试管动物与克隆动物
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1938年：德国胚胎学家Spemann首次提出克隆的 设想。
1952年：Briggs和Kings获得豹蛙胚胎克隆后代。 1975年：Bromhall最早在家兔上证实哺乳动物的胚
胎细胞核移植是可行的。 1997年：英国罗斯林研究所宣布克隆羊培育成功。
他们用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功一只 克隆羊。
12.6 动物克隆技术的应用及发展前景
12.6.1 核移植的应用
① 在科研基础领域方面的应用：促进胞质关系的研究； 促进人类了解生物生长发育的机理。
② 在医学领域的应用价值：细胞治疗；异种器官移植； 生产治疗性蛋白；培育各种疾病动物模型。
③ 在畜牧业方面的应用：大量繁殖优良个体，提高畜产 品产量和质量；克隆技术是培育畜禽优良品种的捷径； 性别控制
重构胚的培养与移植
切开卵母细 胞透明带 1
3
注入供体 细胞核
挤出卵母细 胞细胞核 2
电融合仪 融合
4
5 培养
(1) 胚胎细胞核移植的操作方法
① 核供体细胞的获得 选择： 核供体细胞必须具有供体动物完整的基因组， 二倍体 能在细胞质的作用下，产生细胞分化过程的 倒转 来源： 胚胎细胞，胚胎干细胞，体细胞等
隆一只山羊。
1995年7月，华南师大与广西农大合作，克隆一头奶牛、黄牛杂 种牛。
1995年10月，西北农大克隆6头猪。 1996年12月，湖南医大克隆6只老鼠。中国农科院畜牧所克隆一
头公牛犊。(以上为胚胎细胞克隆研究) 1997年3月，陈大元率先提出了克隆大熊猫的设想。 1999年，中科院动物研究所成功培育出了大熊猫的早期胚胎。 2000年6月，西北农林科技大学培育出世界上第一例成年体细胞
(1) 胚胎细胞核移植的操作方法
② 受体细胞的选择及去核 选择： 成熟的卵母细胞，受精卵，2细胞胚胎 来源： 一是用激素进行超排，冲出MII卵母细胞； 二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘-卵母细胞 复合体（COC），体外成熟培养。 去核： 盲吸法，半卵法，离心去核法，切割去核法，化学诱 导去核，显微手术法
Wilmut I et al. Nature, 1997, 385: 810-813
克隆蛙产生过程
克 隆 羊 产 生 过 程
中国克隆动物研究大事记
60年代，生物学家童第周对金鱼、鲫鱼进行细胞核移植。 1990年5月，西北农业大学畜牧所克隆一只山羊。 1992年，江苏农科院克隆一只兔子。 1993年，中科院发育生物学研究所与扬州大学农学院合作，克
第十二章 动物克隆技术
精卵结合 胚 胎
细胞 分化
个体
基本概念
克隆（clone）: 遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一 祖先的生物个体的无性繁殖群体，也指通过克隆方式生产 克隆群体的过程或手段。
克隆
分子克隆
细胞克隆
个体克隆
基本概念
动物克隆：由一个动物经无性繁殖（asexual reproduction）或孤雌生殖而产生的多个后代， 克隆的所有成员在遗传组成上都是完全相同的。
(1) 胚胎分割的原理
大多数哺乳动物的胚胎发育是调整发育。 随着胚胎发育的进行，其调整能力逐渐减弱，
细胞的组织发育方向慢慢得到固定，直至调整 能力完全丧失。
(2) 胚胎细胞核移植的原理
早期胚胎细 胞具有全能 性，它包含 个体的全套 遗传信息。
(3) 体细胞核移植的原理
细胞全能性是细胞核基因在不断变化和胞质环境 的作用下有次序、有系统地表达的结果，在分化 的细胞内存在有可逆性修饰的遗传物质。
细胞核移植技术（nuclear transfer）：动物克隆 的核心技术
主要内容
12.1 动物克隆的研究历史 12.2 动物克隆的意义 12.3 动物克隆的原理及技术路线 12.4 动物克隆的方法 12.5 动物克隆的影响因素 12.6 动物克隆技术的应用及发展前景
12.1 动物克隆的研究历史
(2) 体细胞核移植的操作方法
核供体细胞的获得
G0期的诱导
受体细胞的选择及去核 核卵重组
细胞融合与激活
重构胚的培养与移植
Creating Dolly！
1997年2月22日，英国“Nature”刊登了爱丁堡罗斯林研究所 维尔穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，从此震惊 了世界。
(3) 克 隆 动 物 的 鉴 定
克隆山羊。
12.2 动物克隆的意义
体细胞与胚胎干细胞的关系
胚胎干细 胞
体细胞
12.2 动物克隆的意义
对传统动物繁殖模式的挑战； 对社会伦理的挑战； 保存物种、延续生命、提高人口素质？
பைடு நூலகம்
12.3 动物克隆的原理及技术路线
12.3.1 动物克隆的原理
胚胎分割的原理 胚胎细胞核移植的原理 体细胞核移植的原理
已分化的体细胞在特定条件下，经过去分化也具 有全能性，其前提条件是这种细胞在体外进行诱 导进入休眠状态。
12.3 动物克隆的原理及技术路线 12.3.2 动物克隆的技术路线
12.4 动物克隆的方法
(1) 胚胎 细胞核移 植的操作 程序
核供体细胞的获得 受体细胞的选择及去核
核卵重组
细胞融合与激活
(1) 胚胎细胞核移植的操作方法
③ 核卵重组 带下移植 胞质内注射
