紫外可见分光光度法.
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紫外可见分光光度法
得单色光聚焦至出射狭
缝； ⑤出射狭缝。
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3.样品室
样品室放置各种类型的吸收池 （比色皿）和相应的池架附件。 在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。 注意：用作盛空白溶液的比色皿与盛试样溶液的比色皿应 互相匹配，即有相同的厚度与相同的透光性。为了减少反射损 失，比色皿的光学面必须完全垂直于光束方向。 不能用手指拿比色皿杯的光学面，用后要及时洗涤，可用 温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过 15分 钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。
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Hale Waihona Puke 20紫外可见分光光度的使用
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721分光光度计操作步骤
1.预热仪器。为使测定稳定，将电源开关打开，使仪器预热20min， 为了防止光电管疲劳，不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比 色皿暗箱盖打开，使光路切断。 2.选定波长。根据实验要求，转动波长调节器，使指针指示所需要 的单色光波长。 3.固定灵敏度档。旋动灵敏度档，使其固定于某一档，在实验过程 中不再变动。一般测量固定在“1”档。 4.调节“0”点。轻轻旋动调“0”电位器，使读数表头指针恰好位于透 光度为“0”处（此时，比色皿暗箱盖是打开的，光路被切断，光电 管不受光照）。 5.调“0”和调“100％”。比色皿中装入参比溶液近4/5,放入比色皿座 架的第一格内，其它格内放入样品或标样，把比色皿暗箱盖子轻轻 盖上，用参比溶液重复调“0”和“100%”,至仪器稳定。 6.测定。轻轻拉动比色皿座架拉杆，使样品或标样溶液进入光路， 此时表头指针所示为该溶液的吸光度A。读数后，打开比色皿暗箱 盖。 7.关机。实验完毕，整理仪器，切断电源。将比色皿取出洗净，并 将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。
紫外可见分光光度法
波长和颜色的关系
λ（nm） 400-450 450-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-610 610-650 650-760
颜色 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
互补光 黄绿 黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
二、物质对光的选择性吸收
1、物质对光的吸收的本质
定性分析： 1、与标准品或标准图谱对比，鉴定未知物； 2、鉴别异构体 如：顺反异构、互变异构（如酮-烯醇式） 3、纯度检查
定量分析： 1、单一组分测定 2、多组分同时测定
第二节 紫外可见分光光度计
一、紫外可见分光光度计的构造
光源
单色器 吸收池
检测 系统
信号显 示系统
（一）光源
1、作用：提供符合要求的入射光。
3、分类： （1）可见光光源：
①钨丝灯：是最常见的可见光光源，它可发射波长 为325-2500nm范围的连续光谱，其中最适宜的使 用范围是320-1000nm，除用作可见光源外，还可 用作近红外光源。
②卤钨灯
在钨丝中加入适量的卤化物或卤素，灯泡用石 英制成，具有较长的寿命和高的发光效率。
（2） 紫外光光源： 多为气体放电光源，其中应用最多的是氢灯和
➢ 以光的衍射现象和干涉现象为基础（平面反射光栅和平面 凹面光栅）Βιβλιοθήκη （三）吸收池（又称比色皿）
1、作用：盛装被测溶液和参比溶液。 2、分类： （1）玻璃比色皿：适用于可见光区。（能否用于紫 外光区？） （2）石英比色皿：适用于紫外及可见光区。
3、主要规格： 0.5cm、1.0cm、2.0cm、3.0cm等。
紫外可见分光光度计基本组成
钨灯卤素 灯或氘灯
棱镜或光 栅，玻璃 或石英
第四章紫外-可见分光光度法
3. 红移和紫移：吸收带的最大吸收波长发生移动， 向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为 紫移。
（三）有机化合物的紫外、可见光谱
1. 饱和烃及其取代衍生物 σ→σ*、n→σ* 2. 不饱和烃及共轭烯烃 σ→σ*、π→π* 3. 羰基化合物 n→σ*、π→π*和n→π* 4. 苯及其衍生物 E1带、 E2带、 B带 5. 稠环和杂环
当l以cm，c以mol/L为单位时，k称为摩尔吸 光系数，用ε表示，它比a更为常用，ε的单位 为L mol-1 cm-1，即： A = ε c l
当l以cm，c以百分浓度g/100mL为单位时，k 称为比吸光系数，用A1cm1%表示 ε = 0.1 M A1cm1%
用比吸光系数的表示方法特别适用于摩尔质 量未知的化合物。
（二）配位场跃迁
1. f-f跃迁
镧系和铜系元素的离子对紫外和可见光的吸收是 基于内层f电子跃迁而产生的，其吸收光谱是由一些狭 窄的特征吸收峰组成，且这些吸收峰不易受金属离子 所处的配位环境的影响。
2. d-d跃迁
