铜绿假单胞菌检查

铜绿假单胞菌检查

1 简述

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），习称绿脓杆菌，为假单胞菌属菌种，广泛分布在土壤，水及空气中，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品，本菌是常见的化脓性感染菌、在烧伤、烫伤、眼科及其他外科疾患中长引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性，增加了治疗的难度。国内外药典均将铜绿假单胞菌列为检查项目之一。

铜绿假单胞菌按增菌，分离、纯培养、革兰染色、镜检及生化试验等步骤进行检验。

2 仪器、设备和用具（见大肠埃希菌2）。

3 试液、指示液

3.1 0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液[附录3.1，3.3]。

3.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液[附录3.2]。

3.3 1%盐酸二甲基对苯二胺试液[附录2.1]。

3.4 盐酸试液[附录2.12]。

3.5 氯仿[附录1.57]。

4 培养基

4.1 营养肉汤培养基[附录

5.1]。

4.2 胆盐乳糖（BL）培养基[附录

5.6]。

4.3 营养琼脂培养基[附录

5.2]。

4.4 溴代十六烷基三甲胺[附录

5.14]。

4.5 绿脓菌素测定用培养基（POP琼脂）[附录

5.26]。

4.6 明胶培养基[附录3.27]。

4.7 硝酸盐胨水培养基[附录

5.28]。

5 对照用菌液

铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106，使对照菌加入量含10～100cfu（一般用量为0.1ml），菌数测定在做阳性对照实验用营养琼脂浇碟或平板涂布经培养后计数确定。

6 操作方法

6.1 供试品的取样量（见细菌、霉菌和酵母菌计数5.3）。

6.2 供试液的制备（见细菌、霉菌和酵母菌计数7）；（大肠埃希菌6.2）。

6.3 增菌培养

取胆盐乳糖培养基2份，每份100ml，1份加入1:10供试液10ml（相当于供试品1g或1ml）。另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于36℃±1℃培养18～24h（必要时可延至48h）。阴性对照菌应无军生长。

6.4 分离培养

轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取1～2环培养液（如有菌膜应挑取之），划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于36℃±1℃培养18～24h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、

圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗糙型和粘液型等，应注意挑选。

6.5 纯培养

供试品分离平板生长6.4所述典型菌落或呈疑似菌落时，以接种针轻轻接触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取2～3个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养，作以下检查。

6.6 革兰染色镜检

6.6.1 革兰染色（见大肠埃希菌

7.5）。

6.6.2 镜检

铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列。

6.7 生化试验

用铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]做生化试验的阳性对照株。

6.7.1 氧化酶试验

取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加1滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30s内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应。

本试验应致意：

（1）试验菌落（苔）必须新鲜，陈旧培养物反映不可靠。

（2）试验避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种针（环）（白金材料除外）挑取菌落（苔），否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。（3）试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯而胺氧化变色不可用。

（4）反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸没培养物，使之与空气隔绝，造成假阴性范性。

（5）麦康凯、SS琼脂培养基等含糖培养基上的菌落，不适于做氧化酶试验。因为糖分解产酸，抑制氧化酶活性。

6.7.2 绿脓菌素试验

取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基（PDP）斜面上，36℃±1℃培养24h后，观察斜面有无色素，如有色素，在试管内加氯仿3～5ml，以无菌玻棒搅碎培养基并充分振摇。使培养物中的色素完全萃取在氯仿液内。静置片刻，待氯仿分层，用吸管将氯仿移至另一试管中，加入盐酸试液（1mol/L）约1ml，振摇后静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色，即为阳性反应，无粉红色出现为阴性反应。本试验可用未接种的PDP琼脂培养基斜面作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。如培养基斜面无色素产生，应于室温培养1～2天再按上法试验。凡经再次检验，绿脓菌素试验仍为阴性者应继续以下试验。

6.7.3 硝酸盐还原产气试验

以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种于硝酸盐胨水培养基中，置36℃±1℃培养24h，观察结果。如在培养基内的小倒管中有气体产生，即为阳性反应，表明该培养物能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分

解产生氮气。小倒管内无气泡者为阴性反应。

6.7.4 42℃生长试验

以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物于0.9%无菌氯化钠液中，制成菌悬液。然后将菌悬液划线接种于营养琼脂斜面上，立即置42℃±1℃的恒温水浴箱内，务使整个斜面浸没在水浴中，培养24～48h，斜面如有菌苔生长者为阳性反应；无菌苔生长为阴性反应。6.7.5 明胶液化试验

以接种针沾取营养琼脂斜面培养物少许，穿刺接种于明胶培养基中，穿刺深度应接近培养基的底部，于36℃±1℃培养24h。取出放入0～4℃冰箱内10～30min。如培养基呈溶液状，即为明胶液化试验阳性反应；如明胶呈凝固状，为阴性反应。

本试验应注意：

（1）本试验接种前，培养基应为固态，否则需将培养基置冰箱内使之凝固后，再穿刺接种。

（2）试验应同时设未接种细菌的阴性对照管，与试验管同时培养并观察结果。

7 结果报告

7.1 供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌。

7.2 供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验阴性时，其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌。