细胞培养无菌操作

细胞实验考核要点

一、准备工作

1、清点超净台中仪器物品（垃圾桶、饭盒中三种管、橡胶塞、蓝枪头、移液枪、电子枪、50ml离心管、镊子、剪刀、marker笔、打火机、卫生纸、6孔板、平衡50ml内含1ml离心管），合理布置台面。

2、超净台灭菌：酒精喷洒超净台面，紫外照射20min左右。

3、预热：将PBS、10%FBS、胰酶装进PE手套中，37℃预热备用。

二、实际操作1、点燃酒精灯

2、从水浴锅中取出预热的三种液体，喷酒精后放入超净台，用卫生纸擦拭瓶壁酒精。撕开三个封口膜。瓶口在外焰烧灼烧，拧松三个瓶盖，以备用。

3、手喷酒精后，旋松并取出T25瓶。在显微镜下观察细胞长势，若细胞密度达到了80%-90%，则可以进行传代。注意若显微镜没有人用过，需要在载物台附近喷洒酒精后擦拭。

4、将T25拿到超净台里面。手进入台面内需酒精喷洒消毒（后不赘述）。打开吸泵。

5、来回灼烧吸泵铁头。旋开T25瓶，注意灼烧瓶盖，瓶盖扣放。铁头插上两个蓝枪头，瓶身倾斜吸去瓶中原培养基。灼烧瓶盖和瓶口后盖盖，不要盖太紧。

6、取1ml移液枪，将T25竖起来，向未生长细胞的侧壁打入5ml PBS冲洗。盖盖后左右上下稍移动。将PBS吸出。关吸泵！

7、向瓶中加入500ul胰酶。稍混合均匀。放入培养箱中消化2min。计时。

8、2min内需完成的操作

（1）取出一个50ml离心管。

（2）烧套管：镊子在火上过一下，套管盒稍稍开一小口，用镊子取出一个套管，火上来回灼烧，然后放置在离心管架上。

（3）烧弯头吸管：从烧瓶中用镊子取出一个塞子。弯头吸管盒稍开一小口，确定是不是塞棉花的一头。镊子稍稍过火灼烧，开一小口，镊子夹出塞棉花一头，放下镊子，拿出吸管。盒子放回原处。将塞子塞入弯头吸管中。手持塞子来回在火上灼烧，完毕后放入套管中。9、取出培养箱中消化的细胞，显微镜及肉眼观察消化是否合适。若在显微镜下看到细胞质壁分离呈球形，大部分细胞已经脱离瓶壁游走在视野中，肉眼观察有白色的成片细胞脱落，说明消化完成。

10、将消化完成的T25放入超净台，加入500ul培养基。拿出烧好的弯头吸管深入瓶里面吹打瓶壁细胞。注意尽量少产生气泡，每次吹打不要完全将液体排出，这样气泡会大量减少。吹打时要全方位多角度，瓶身每个部位不留死角。

11、将含细胞的液体加入50ml离心管。离心5min。注意平衡离心管。此时将枪调最大量程。

12、5min内需完成的操作

（1）取出两个6孔板，放入超净台中。标记细胞名称、操作者、时间。需用的10个孔分别标记为1-10。

（2）烧10ml管：类似烧弯头吸管的方法灼烧10ml管。注意插到电子移液枪中。刻度应朝着自己能够看清的方向。烧好后备用。

13、取出离心完成的50ml离心管。打开吸泵。

14、旋开瓶口，稍向下倾斜吸出上层液体。盖上离心管盖子。关吸泵。

15、向离心管中加入23ml左右的培养基DMEM。吹打均匀。（师姐要求将T25 传代到6孔板的10个孔中，稀释比例为1:5，每个孔加2ml，大致需要20ml的液体，为了减少液体的损失，需稍多加一点，约23ml左右，不必太精确）

16、向6孔板中每个孔中加入2ml左右的细胞悬液。每次加入之前需再次吹打重悬，防止细胞沉淀。铺板后即可放入培养箱中继续培养。

17、善后工作：封口PBS、DMEM、胰酶，标记日期等信息。回收垃圾和非回收垃圾的放置。