hERG K+通道电流和药理学特性(Molecular Devices)

应用文献

IonFlux system 应用之一：

hERG K +通道电流和药理学特性

简介

HERG (human ether-a go-go-related gene) K + 通道在心脏中高表达，是心肌动作电位三期快速复极化电流(IK r )的主要组成部分(Curran ‘95; Sanguinetti ‘95)。hERG 突变引起的功能缺失常伴随一些遗传性长QT 综合症(LQTS) 并且会增加发生严重的室性心律失常, 扭转性实行心动过速 (Tanaka ‘97; Moss ‘02)的风险。HERG 钾离子通道被作用于心脏或非作用于心脏的药物抑制，都被证实有非常大的可能性出现获得性药物诱导的长QT 综合症(LQTS)，甚至导致猝死(V andenberg, Walker & Campbell ‘01)。实际上，hERG 钾离子通道被抑制引起的副作用是近年来药物撤市的主要原因，因而药物作用于外源性表达于哺乳动物细胞的hERG 通道的体外效应评价已被 国际药品注册协调会议（International Conference on Harmonization ）推荐作为临床前安全性评价工作的一部分(ICHS7B Expert Working Group, ‘02)。

hERG 钾离子通道药物效应评价的金标准方法是手动膜片钳记录。然而，这种低通量、高成本的方法在大量的安全性筛选实验中非常受限制。近年来，全自动膜片钳技术发展越来越成熟，可以获得高通量的、可与手动膜片钳记录结果相媲美的数据。IonFlux™ 系统结合了读板机的便捷和传统膜片钳技术的优秀性能。本文主要利用IonFlux 系统记录了在哺乳细胞中表达的hERG 电流以及一些阳性抑制剂对hERG 阻断效应的药理学特性分析。 材料和方法 细胞

实验中使用G418筛选的稳定表达hERG 通道的CHO 细胞（Millipore PrecisION™ hERG-CHO Recombinant Cell Line, Cat# CYL3038）。细胞培养在含10%胎牛血清的Glutamax DMEM/F12 培养基 (Gibco, Cat# 11320) ，加有1% 青霉素-链霉素以及500 µg/mL G418。实验前至少提前24小时将细胞转移至30℃培养箱中，或传代后一直放置在30℃培养箱中。细胞密度不能超过90%。收集细胞时，使用Detachin (Genlantis, San Diego, CA, Cat# T100100)消化细胞，冲洗并轻柔吹打，最后细胞悬浮在细胞外液中，浓度为每毫升2-5百万个细胞。

溶液和化合物

细胞外液成分（ECS ）含有（mM ）：NaCl 145, KCl 4, MgCl 2 1, CaCl 2 2, HEPES 10, 葡萄糖 10，用NaOH 调pH 至7.4 。细胞内液成分（ICS ）含有（mM ）：KCl 120, HEPES 10, Na 2ATP 4, EGTA 10, CaCl 2 5.374, MgCl 2 1.75，用KOH 调pH 至7.2。

hERG 抑制剂购自Sigma 。化合物第一步全部溶于DMSO 中，制成高浓度的母液（10-50 mM ），然后按照浓度梯度和最终外液中的终浓度的倍数关系进行下一步的稀释，因而最终相应的DMSO 浓度为（0.1- 0.3%）。DMSO 溶液（0.1- 0.3%）作为阴性对照的记录始终开始于抑制剂作用之前， 且规定不能对电流幅度的影响超过10%。

Figure 1. IonFlux 高通量全自动膜片钳系统，采用“读板机”式模式，简化了工作流程、增加了实验通量。系统配有16通道和64通道两种型号，每天可以记录获取10,000 个数据点。

实验刺激方案

IonFlux记录板的每个孔分别加入250 µL内液、化合物、以及细胞悬液。IonFlux记录板的规格和加液处

理与标准的多孔板完全一致，主要区别之处在于记录板的底部加装了互相独立的微流体孔道网络用于连

接、运送试验孔中不同的液体。在溶液添加结束后，所有气压控制步骤全部通过机器自身来完成，包括细

胞捕获、形成封接、化合物添加，以及冲洗等。

IonFlux-16系统包含了16个独立的放大器。编辑好的电压刺激命令同步作用于所有的16个记录通道。系统采用20个细胞集合记录的模式，即一个放大器对应的记录位点中同时记录20个细胞的电流结果并取其总和值作为最终的数据，从而大大提高数据的一致性以及实验成功率。在本次hERG实验中，细胞被钳制在-80 mV，且超极化至-100mV以监控串联电阻的变化。hERG在+50 mV (800 ms)被激活，然后外向尾电流在-50 mV时被记录，激活前-50 mV的刺激将作为基线电流用于最终结果的分析。-50 mV之后继续超极化至-120 mV (800 ms) 主要用于hERG通道从失活过程的恢复（见图2）。在研究电压-电流关系（IV反应）的实验中，采用了从-50 mV 至60 mV 12个10mV步阶激活刺激命令，或者从-120mV至+50mV的18个10mV的去极化步阶刺激命令（见图3）。电压刺激命令每隔6秒运行一次。漏电流通过在线的两组小脉冲来补偿（-80 mV至-100 mV，50 ms/50 ms）。采样频率为5kHz，实验在室温中进行（20 - 23 °C）。

在药理学特性研究中，hERG电流稳定后（~5 min），同一个化合物按照浓度从低到高（包括0.1-0.3% DMSO溶液的阴性对照）依次添加至细胞记录位点，持续3~5分钟。加样方式包括依次累加给药刺激或每个浓度间隔外液冲洗两种方式。

全细胞hERG 离子通道电流示例

图2显示了电压刺激方波（上图）和

典型的室温下hERG离子通道实时电

流软件截屏图（下图）。图中16个放

大器对应的16个通道的hERG电流结

果在展现在一张图中，以不同颜色表

示。漏电流补偿通过机器自动完成。

电阻和电流的幅

度(I) 通过标记的游标（cursor）

位置（粉色和亮绿色用于电阻的

计算，绿色和蓝色用于电流计算）

进行统计计算。

Figure 2. hERG 电流的电压刺激方波和典型的hERG离子通道

电流软件截屏图。