过渡金属离子的d轨道在受到配位体场的作用时 产生分裂。d电子在能级不同的d轨道间跃迁，吸收紫 外或可见光产生吸收光谱。这种光谱的吸收带比较 宽，吸收峰强烈地受配位环境的影响。
光。
3. 吸收池
功能：盛放分析试样（一般是液体）
4. 检测器 功能：检测光信号，测量单色光透过溶
液后光强度变化的一种装置。 5. 信号显示系统
6. 紫外一可见分光光度计的类型
(1) 单波长单光束分光光度计
缺点：测量结果受电源波动的影响较大， 误差较大。
(2) 单波长双光束分光光度计
一个环外双键
5nm
同环二烯 39nm 一个β烷基 12nm 三个γ+烷基 54nm
（三）有机化合物的紫外、可见光谱
1. 饱和烃及其取代衍生物 σ→σ*、n→σ* 2. 不饱和烃及共轭烯烃 σ→σ*、π→π* 3. 羰基化合物 n→σ*、π→π*和n→π* 4. 苯及其衍生物 E1带、 E2带、 B带 5. 稠环和杂环
当l以cm，c以mol/L为单位时，k称为摩尔吸 光系数，用ε表示，它比a更为常用，ε的单位 为L mol-1 cm-1，即： A = ε c l
当l以cm，c以百分浓度g/100mL为单位时，k 称为比吸光系数，用A1cm1%表示 ε = 0.1 M A1cm1%
用比吸光系数的表示方法特别适用于摩尔质 量未知的化合物。
（二）配位场跃迁
1. f-f跃迁
镧系和铜系元素的离子对紫外和可见光的吸收是 基于内层f电子跃迁而产生的，其吸收光谱是由一些狭 窄的特征吸收峰组成，且这些吸收峰不易受金属离子 所处的配位环境的影响。
2. d-d跃迁
过渡金属离子的d轨道在受到配位体场的作用时 产生分裂。d电子在能级不同的d轨道间跃迁，吸收紫 外或可见光产生吸收光谱。这种光谱的吸收带比较 宽，吸收峰强烈地受配位环境的影响。
光。
3. 吸收池
功能：盛放分析试样（一般是液体）
4. 检测器 功能：检测光信号，测量单色光透过溶
液后光强度变化的一种装置。 5. 信号显示系统
6. 紫外一可见分光光度计的类型
(1) 单波长单光束分光光度计
缺点：测量结果受电源波动的影响较大， 误差较大。
(2) 单波长双光束分光光度计
一个环外双键
5nm
同环二烯 39nm 一个β烷基 12nm 三个γ+烷基 54nm
紫外可见分光光度法
第三节 紫外-可见分光光度计
二、紫外-可见分光光度计的光学性能
1．测光方式 3．狭缝或光谱带宽 5．波长准确度 7．波长重复性 9．光度重复性
2．波长范围 4．杂散光 6．吸光度范围 8．测光准确度 10．分辨率
第三节 紫外-可见分光光度计
三、紫外-可见分光光度计的类型 1.可见分光光度计 721型
大吸收波长。 3.能够绘制标准曲线，并能应用标准曲线对样品
进行定量分析。 4.会使用常见的紫外-可见分光光度计测定溶液的
吸光度。
案例导入
在夏天参加户外活动时，如果天气晴朗，就应该注 意保护皮肤，否则，暴露在火辣辣太阳之下的皮肤， 数小时后就会出现红肿、瘙痒、发热、刺痛症状，数 日后出现蜕皮现象，这表明太阳光中有一种光线能伤 害生物细胞。科学家研究证实，这种光线是紫外线。
（Cd的原子量为112）的浓度为140μg/L， 在λ＝525nm波长处，用L＝1cm的吸收池，
测得吸光度A＝0.220，试计算摩尔吸光系数
和百分吸收系数。
第二节 紫外-可见分光光度法的基本原理
课堂互动
某有色溶液的物质的量浓度浓度为c，在一定条件下用 1cm比色杯测得吸光度为A，则摩尔吸光系数应为： A．cA B．cM C．A/C D．C/A
仪器简单
操作简便
价格低廉
测定快速
第一节 概述
课堂活动
1．紫外-可见光的波长范围是
A．200~400nm
B．400~760nm
C．200~760nm 2．下列叙述错误的是
D．360~800nm
A．光的能量与其波长成反比
B．有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈
C．物质对光的吸收有选择性
D．光的能量与其频率成反比
紫外可见分光光度法
E— 吸光系数(absorptivity)
T与A的关系
T 100% 50% 25% 10% 1.0% 0.1% 0.01% 0.001% 0%
A 0 0.301 0.602 1.00 2.0 3.0 4.0
5.0
上述说明： T值为0％至100％内的任何值。 A值可以取任意的正数值。
入射光强度 I0
等 条件一定时， E 仅与吸收物质本身的性质有关， 与待测物浓度无关； （3）同一吸收物质在不同波长下的E 值是不同的。在最大 吸收波长λmax处的摩尔吸收系数E max表明了该 吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法 测定该物质可能达到的最大灵敏度。
（4）可作为定性鉴定的参数；
（5）物质的吸光能力的度量
? EK2带
B带 R带
苯乙酮的紫外吸收光谱
四、影响吸收带的因素
• 位阻影响 • 跨环效应
共轭系统共平面性↓→共轭效应↓ → max ↓（短移）， ↓
• 溶剂效应 溶剂极性↑→ K带长移，R带短移
• pH影响
max 210.5nm,270nm
235nm,287nm
位阻影响
顺式
反式
二苯乙烯顺反异构体 的紫外吸收光谱
最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax。 吸收曲线的形状、λmax及吸收强度等与分子 的结构密切相关。
在吸收曲线上，最大吸收峰所对应的是最大吸收波长 （λmax），为不同化合物的特征波长。吸收曲线的形状是物 质定性的主要依据，在定量分析中可提供测定波长，一般以灵 敏度较大的λmax为测定波长。
峰与峰之间的部位叫谷，该处对应波长为最小吸收波长。 在图谱短波端只呈现强吸收但不成峰的部分称为末端吸收 （end absorption）。
