传代细胞培养和病毒感染力(TCID50)的滴定

七、TCID50的计算方法
1、Reed-Muench法
CPE：Cytopathic effect
距离比例＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8
lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于
50%病变率的稀释度的对数 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8／0.1ml
其它容器中。低温贮藏备用。
五、测定病毒感染力的方法
１、半数致死量(50% lethal dose, LD50 ): 指能使接种的实验动物于感染后一定时间内死 亡一半所需的活微生物量或毒素量。 ２、半数鸡胚感染量(egg 50% infective dose, EID50):
指能使半数试验对象 ( 动物、鸡胚或细胞 )发生 感染的病原微生物的量。
四、病毒在细胞中的培养
选长满单层的细胞，倒掉培养液。 加入适量的病毒悬液
置温箱中感作（吸附）45min-1h。
取出瓶子，倒掉或不倒掉病毒液，补足维持液，置 温箱中继续培养，直至细胞病变。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取
出自然解冻，在解冻过程中要振摇几次，以使细胞
完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或
实验二 传代细胞培养和病毒
感染力（TCID50）的滴定
一、实验目的
了解不同传代细胞的形态、传代方法。
了解病毒感染力测定的几种方法。
掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作
步骤、计算方法及含义。
二、材 料
1. 96孔细胞培养板、加样器(200ul)、枪头、 Eppendorf管(1.5ml)
2. BHK-21细胞
3. 培养液：含5%犊牛血清、200U/ml青、链霉 素的DMEM 4. 伪狂犬病病毒液（PRV）
三、传代细胞系培养方法
取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。
加入1-2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，
至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。
加入生长液，反复吹打几次，使细胞分散成单个细 胞，然后分装于2-3个小瓶中。再在每个小瓶中补充 生长液至10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1-2天 即可长成单层。
３、组织培养半数感染量 (50% tissue culture infective dose, TCID50) 4、蚀斑形成单位(plaque forming unit ,PFU)
六、TCID50的操作步骤
1.在1.5ml离心管中将伪狂犬病毒(PRV)作连续10倍的稀释 ，从10-1-10-8。 2.将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度 接种一纵排共8孔，每孔接种100µ l。 3.在每孔加入细胞悬液100µ l，使细胞量达到2~3×105/ml 4.设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排 (100µ l生长液 +100µ l细胞悬液） 5.逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。 6.结果的计算，Reed-Muench两氏法或 Karber法
含义:将该病毒稀释103.8倍接种96孔细胞培养板 ，每孔100µl，可使50%接种孔的细胞发生病变
2、Karber法
lgTCID50=L-d(s-0.5) L：最高浓度的稀释度的对数 d：稀释度对数之间的差
s：阳性孔比率总和
lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)=-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml