细菌性食物中毒的快速检验

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PCR反应五要素的优化
• 1、多聚核苷酸引物 • 2、Taq DNA聚合酶 • 3、dNTP（三磷酸脱氧核苷酸） • 4、模板核酸 • 5、缓冲液
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其它因素对PCR的影响
1、PCR反应的总体积 2、PCR反应的促进剂
通过加入某些物质稳定酶活性或 有利于DNA的变性与复性，以提高扩 增效率和反应的特异性 。
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• 稳定酶活性的有牛血清白蛋白、0.01% 明胶、0.05~0.1% Tween-20及 5mmol/L 二巯基苏糖醇（DTT），但应 注意使用浓度不应过高，只有牛血清白 蛋白的浓度可高达800µg/ml，而对酶活 性仍无抑制。
• 5~10%的二甲基亚砜有利于DNA变性， 5~10%的甘油有利于DNA复性。
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注意事项
减少非特异性扩增及交叉污染
体系组成
– 一段长的双链DNA，是待扩增的目的片段 ，作为扩增反应的原始模板(template)
– 两段单链寡核苷酸，其序列与待扩增片段 的两端相同，作为反应的引物(primer)
– 有四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）作为合 成DNA的原料
– 有DNA聚合酶(polymerase)，催化DNA 的合成
进行的酶联荧光免疫分析。像吸液管的装置是固相
容器（SPR），在分析中既作为固相也作为吸液器
。SPR包被有高特异的单克隆抗体混合物。将一定
量的增菌肉汤加入试剂条，肉汤中的混合物在特定
时间内循环于SPR内外。如果有E.coli O157:H7抗原
存在则与包被在SPR内的单克隆抗体结合，其他没
有结合上的化合物被冲洗掉。结合有碱性磷酸酶的
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分子生物学检验技术
• 聚合酶链反应 • 聚合酶链反应是在体外酶促扩增特定DNA
或RNA片段的技术 • 由变性Template denaturation • 退火Primer annealing • 延伸Primer extension
三个基本步骤构成
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二、PCR技术的特点
• 高特异性：PCR反应的特异性决 定因素为：①以碱基配对原则使 引物与模板DNA特异正确的结合 ；②DNA聚合酶合成反应的忠实 性；③靶基因的特异性与保守性
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• 高灵敏度：PCR产物量是以指数方式 增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起 始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平 。能从100万个细胞中检出一个靶细胞 ；在细菌的检测中，最小检出率为3个 细菌；在病毒的检测中，PCR的灵敏 度可达3个PFU(空斑形成单位)。
1d
2-4h
1-2d
恶心 呕吐 腹痛 腹泻 发热38℃左右
食品 便
呕吐腹痛 腹泻水样 便或粘液便 发热 <39℃
便 食品
恶心 呕吐为主 腹痛 腹泻为主
食品 呕吐物
恶心 频繁剧烈呕吐 腹痛 腹泻
食品 呕吐物
肉、乳、蛋、 冷冻食品
5-10h
1-2d
恶心 呕吐 腹痛 腹泻
食品 呕吐物 粪便
罐头、腌制 品
1-7d
抗体在SPR内外循环与结合在SPR内壁上的E.coli
O157:H7抗原结合，最后的冲洗步骤将没有结合的
接合剂冲洗掉。底物—4-甲基伞形磷酸酮被SPR壁
上的酶转换成荧光产物—4-甲基伞形酮。荧光强度
由光学扫描器测定。实验结果由计算机自动分析，
产生基于荧光测试的试验值与标准相比较后打印出
每一个被测样品的阳性或阴性结果报告。
细菌性食物中毒的快速检验
平山县疾控中心
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定义
• 食源性疾病 世界卫生组织将食源性疾病定义为“
凡是通过摄食而进入人体的病原体，使人 体患感染性或中毒性疾病，统称为食源性 疾病”
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定义
• 食物中毒 食物中毒是指人摄人了含有生物性、化学性有毒有
害物质后或把有毒有害物质当作食物摄入后所出现的而非 传染性的急性或亚急性疾病，属于食源性疾病的范畴。食 物中毒既不包括因暴饮暴食而引起的急性胃肠炎、食源性 肠道传染病(如伤寒)和寄生虫病(如囊虫病)，也不包括因 一次大量或者长期少量摄入某些有毒有害物质而引起的以 慢性毒性为主要特征(如致畸、致癌、致突变)的疾病。
吞咽困难 复视 失音 食品 呕吐物
2-20d 呼吸困难
血液
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细菌性食物中毒检验
采集样品 检验程序
直接涂片、染色、镜检→活菌数测定→选择 适当的增菌和鉴别培养基进行分离培养→ 生化鉴定→血清学鉴定→毒素测定。
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酶联荧光免疫分析法
• 此E.coli O157:H7的抗原鉴别是基于在VIDAS仪器内
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食物中毒诊断标准主要以流行病学调 查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现 为依据，实验室诊断是为了确定中毒的病 因而进行的。
食物中毒诊断标准及技术处理总则 GB14938-1994
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中毒特征
名称 沙门氏菌
副溶血弧菌
变形杆菌
致泻性大肠 蜡样芽孢杆 菌 葡萄球菌 粪链球菌 1肉2/毒26梭/20菌19
– 有合适的盐、缓冲液以及温度循环参数， 以提供酶促反应的最佳条件并保证反应的 产量。
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Fra Baidu bibliotek
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• 在PCR体系中，相对于模板DNA，引 物大量过剩，模板变性后退火时，它 们以3’末端相对分别结合于模板DNA 的两条互补链上，在DNA聚合酶催化 下，合成新的、引物对之间的DNA片 段。在第一个循环中，以两条互补的 DNA为模板，从引物3'端开始延伸， 其5'端是固定的，3’端则没有固定的止 点，随延伸时间的增加而增长，因此 该循环的产物长度是不定的；
常见食物
潜伏期
病程 主要症状
重点采集标本
肉蛋类 水产品
4-48h 3-24h
3-7d
恶心 呕吐 腹痛 腹泻 发热38-40℃
便 食品 血
呕吐 发热 腹痛以上 1-3d 腹部为主 水样便腹 便 食品
泻
肉蛋及水产 品
凉拌菜
米饭、肉、 乳
肉、乳、蛋
5-18h
1-3d
4-44h
1-3d
呕吐型0.5-5h 腹泻型8-16h