

多数褐藻酸裂解酶具有内切酶活性。

最近，一些外切型褐藻酸裂解酶的例子已被报道并表征。

各类褐藻酸裂解酶的催化中心已被分析，一种可能的催化机理也已被提出。

第一步，羧基上的负电荷被精氨酸与天冬酰胺所中和。

接下来，C5上的质子经氨基酸残基通过自由基催化机制分离出来。

结果是氨基酸增加了二价羧基盐阴离子的稳定性。

最后一步，酪氨酸提供的一个质子在C4与C5之间形成双键，糖苷键断裂，形成具有非还原末端的寡糖链中的不饱和单糖。