T与A的关系
T 100% 50% 25% 10% 1.0% 0.1% 0.01% 0.001% 0%
A 0 0.301 0.602 1.00 2.0 3.0 4.0
5.0
上述说明： T值为0％至100％内的任何值。 A值可以取任意的正数值。
入射光强度 I0
等 条件一定时， E 仅与吸收物质本身的性质有关， 与待测物浓度无关； （3）同一吸收物质在不同波长下的E 值是不同的。在最大 吸收波长λmax处的摩尔吸收系数E max表明了该 吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法 测定该物质可能达到的最大灵敏度。
（4）可作为定性鉴定的参数；
（5）物质的吸光能力的度量
? EK2带
B带 R带
苯乙酮的紫外吸收光谱
四、影响吸收带的因素
• 位阻影响 • 跨环效应
共轭系统共平面性↓→共轭效应↓ → max ↓（短移）， ↓
• 溶剂效应 溶剂极性↑→ K带长移，R带短移
• pH影响
max 210.5nm,270nm
235nm,287nm
位阻影响
顺式
反式
二苯乙烯顺反异构体 的紫外吸收光谱
最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax。 吸收曲线的形状、λmax及吸收强度等与分子 的结构密切相关。
在吸收曲线上，最大吸收峰所对应的是最大吸收波长 （λmax），为不同化合物的特征波长。吸收曲线的形状是物 质定性的主要依据，在定量分析中可提供测定波长，一般以灵 敏度较大的λmax为测定波长。
峰与峰之间的部位叫谷，该处对应波长为最小吸收波长。 在图谱短波端只呈现强吸收但不成峰的部分称为末端吸收 （end absorption）。
紫外可见光分光光度法
紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。
当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。
因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。
从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。
物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。
因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。
用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
紫外-可见分光光度法
单色器质量的优劣，主要决定于 色散元件的质量。色散元件常用棱镜 和光栅。
3 吸收池
吸收池又称比色皿或比色杯，按材 料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前 者不能用于紫外区。 吸收池的种类很多，其光径可在 0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池 最为常用。
4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光 信号转变为电信号。现今使用的分光光度 计大多采用光电管或光电倍增管作为检测 器。 5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计， 电位调节指零装置，以及自动记录和数用 基本结构:
光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统 ↑ 样品
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光 源有两类：热辐射光源和气体放电光源
热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。
2 单色器
单色器的主要组成：入射狭缝、出射 狭缝、色散元件和准直镜等部分。
4 要点与注意事项 4.1 开机前将样品室内的干燥剂取出， 仪器自检过程中禁止打开样品室盖。 4.2 比色皿内溶液以皿高的2/3～4/5为 宜，不可过满以防液体溢出腐蚀仪器。 测定时应保持比色皿清洁，池壁上液 滴应用滤纸擦干，切勿用手捏透光面。 测定紫外波长时，需选用石英比色皿。
4.3 测定时，禁止将试剂或液体物质放在 仪器的表面上，如有溶液溢出或其它原因 将样品槽弄脏，要尽可能及时清理干净。 4.4 如果仪器不能初始化，关机重启。 4.5 如果吸收值异常，依次检查：波长设 置是否正确（重新调整波长，并重新调 零）、测量时是否调零（如被误操作，重 新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波 段时，要用石英比色皿）、样品准备是否 有误（如有误，重新准备样品）。
2.1.2 按数字[1]键进入%T/ABS（透过率/吸 光度测定）子菜单，选中对应的数字键来 设定测定条件：①NUM WL(设定测试波长 的数目，最多可设定6个不同波长)；②WL Setting （设定测试波长具体数值）③ Data Mode( 选择测定吸光度或透光率 ) ，设定完 毕后点击 [Enter] 键确定，所有项目设定完 毕后按数字[0] 键确定，等待仪器调整至准 备状态。
第二章 紫外-可见分光光度法
1、光源
作用：供给符合要求的入射光。 （1）可见光光源 常见的可见光光源有：钨丝灯和卤钨灯。 （2）紫外光光源 常见的紫外光光源有：氢灯和氘灯。 •另外，为了使光源发出的光在测量时稳定，光 源的供电一般都要用稳压电源，即加有一个稳 压器。
