动物疫病监测(诊断)基础理论知识和方法原理

凝集试验
定义：细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在
胶乳、白陶土和红细胞的抗原，与相立抗体结 合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，
形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验。凝 集反应中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
分类：凝集试验可根据抗原的性质、反应的方
式分为直接凝集试验 (简称凝集试验)和间接 凝集试验。
用特异性抗体致敏载体以检测标本中的 相应抗原。
载体颗粒
抗体
可溶性抗原
间接凝集抑制反应
诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体， 用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗 原。也可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为 诊断试剂，以检测标本中的抗体，此称反向间 接凝集抑制反应。
协同凝集反应
与间接凝集反应的原理相似，只是所用载体既 非天然的红细胞，也非人工合成的聚合物颗粒， 而是一种金黄色葡萄球菌。
病毒 + 鸡RBC = 凝集（血凝试验）
病毒 + 特异性抗体 +鸡RBC = 不凝集（血凝抑制试验）
沉淀试验
定义：可溶性抗原 (如细菌的外毒素、内毒素、
病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等)与 相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉
眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验 。参与沉 淀试验的抗原称沉淀原，抗体称为沉淀素。
②、试管凝集试验
为一种定量试验方法： 常用已知抗原液与一系列稀释的受检血清
混合，保温后观察每管内抗原凝集程度。以 产生50%凝集的最高稀释度作为血清中抗体 的效价（亦称为凝集价或滴度）。
二、间接凝集试验
将可溶性抗原 (或抗体)先吸附于一种与免疫无 关的、一定大小的不溶性颗粒 (统称为载体颗 粒)的表面，然后与相应抗体 (或抗原)作用，在 有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性 凝集反应称为间接凝集反应。
在采取临床标本及病人血清应注意病 程，必须采取患畜急性期血清与恢复 期血清 (双份血清) 进行血清学试验。 若第二次血清抗体滴度比第一次高出 4倍以上时，才有诊断意义。
免疫的定义
现代免疫的概念：是机体识别“自身”与 “非己”抗原，对“非己”抗原产生排斥 作用，对自身抗原形成天然耐受的一种生 理功能。
的免疫，也称获得性/特异性免疫。 包括：体液免疫、细胞免疫。
抗原
抗原（Antigen，Ag）：是指进入动物机体后， 能刺激机体产生特异性免疫球蛋白或致敏淋巴 细胞，并能与其发生特异性反应的物质，也就 是说具有抗原性的物质称抗原。
抗原性包括两个方面： 1.免疫原性：能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细
分泌型IgA的合成和主要作用部位在黏膜。
IgD
血清IgD含量极低。 膜性 IgD存在于成熟B细胞表面，因
此，它是成熟B细胞的主要标志。它 也是B细胞抗原受体（BCR）。
IgE
血清中含量最低的抗体。 能与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的
IgE-Fc受体结合，介导Ⅰ型超敏反 应。 与抗寄生虫感染有关。
免疫功能亢进
变态反应
免疫功能低下或缺陷
机会感染
2. 自身稳定
清除机体产生的大量衰老死亡细胞
功能异常
自身免疫病
3. 免疫监视
肿瘤细胞的发现和清除
功能低下或失调
肿瘤发生
免疫的类型
一、固有免疫： 概念：出生时即有的天然免疫，经遗传获得，非特
异性，也称非特异性/先天性免疫。 组成：屏障结构、吞噬细胞、某些体液因子。 二、适应性免疫： 概念：出生后接触特定抗原获得的针对该物质
分类：沉淀反应可在液体中进行，也可在半固
体琼脂凝胶中进行。
液相内沉淀反应
絮状沉淀反应
环状沉淀反应
抗血清 抗原
抗原 抗体
+－
+－
凝胶内沉淀反应
免疫扩散技术
免疫电泳技术
单向扩散试验 双向扩散试验
火箭电泳 对流电泳 免疫电泳
琼扩试验
(Agar gel precipitation test, AGP)
一、直接凝集试验
细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电 解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。
直接凝集试验分为：玻板凝集试验和试管凝集 试验。
① 玻板凝集试验
为一种定性试验方法： 将含有已知抗体的诊断血清 (适当稀释)与待
检菌悬液各一滴在玻片上混合，数分钟后，如 出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。此法 简便、快速，常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定。 也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中 是否存在相应抗体，如布氏杆菌的玻板凝集反 应和鸡白痢全血平板凝集试验。
①.用已知血清检测病毒——鉴定病毒，诊断病毒病。 ②.用已知病毒检测血清抗体——诊断病毒感染，测定病毒免疫
血清效价（中和价）。
补体结合试验
1. 定义：有补体参与，以绵羊红细胞和溶血素作指示系统的抗原抗 体反应。
2. 组成：有2个系统共5种成分 1) 检测系统：包括已知抗原(或抗体)和待测抗体(或抗原) 2) 指示系统：包括绵羊红细胞和溶血素(绵羊红细胞的特异性抗体) 3) 补体：取自豚鼠的新鲜血清 3. 补体结合反应的基本原理 1) 补体可与任何抗原抗体复合物相结合； 2) 指示系统遇补体后就出现明显的溶血反应。
动物疫病监测（诊断）基础理 论知识和方法原理
细菌感染的诊断
触片染色镜检 病理变化 临床症状
流行病学调查
初步诊断
培养特性 生化特性
确诊
血清学试验 动物回归试验
病毒感染的诊断
标本采集与送检 病毒的分离鉴定 电镜技术 血清学试验 分子生物学技术
病毒的分离
动物接种
是最原始的病毒培养方法，根据病毒 种类不同，选择敏感动物及适宜接种 部位，如嗜 神经性病毒（狂犬病毒） 可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于 家兔角膜或皮内。
补体结合反应
Ag
补体
Ab
红细胞
溶血素
溶血 （-）
Ag
补体
红细胞
不溶血 （+）
Ab
溶血素
标记免疫技术
一、按测定用途分类：
免疫组化技术：用于组织切片或其他标本中Ag或Ab的定位。 免疫测定技术：用于液体标本中Ag或Ab的测定。
二、按标记物分类： 免疫酶技术 免疫荧光技术 放射免疫测定 免疫胶体金技术 化学发光免疫测定
IgM水平可用于传染病的早期诊断。 IgM是B细胞抗原受体的主要成分。 也可参与II、III型超敏反应。
IgA
分为血清型和分泌型两种，血清型IgA主要由肠系 膜淋巴组织中的浆细胞产生。而分泌型IgA(SIgA) 是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等处的固有层 中浆细胞产生。
主要存在于初乳、唾液、泪液，以及呼吸道消化 道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。
IgG1、IgG2和IgG3的CH2能通过经典途径激 活补体
IgG是唯一能通过胎盘的抗体 通过Fc段与吞噬细胞表面FcR结合，发挥调
理作用；与K细胞结合，发挥ADCC作用；与 葡萄球菌A蛋白结合。 具有抗菌、抗毒和抗病毒作用 参与II、III型超敏反应
IgM
为五聚体，是分子量最大的Ig。 IgM激活补体能力比IgG强。 IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，故检测
胞的特性。 2.反应原性：能与由其所诱导产生的抗体或致敏
淋巴细胞发生反应的特性。
抗体
免疫球蛋白：是指具有抗体活性或化 学结构与抗体相似的球蛋白。
抗体：当动物机体受到抗原物质刺激 后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生 的能与相应抗原发生特异性结合反应 的免疫球蛋白。
IgG
IgG多为单体，占血清免疫球蛋白总量的 75%～80%
表面性与可逆性
抗原抗体结合除了空间结构互补外，主 要以氢键、静电引力、范德华力和疏水 键等非共价结合。
Ag+血清(Ab) pH 7.0 T 37℃ Ag-Ab复合物 pH＜3 T＞60℃
适合比例性
Ag和Ab结合需要适当的比例，Ag或Ab过多过 少，都不能形成大的Ag-Ab复合物。
网 格 Ab 过剩 学 说
① 它的菌体细胞壁中含有A蛋白(SPA) ② SPA具有与IgG的Fc段结合的特性
因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成 为抗体致敏的颗粒载体；如与相应抗原接触， 即出现反向间接凝集反应。
适用于细菌和病毒等的直接检测。
病毒的血凝与血凝抑制试验
基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝 集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现 象，可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异 性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这 种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试 验。
