食用菌栽培学实验---食用菌母种的制作实验

食用菌母种的制作实验

一、目的要求

了解无菌操作规程，熟练掌握PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)的制作、母种的转管与培养技术。

二、材料与用具

(1) 材料:马铃薯、葡萄糖、琼脂、酒精棉球、高锰酸钾、37%甲醛溶液、紫外线灯、标签纸等。

(2)用具:锅、玻璃棒、18mm×180mm试管、棉塞、纱布、牛皮纸、1000mL量筒、手提式高压蒸汽灭菌锅、菜刀、砧板、天平、烧杯、接种箱、超净工作台、接种针、酒精灯、恒温培养箱等。

三、内容与方法

(一)PDA母种培养基的制作

1.PDA培养基配方

去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18-20g，水1000mL,pH自然。此配方培养基适用于香菇、黑木耳、金针菇、滑菇、灵芝、草菇、平菇等多种菌种，但不适用于双孢菇等有特殊营养要求的食用菌。

2.配制方法

(1)确定使用量:根据人数确定使用量，一般每人制作10-20支培养基供接种用。

(2)制备营养液:马铃薯去皮、挖掉芽眼，切成黄豆大小的块。称量后用略多于用量的水煮开，并维持10-20min，至马铃薯块酥而不烂，再用2层纱布过滤，取其滤液，定容至1000ml待用；琼脂称好后，用剪刀剪成小段，再用清水浸泡，以利于熔化;将琼脂条放人滤液申边煮边搅拌，至全部熔化。再将溶液倒入量器中，

加入葡萄糖，并不断搅拌使之完全溶解。一般情况下，此营养液的pH不需要特意调节。

(3)营养液分装:趁热用注射器分装营养液。营养液以装人试管容量(或高度)的1/5 左右为宜，一般18mmx180mm试管注人8-10ml营养液即可。注意防止培养液粘到近管口的壁上装好后，塞好棉塞，每7支或10-12支捆成束，管口一端用防潮纸包扎好，待灭菌。

(4)灭菌:按照高压蒸汽灭菌锅的操作规程使用。

①加水:先向外锅加水，略超过支架。

②装锅:将灭菌物品装人锅内，不宜装得过满过紧，应留下1/5空间及空隙，以利蒸汽流通，并检查导管是否与排气网结合紧密，畅通。

③盖锅盖:对好内锅上插孔，盖好锅盖，对角将螺丝旋紧。

④开启电源:通电后压力表指针徐徐上升，当指针至0.055MPa时，打开排气间排除冷气，压力表指针回零，关好排气阀再继续加热。

⑤开温保温:当温度上升到121℃时(约0.105MPa)维持20—30min。

⑥降温与排气:保温时间结束后，停止加热，让其自然冷却，切勿直接打开排气阀，否则压力骤然下降，导致培养基剧烈沸腾，冲掉棉塞，甚至造成容器炸裂。10mi后即可开盖，取出已灭菌物品。

(5)摆斜面趁热将试管摆成斜面，培养基以试管长度的1/2-2/3为宜。斜面制成后，如不马上使用，可在3—5℃的冰箱中保存，待用。

(二)母种的接种与培养

1.接种环境的消毒

接种一般采用接种箱或超净工作台。

(1)接种箱的熏蒸消毒:先用2%来苏尔溶液清洁接种箱内外，放人接种所需的物品，再用甲醛熏蒸。熏蒸时每1立方米一般用甲醛10mL,加高锰酸钾5g,先将高锰酸钾放人接种箱内的容器中，再注人甲醛，可立即产生强烈刺激的甲醛气体，从而达到杀菌的效果。熏蒸时间至少保持30min以上。

(2)超净工作台的消毒:用消毒液擦拭台面后放置接种所需物品，开启超净工作台上的紫外灯，照射20min后使用。

2.母种的转管

(1)手及菌种管的消毒:用肥皂洗手，再用75%酒精棉球擦手和菌种管表面，在酒精灯火焰上略烧试管外的棉塞后，立即将菌种管放人接种箱内。

(2)转管:两手从接种孔伸入接种箱内，酒精棉球擦状接种环。左手持菌种管和空白斜面管，两支试管口对齐于火焰上方。右手持接种环，并将其在灯焰上干热灭菌，用小指及无名指

使棉塞底部朝外。接种环冷却后伸人菌种管内取黄豆粒大小、带有培养基的菌种块，迅速移入斜面培养基的中部，菌丝朝上。然后，将棉塞在火焰上烧下，立即塞人试管口，旋紧棉塞。

接种针不要触碰管口及管壁。接种后的试管应立即贴标签，注明菌种名称及接种日期，再进行适温培养。

3.母种的培养

将已接种的母种分类捆扎，放于站养前中适温培养。2 - 3d后每天检查菌丝生长情况，及时挑除污染及不萌发的试管。一般7-10d菌丝长满斜面。

四、作业与思考题

(1)简述PDA母种培养基制作的工艺流程。

(2)分析母种接种成败的原因。

答：（1）PDA母钟培养基的制作工艺流程：设计培养基配方→材料煮汁→补水→琼脂溶解→再次补水→药品溶解→调PH值→分装→灭菌→摆斜面

（2）①母种培养基凝固不良;

②接种物不萌发或萌发缓慢;

③萌发出的菌丝纤细无力，扩展缓慢;

④培养温度过高或含水量过低;

⑤灭菌不彻底，有细菌残留;

⑥培养料酸碱度不适或培养料中混入有毒物质等。

接种环境的处理，接种箱的熏蒸先用2%来苏清洁接种箱内外，放入接种所需的物品，用甲醛熏蒸。每立方米空间一般用甲醛10ml,加入高锰酸钾(5-7g) 使甲醛氧化挥发。先将高锰酸钾放入接种箱内的容器中，再注入甲醛，立即产生强烈刺激的甲醛气体。熏蒸20--30min。超净工作台的消毒用消毒液擦拭台面后放置接种所需物品，开启超净工作台上的紫外灯，照射20-30min后使用。

五．实验结果