2、单色器
作用：把光源发出的连续光谱分解成单色光，并 能准确方便地“取出”所需要的某一波长的光， 它是分光光度计的心脏部分。 组成：单色器一般由狭缝、色散元件（棱镜和光 栅）、透镜系统组成。 （1）棱镜单色器 •玻璃棱镜：可吸收紫外光，只能用于可见光区域。 •石英棱镜：用于紫外、可见和近红外三个光区域。 （2）光栅单色器 •可用于紫外、可见及红外光区域，目前生产的紫外可见分光光度计大多采用光栅作为色散元件。
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
四、分光光度计的维护 1、仪器对工作环境的要求
•稳固、温度15～28℃、干燥、无腐蚀性气体、 光线不宜过强
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
2、紫外-可见分光光度计——双光束
•/vlabcq/flash/分光光度计/分光光度 计.html
二、紫外-可见分光光度计的类型及特点 1、按使用的波长范围分
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
紫外可见分光光度法
模块二
紫外－可见分光光度法
第一节 紫外-可见吸收光谱 第二节 朗伯-比尔定律 第三节 紫外－可见分光光度计 第四节 分析条件的选择
第五节 测定方法
概
述
紫外可见分光光度法(Ultraviolet-Visible Spectrophotometry)，又称:紫外-可见分子 吸收光谱法(Ultraviolet-Visible Molecular Absorption Spectrometry)是利用被测物质 对光的吸收特征和吸收强度对物质进行定 量和定性的分析方法。
形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；
在样品的吸收光谱区无明显吸收；
如果要与标准品的吸收光谱相比较，须用相同的溶剂。
5．pH值的影响
很多化合物都具有酸性或碱性可解离基团，在不同 pH的溶液中，分子的解离形式可能发生改变，其 吸收光谱的形状、λmax和吸收强度可能不一样。
OH O-
OHH+
λmax 210.5nm ,270nm
完全透过
无色
吸收黄色光
2014-12-23
蓝色
13
课堂互动
1．紫外-可见光的波长范围是 A．200~400nm B．400~780nm C．200~780nm D．360~800nm 2．下列叙述错误的是 A．光的能量与其波长成反比 B．有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈 C．物质对光的吸收有选择性 D．光的能量与其频率成反比
2mg/ml的溶液，在1cm吸收池中，于310nm处测
定吸光度A。规定A≤0.05。
(三)、结构分析
有机化合物的紫外吸收光谱 可以推定分子骨架，判断发色团之间的共轭关系
和估计共轭体系中取代基的种类、位置和数目 。
1.饱和碳氢化合物 只产生ơ→ơ*跃迁，所需能量很大， 200－400nm没有吸收，常作为溶剂。
紫外－可见分光光度法
第一节 紫外-可见吸收光谱 第二节 朗伯-比尔定律 第三节 紫外－可见分光光度计 第四节 分析条件的选择
第五节 测定方法
概
述
紫外可见分光光度法(Ultraviolet-Visible Spectrophotometry)，又称:紫外-可见分子 吸收光谱法(Ultraviolet-Visible Molecular Absorption Spectrometry)是利用被测物质 对光的吸收特征和吸收强度对物质进行定 量和定性的分析方法。
形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；
在样品的吸收光谱区无明显吸收；
如果要与标准品的吸收光谱相比较，须用相同的溶剂。
5．pH值的影响
很多化合物都具有酸性或碱性可解离基团，在不同 pH的溶液中，分子的解离形式可能发生改变，其 吸收光谱的形状、λmax和吸收强度可能不一样。
OH O-
OHH+
λmax 210.5nm ,270nm
完全透过
无色
吸收黄色光
2014-12-23
蓝色
13
课堂互动
1．紫外-可见光的波长范围是 A．200~400nm B．400~780nm C．200~780nm D．360~800nm 2．下列叙述错误的是 A．光的能量与其波长成反比 B．有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈 C．物质对光的吸收有选择性 D．光的能量与其频率成反比
2mg/ml的溶液，在1cm吸收池中，于310nm处测
定吸光度A。规定A≤0.05。
(三)、结构分析
有机化合物的紫外吸收光谱 可以推定分子骨架，判断发色团之间的共轭关系
和估计共轭体系中取代基的种类、位置和数目 。
1.饱和碳氢化合物 只产生ơ→ơ*跃迁，所需能量很大， 200－400nm没有吸收，常作为溶剂。
4紫外-可见分光光度法
在进行光度测量时，调节仪器的零点，消除由于吸收池壁及溶剂对 入射光的反射和吸收带来的误差，有时还可以扣除干扰的影响
• 2.参比溶液的选择原则：
• (1)溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂 不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；
• (2) 试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反 应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。