根据所用载体分： ①. 乳胶凝集试验 ②. 炭素凝集试验 ③. 间接血凝试验
根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝集反应的方式分：
①．正向间接凝集反应
③．间接凝集抑制反应
②．反向间接凝集反应
④．协同凝集反应
正百度文库间接凝集反应
用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体
载体颗粒
可溶性抗原
抗体（凝集素）
反向间接凝集反应
Ag 过剩
比例适当，交联成网络
影响抗原抗体反应的因素
电解质：稀释抗原、血清常用生理盐水，但 稀释禽类血清时常用8～10%高渗盐水。
酸碱度：稀释抗原、血清的溶液pH6.0～8.0 均可以，为了稳定pH，在抗原抗体反应中最 好用pH7.0～7.2的磷酸缓冲液作抗原抗体稀 释液。
温度：通常为37℃，适当提高反应温度可增 加Ag与Ab分子的碰撞机会，加速反应的出现
病毒的分离
鸡胚培养
鸡胚对多种病毒敏感。一般采用孵 化9-14天的鸡胚，根据病毒种类不同， 将病毒标本接种于鸡胚的不同部位， 最常用的鸡胚接种部位有羊膜腔、 尿囊腔、绒毛尿囊膜和卵黄囊等。
病毒的分离
组织培养法或细胞培养法
是将离体活组织块或分散的组织细胞 加以培养的技术总称，为病毒分离鉴 定中的最常用的基本方法。
①琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，l%
琼脂凝胶的孔径约为85nm，因此可允许各 种抗原抗体在琼脂凝胶中自由扩散。
②Ag和Ab在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处
结合成Ag-Ab复合物，此复合物因颗粒较大 而不能扩散，故形成沉淀带。
中和试验(病毒、毒素中和试验)
原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易感 动物、易感鸡胚或鸭胚、易感细胞的活性。 用途：
形态学检查
电镜和免疫电镜检查 普通光学显微镜检查 有些病毒在宿主细胞内增殖后，在细胞 的一定部位(胞核、胞浆或两者兼有)出 现一个或数个、圆形或椭圆形、嗜酸性 或嗜碱性的结构，即包涵体。包涵体对 病毒感染的诊断有一定价值。
病毒感染的血清学诊断
是用已知病毒抗原来检测病畜血清中 有无相应抗体，故须待病畜感染后体 内产生抗体时才能检出。
人工制备抗体
单克隆抗体——由一个B细胞分化增值的 子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原 决定簇（表位）的抗体。
多克隆抗体——采用传统的免疫方法，将 抗原物质经过不同途径注入动物体内，经 数次免疫后采血所获得的抗血清即为多克 隆抗体。
免疫学试验技术
血清学试验的类型
血清学反应的特点
1. 特异性与交叉反应性 2. 可逆性：表面的结合，有可逆性 3. 适比性：比例合适，反应才可见 4. 阶段性：不可见 可见反应 5. 条件依赖性：pH，温度，电解质
H2O
2
3,3’二氨基联苯胺 （DAB）
可溶性供氢体：
邻苯二胺（OPD）
碱性磷酸酶(AP) 硝基苯磷酸盐（p-NPP）
反应颜色 黄褐色 橙黄色 黄色
葡萄糖氧化酶
与HRP类似
棕色
酶联免疫吸附测定
一、基本原理
①、使Ag或Ab吸附到固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②、使Ag或Ab与某种酶连接成酶标Ag或Ab，酶标Ag或Ab既保 留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③、测定时，把受检标本(测定其中的Ab或Ag)和酶标Ag(或Ab) 按不同的步骤与固相载体表面的Ab (或Ag)起反应。 ④、通过洗涤将固相载体上未结合的Ag或Ab去除，最后结合在 固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ⑤、加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。
免疫的基本特性
1 识别自身和非自身 这是免疫应答的基础
免疫细胞膜表面的抗原受体+外来抗原的表位 识别很精细，包括异种之间，同种不同个体之间
2 特异性
即免疫具有很强的针对性
3 免疫记忆
对相同抗原物质的再次进入具有记忆，会产生更 快、更强的免疫应答。
免疫的基本功能
1. 抵抗感染
指动物机体抵御病原微生物感染和侵袭的能力。
免疫酶技术
原理
1. Ag-Ab反应的特异性和敏感性 2. 酶促反应的高效催化性和敏感性
将酶分子与Ab或Ag分子连 接形成稳定的结合物
（酶标抗体或酶标抗原）
不影响： • Ab或Ag的免疫活 性 • 酶的活性
常用的酶与底物
DH2+H2O2 HRP D+2H20
常用酶
常用底物
不溶性供氢体：
辣根过氧化物酶 (HRP)