紫外-可见分光光度法
紫外-可见分光光度法
一、紫外-可见分光光度法原理 二、紫外-可见分光光度计 三、紫外-可见分光光度法应用
紫外-可见分光光度法
分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和：
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
电子能级间隔比振动能级和转 动能级间隔大1~2个数量级， 在发生电子能级跃迁时，伴有 振-转能级的跃迁，形成所谓的 带状光谱。
第一节 基本原理
二 Lambert- Beer 定律
Lambert-Beer 定律适用范围： ①入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。 ②均匀、无散射溶液、固体、气体。
吸光度具有加和性：
不仅适用于紫外光、可见光，也适用红外光；在同一波长下， 各组分吸光度具有加和性
A=A1+A2++An
（1）入射光必须为单色光 （2）被测样品必须是均匀介质 （3）在吸收过程中吸收物质之间不能发生相
偏离Lambert-Beer 定律的因素 1. 样品性质影响
1）待测物高浓度--吸收质点间隔变小—质点间相互作用—对特定辐射的吸收 能力发生变化--- 变化；
2）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响； 3）被测溶液不均匀导致的偏离
第一节 基本原理
二 Lambert- Beer 定律
• 2.参比溶液的选择原则：
• (1)溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂 不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；
• (2) 试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反 应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。
紫外-可见分光光度法
紫外-可见分光光度法
一、紫外-可见分光光度法原理 二、紫外-可见分光光度计 三、紫外-可见分光光度法应用
紫外-可见分光光度法
分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和：
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
电子能级间隔比振动能级和转 动能级间隔大1~2个数量级， 在发生电子能级跃迁时，伴有 振-转能级的跃迁，形成所谓的 带状光谱。
第一节 基本原理
二 Lambert- Beer 定律
Lambert-Beer 定律适用范围： ①入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。 ②均匀、无散射溶液、固体、气体。
吸光度具有加和性：
不仅适用于紫外光、可见光，也适用红外光；在同一波长下， 各组分吸光度具有加和性
A=A1+A2++An
（1）入射光必须为单色光 （2）被测样品必须是均匀介质 （3）在吸收过程中吸收物质之间不能发生相
偏离Lambert-Beer 定律的因素 1. 样品性质影响
1）待测物高浓度--吸收质点间隔变小—质点间相互作用—对特定辐射的吸收 能力发生变化--- 变化；
2）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响； 3）被测溶液不均匀导致的偏离
第一节 基本原理
二 Lambert- Beer 定律
紫外可见分光光度法
颜色 紫 蓝
绿蓝 蓝绿
绿 黄绿
黄 橙 红
.
互补光 黄绿 黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
16
四、光吸收定律 1、光吸收定律 又叫朗伯—比耳定律。
.
17
光吸收定律： 当一束平行单色光垂直入射通过均 匀、透明的吸光物质的稀溶液时，溶 液对光的吸收程度与溶液的浓度及液 层厚度的乘积成正比。
通式是：A = kbc
.
41
光电管结构如图：
1
2
3
4
1是光电管的阳极；镍环或镍片组成
2是光电管的阴极；由金属片上涂一层
光敏物质（如氧化铯）构成
3为电池； 4为放大.器
42
光电倍增管：它是一个非常灵敏的 光电器件，可以把微弱的光转换成电 流。其灵敏度比前2种都要高得多。它 是利用二次电子发射以放大光电流， 放大倍数可达到108倍。
② 具有鲜明的颜色，ε都很大 （一般可达到104以上），所以
测定的灵敏度很高；
③ 选择性好
④ 有些有色配合物易溶于有机溶
剂，可进行萃取光度分析，提
高了测定的灵敏度和选择性。
.
60
3．常见的有机显色剂： ① 磺基水杨酸： OH
其结构式如下：
SO3H
可用于测定三价铁离子。
COOH
.
61
② 邻二氮菲（邻菲罗啉，1， 10—二氮菲）：
.
21
3 吸光系数的二种表示方法：
k值的单位和大小随着b和c的单位 不同而不同。
.
22
（1）质量吸光系数： 厚度以cm表示，浓度以g/L表示的 吸光系数叫“质量吸光系数”。 用α表示 其单位为L/(cm·g)，此时：
A= α b ρ
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等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。 原理：
利用光通过光栅时 平面透 射光栅 透 镜
光屏
M1
发生衍射和干涉现象而分光.
波长范围宽, 色散均匀, 分辨性能好, 使用方便
M2
光栅衍射示意图
出 射 狭 缝
吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。
可见光区：光学玻璃池（350～3200nm）
MnO4-的吸收光谱
545 1.0 Absorbance 0.8 0.6 0.4 0.2 700 /nm
300
400
500
600
2.吸收光谱 (Absorption Spectra)
S2 h A
S1
S0 分子内电子跃迁
带状光谱
用不同波长的单色光照射，测吸光度— 吸收曲线
紫外可见吸收光谱：分子价电子能级跃迁。电子跃迁的 同时，伴随着振动能级、转动能级的跃迁。带状光谱。
– 应用广泛
12.1 概述
12.2 光度分析方案的设计 12.3 吸光光度法应用简介
12.1 概述
12.1.1 光的基本性质
12.1.2 物质对光的选择性吸收 12.1.3 光吸收的基本定律
12.1.4 分光光度法及其仪器
光的基本性质
光 的 波 粒 二 象 性
波动性
光的折射 光的衍射 光的偏振
10nm~200nm 200~400nm
单色光,复合光
单色光
单一波长的光 由不同波长的光组合而成的光 黄 绿 青 白光
复合光
橙 红
青蓝
互补色
紫
蓝
M + h
M*
M + 热
M + 荧光或磷光
基态 激发态 E1 （△E） E2 物质对光的吸收满足Plank 条件
E E j E0 h
A
最大吸收波长 B max A
物质对光的选择性吸收
max ( A) max ( B)
定性分析基础
A
c
增 大
在一定实验条件下, A∝c
定量分析基础
吸收曲线的讨论：
（1）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间
的ΔΕ所决定，反映了分子内部能级分布状况--定性分析基 础
（2）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比-定量分析基础 Lambert-Beer定律
S= 0.001 103 M
=
M
( g/cm 2 )
例1 邻二氮菲光度法测铁 :(Fe)=1.0mg/L,
b=2cm , A=0.38 ,计算 ，S 和
E
1% 1cm
解： c(Fe)=1.0 mg/L=1.0×10-3 g/L /55.85g/mol
=1.8×10-5mol/L 0.38 4 -1 -1 = = 1.1 10 （ L mol cm ） 2 1.8 10-5
光谱区间
10-2 nm 10 nm
射 线 x 射 线
0.1nm～
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
0.1mm～1m
103 cm
无 线 电 波
105 cm
10nm~
750nm~0.1cm
1m～1000m
可
远紫外
（真空紫外）
见
400～750 nm
光
近紫外
分光光度法
通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.
波长可调, 故选择性好, 准确度高.
光源
单色器
吸收池
检测 系统
仪器
可见分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、分光光度计的主要部件
光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够
的光强度,稳定。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm) 氙灯：紫外、可见光区均可用作光源
常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对
朗伯—比耳定律的偏离。 引起这种偏离的因素（两大类）： （1）物理性因素，即仪器的非理想引起的； （2）化学性因素。
（1）物理性因素 单色光不纯，导致负偏差。 散射光的影响，胶体、乳浊液或悬浊液 由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不 是垂直通过比色皿（非平行入射光）产生正偏差
为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器 此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸 收曲线较平坦处。
(2) 化学性因素
吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生负偏差， 朗伯-比尔定律只适合于稀溶液（C < 10-2 mol/L )。 平衡效应：溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物
强度来进行分析的方法。
分为：吸光光度法，发射光谱法
基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建 立起来的分析方法,叫吸光光度法.包括： 比色法：通过比较有色溶液颜色深浅 分光光度法：根据物质对一定波长的光的吸收程度
依据物质对不同波长范围光的吸收主要有：
真空紫外光度法：10～200 nm（远紫外光）
紫外吸光光度法：200400 nm（近紫外区） 可见吸光光度法：400750 nm 红外光度法：2.51000 m
特点
– 灵敏度高：
测定下限可达10-5～10 -6mol· L-1, 10-4%～10-5%
– 准确度
能够满足微量组分(<1%)的测定要求: Er : 1%～5%
－操光子的能量：
E h
h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J· s
－频率
E－光量子具有的能量
单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)
1eV=1.602×10－19 J
波粒二象性
E h
hc
结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越 长(频率越低)，光量子的能量越低.
S=M/ =55.85/1.1×104=0.0051 (g/cm2)
A= E
1% 1cm
b c
c =1.0mg/L=1.0×10-3 g /1000mL = 1.0×10-4 g/100mL
1% -4 3 -1 1 E1 = 0.38/2.0 10 = 1.9 10 （ 100mL g cm ） cm
I0 1 lg ＝ lgT 2.吸光度 (Absorbance) A lg It T
A, T, C 三 者 的 关 系
1.0
T
100
A T%
50
T = 0.0 %
A
A=∞
T = 100.0 %
0.5
A = 0.0
0
c
0
溶液的T越大,说明对光的吸收越小,浓度低; T越小，溶液对光的吸收越大，浓度高
吸光度的加合性
在多组分体系中如果各吸光物质之间无相互作用这时体系总 的吸光度等于各个吸光物质的吸光度之和。
A＝ Ai
吸光度的测量：
用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液 的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射， 溶剂、试剂对光的吸收等。
3. 光吸收基本定律: Lambert-Beer定律
Sandell(桑德尔)灵敏度 (S)
定义：当产生吸光度为0.001时，单位截面积(1cm2) 的液层内所能检测出的吸光物质的最低含量。 用S表示，单位：g· cm-2
S
S小灵敏度高;
M
相同的物质, M小则灵敏度高.
A= bc=0.001
bc ＝0.001/
变换单位: bcmcmol/L=bcM106 g/1000cm2
hc
物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同， 这就构成了物质对光的选择吸收基础。
1.吸收光与透射光 当复合光照射到物体上时，一部分光被 吸收，而另一部分光则被透射过去。即： 入射光=吸收光＋透射光
吸收光 互补 透射光
光的作用方式
光谱示意
复合光
表观现象示意
完全吸收
完全透过
吸收黄色光
物质的颜色与光的关系
同一种物质不同浓度下，其吸收曲线形状相似λmax不变。 在λmax处吸光度A随浓度变化的幅度最大。所以测定最灵 敏。此特性可作为定量分析时选择入射光波长的重要依据。
1.透光率 (透射比,Transmittance )
入射光强度 I0 透射光强度It
一束平行单色光
透光率定义:
It T I0
T 取值为0.0 % ~ 100.0 % 全部吸收 全部透射 T = 0.0 % T = 100.0 %
光的干涉
粒子性
E
光电效应
波动性
光的传播速度:
c V = = n
c －真空中光速 ：~3.0 ×108m/s
－波长：1m=10-6m, 1nm=10-9m, 1Å=10-10m －频率，单位：赫兹 Hz 次/秒
n －折射率，真空中为1：
= c ； 波数 = 1/ = /c
不同颜色的可见光波长及其互补光
/nm 颜色 紫 蓝 互补光 黄绿 黄 400-450 黄 橙 红 450-480
绿
蓝绿 绿蓝 蓝
黄绿
480-490
490-500 500-560 紫 紫红 560-580 580-610 610-650 650-760
绿蓝
蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
橙
红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
紫外区：石英池玻璃 （185～4000nm）
检测器：利用光电效应，将光能转换成 电流讯号。
光电池，光电管，光电倍增管
检流计（指示器）：
低档仪器：刻度显示 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录
利用光通过光栅时 平面透 射光栅 透 镜
光屏
M1
发生衍射和干涉现象而分光.
波长范围宽, 色散均匀, 分辨性能好, 使用方便
M2
光栅衍射示意图
出 射 狭 缝
吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。
可见光区：光学玻璃池（350～3200nm）
MnO4-的吸收光谱
545 1.0 Absorbance 0.8 0.6 0.4 0.2 700 /nm
300
400
500
600
2.吸收光谱 (Absorption Spectra)
S2 h A
S1
S0 分子内电子跃迁
带状光谱
用不同波长的单色光照射，测吸光度— 吸收曲线
紫外可见吸收光谱：分子价电子能级跃迁。电子跃迁的 同时，伴随着振动能级、转动能级的跃迁。带状光谱。
– 应用广泛
12.1 概述
12.2 光度分析方案的设计 12.3 吸光光度法应用简介
12.1 概述
12.1.1 光的基本性质
12.1.2 物质对光的选择性吸收 12.1.3 光吸收的基本定律
12.1.4 分光光度法及其仪器
光的基本性质
光 的 波 粒 二 象 性
波动性
光的折射 光的衍射 光的偏振
10nm~200nm 200~400nm
单色光,复合光
单色光
单一波长的光 由不同波长的光组合而成的光 黄 绿 青 白光
复合光
橙 红
青蓝
互补色
紫
蓝
M + h
M*
M + 热
M + 荧光或磷光
基态 激发态 E1 （△E） E2 物质对光的吸收满足Plank 条件
E E j E0 h
A
最大吸收波长 B max A
物质对光的选择性吸收
max ( A) max ( B)
定性分析基础
A
c
增 大
在一定实验条件下, A∝c
定量分析基础
吸收曲线的讨论：
（1）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间
的ΔΕ所决定，反映了分子内部能级分布状况--定性分析基 础
（2）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比-定量分析基础 Lambert-Beer定律
S= 0.001 103 M
=
M
( g/cm 2 )
例1 邻二氮菲光度法测铁 :(Fe)=1.0mg/L,
b=2cm , A=0.38 ,计算 ，S 和
E
1% 1cm
解： c(Fe)=1.0 mg/L=1.0×10-3 g/L /55.85g/mol
=1.8×10-5mol/L 0.38 4 -1 -1 = = 1.1 10 （ L mol cm ） 2 1.8 10-5
光谱区间
10-2 nm 10 nm
射 线 x 射 线
0.1nm～
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
0.1mm～1m
103 cm
无 线 电 波
105 cm
10nm~
750nm~0.1cm
1m～1000m
可
远紫外
（真空紫外）
见
400～750 nm
光
近紫外
分光光度法
通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.
波长可调, 故选择性好, 准确度高.
光源
单色器
吸收池
检测 系统
仪器
可见分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、分光光度计的主要部件
光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够
的光强度,稳定。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm) 氙灯：紫外、可见光区均可用作光源
常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对
朗伯—比耳定律的偏离。 引起这种偏离的因素（两大类）： （1）物理性因素，即仪器的非理想引起的； （2）化学性因素。
（1）物理性因素 单色光不纯，导致负偏差。 散射光的影响，胶体、乳浊液或悬浊液 由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不 是垂直通过比色皿（非平行入射光）产生正偏差
为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器 此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸 收曲线较平坦处。
(2) 化学性因素
吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生负偏差， 朗伯-比尔定律只适合于稀溶液（C < 10-2 mol/L )。 平衡效应：溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物
强度来进行分析的方法。
分为：吸光光度法，发射光谱法
基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建 立起来的分析方法,叫吸光光度法.包括： 比色法：通过比较有色溶液颜色深浅 分光光度法：根据物质对一定波长的光的吸收程度
依据物质对不同波长范围光的吸收主要有：
真空紫外光度法：10～200 nm（远紫外光）
紫外吸光光度法：200400 nm（近紫外区） 可见吸光光度法：400750 nm 红外光度法：2.51000 m
特点
– 灵敏度高：
测定下限可达10-5～10 -6mol· L-1, 10-4%～10-5%
– 准确度
能够满足微量组分(<1%)的测定要求: Er : 1%～5%
－操光子的能量：
E h
h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J· s
－频率
E－光量子具有的能量
单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)
1eV=1.602×10－19 J
波粒二象性
E h
hc
结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越 长(频率越低)，光量子的能量越低.
S=M/ =55.85/1.1×104=0.0051 (g/cm2)
A= E
1% 1cm
b c
c =1.0mg/L=1.0×10-3 g /1000mL = 1.0×10-4 g/100mL
1% -4 3 -1 1 E1 = 0.38/2.0 10 = 1.9 10 （ 100mL g cm ） cm
I0 1 lg ＝ lgT 2.吸光度 (Absorbance) A lg It T
A, T, C 三 者 的 关 系
1.0
T
100
A T%
50
T = 0.0 %
A
A=∞
T = 100.0 %
0.5
A = 0.0
0
c
0
溶液的T越大,说明对光的吸收越小,浓度低; T越小，溶液对光的吸收越大，浓度高
吸光度的加合性
在多组分体系中如果各吸光物质之间无相互作用这时体系总 的吸光度等于各个吸光物质的吸光度之和。
A＝ Ai
吸光度的测量：
用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液 的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射， 溶剂、试剂对光的吸收等。
3. 光吸收基本定律: Lambert-Beer定律
Sandell(桑德尔)灵敏度 (S)
定义：当产生吸光度为0.001时，单位截面积(1cm2) 的液层内所能检测出的吸光物质的最低含量。 用S表示，单位：g· cm-2
S
S小灵敏度高;
M
相同的物质, M小则灵敏度高.
A= bc=0.001
bc ＝0.001/
变换单位: bcmcmol/L=bcM106 g/1000cm2
hc
物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同， 这就构成了物质对光的选择吸收基础。
1.吸收光与透射光 当复合光照射到物体上时，一部分光被 吸收，而另一部分光则被透射过去。即： 入射光=吸收光＋透射光
吸收光 互补 透射光
光的作用方式
光谱示意
复合光
表观现象示意
完全吸收
完全透过
吸收黄色光
物质的颜色与光的关系
同一种物质不同浓度下，其吸收曲线形状相似λmax不变。 在λmax处吸光度A随浓度变化的幅度最大。所以测定最灵 敏。此特性可作为定量分析时选择入射光波长的重要依据。
1.透光率 (透射比,Transmittance )
入射光强度 I0 透射光强度It
一束平行单色光
透光率定义:
It T I0
T 取值为0.0 % ~ 100.0 % 全部吸收 全部透射 T = 0.0 % T = 100.0 %
光的干涉
粒子性
E
光电效应
波动性
光的传播速度:
c V = = n
c －真空中光速 ：~3.0 ×108m/s
－波长：1m=10-6m, 1nm=10-9m, 1Å=10-10m －频率，单位：赫兹 Hz 次/秒
n －折射率，真空中为1：
= c ； 波数 = 1/ = /c
不同颜色的可见光波长及其互补光
/nm 颜色 紫 蓝 互补光 黄绿 黄 400-450 黄 橙 红 450-480
绿
蓝绿 绿蓝 蓝
黄绿
480-490
490-500 500-560 紫 紫红 560-580 580-610 610-650 650-760
绿蓝
蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
橙
红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
紫外区：石英池玻璃 （185～4000nm）
检测器：利用光电效应，将光能转换成 电流讯号。
光电池，光电管，光电倍增管
检流计（指示器）：
低档仪器：刻度显示 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录