④ 细胞融合与激活 细胞融合：仙苔病毒法，电融合法 激活：原理是通过电刺激、钙离子载体等方法， 使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受 精”的状态。
(1) 胚胎细胞核移植的操作方法
⑤重构胚的培养与移植 重组胚移入中间受体或体外培养，观察其发 育率 重组胚移植的受体母体要选择皮毛颜色与供 体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的品种、 同期发情处理……
对于体细胞核移植的后代，既要从 形态、性别上鉴定供体细胞与克隆 后代的亲缘关系，又要分子生物学 水平鉴定
DNA 指 纹 ：指每个个体所特有的 基因多态性
鉴定方法：RAPD 微卫星 RFLP
DOLLY的鉴定：微卫星
12.5 动物克隆的影响因素
影响核移植的主要因素
供体细胞核的选择 胚细胞的分离和注入 卵母细胞去核效果 受体胞质的成熟程度及其激活能力 核质相互作用与细胞周期同步化 重组胚的培养及发育 重组胚的妊娠率
1952年：Briggs和Kings获得豹蛙胚胎克隆后代。 1975年：Bromhall最早在家兔上证实哺乳动物的胚
胎细胞核移植是可行的。 1997年：英国罗斯林研究所宣布克隆羊培育成功。
他们用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功一只 克隆羊。
12.6 动物克隆技术的应用及发展前景
12.6.1 核移植的应用
① 在科研基础领域方面的应用：促进胞质关系的研究； 促进人类了解生物生长发育的机理。
② 在医学领域的应用价值：细胞治疗；异种器官移植； 生产治疗性蛋白；培育各种疾病动物模型。
③ 在畜牧业方面的应用：大量繁殖优良个体，提高畜产 品产量和质量；克隆技术是培育畜禽优良品种的捷径； 性别控制
重构胚的培养与移植
切开卵母细 胞透明带 1
3
注入供体 细胞核
挤出卵母细 胞细胞核 2
电融合仪 融合
4
5 培养
(1) 胚胎细胞核移植的操作方法
① 核供体细胞的获得 选择： 核供体细胞必须具有供体动物完整的基因组， 二倍体 能在细胞质的作用下，产生细胞分化过程的 倒转 来源： 胚胎细胞，胚胎干细胞，体细胞等
隆一只山羊。
1995年7月，华南师大与广西农大合作，克隆一头奶牛、黄牛杂 种牛。
1995年10月，西北农大克隆6头猪。 1996年12月，湖南医大克隆6只老鼠。中国农科院畜牧所克隆一
头公牛犊。(以上为胚胎细胞克隆研究) 1997年3月，陈大元率先提出了克隆大熊猫的设想。 1999年，中科院动物研究所成功培育出了大熊猫的早期胚胎。 2000年6月，西北农林科技大学培育出世界上第一例成年体细胞
(1) 胚胎细胞核移植的操作方法
② 受体细胞的选择及去核 选择： 成熟的卵母细胞，受精卵，2细胞胚胎 来源： 一是用激素进行超排，冲出MII卵母细胞； 二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘-卵母细胞 复合体（COC），体外成熟培养。 去核： 盲吸法，半卵法，离心去核法，切割去核法，化学诱 导去核，显微手术法
Wilmut I et al. Nature, 1997, 385: 810-813
克隆蛙产生过程
克 隆 羊 产 生 过 程
中国克隆动物研究大事记
60年代，生物学家童第周对金鱼、鲫鱼进行细胞核移植。 1990年5月，西北农业大学畜牧所克隆一只山羊。 1992年，江苏农科院克隆一只兔子。 1993年，中科院发育生物学研究所与扬州大学农学院合作，克
第十二章 动物克隆技术
精卵结合 胚 胎
细胞 分化
个体
基本概念
克隆（clone）: 遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一 祖先的生物个体的无性繁殖群体，也指通过克隆方式生产 克隆群体的过程或手段。
克隆
分子克隆
细胞克隆
个体克隆
基本概念
动物克隆：由一个动物经无性繁殖（asexual reproduction）或孤雌生殖而产生的多个后代， 克隆的所有成员在遗传组成上都是完全相同的。
(1) 胚胎分割的原理
大多数哺乳动物的胚胎发育是调整发育。 随着胚胎发育的进行，其调整能力逐渐减弱，
细胞的组织发育方向慢慢得到固定，直至调整 能力完全丧失。
(2) 胚胎细胞核移植的原理
早期胚胎细 胞具有全能 性，它包含 个体的全套 遗传信息。
(3) 体细胞核移植的原理
细胞全能性是细胞核基因在不断变化和胞质环境 的作用下有次序、有系统地表达的结果，在分化 的细胞内存在有可逆性修饰的遗传物质。
细胞核移植技术（nuclear transfer）：动物克隆 的核心技术
主要内容
12.1 动物克隆的研究历史 12.2 动物克隆的意义 12.3 动物克隆的原理及技术路线 12.4 动物克隆的方法 12.5 动物克隆的影响因素 12.6 动物克隆技术的应用及发展前景
12.1 动物克隆的研究历史
(2) 体细胞核移植的操作方法
核供体细胞的获得
G0期的诱导
受体细胞的选择及去核 核卵重组
细胞融合与激活
重构胚的培养与移植
Creating Dolly！
1997年2月22日，英国“Nature”刊登了爱丁堡罗斯林研究所 维尔穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，从此震惊 了世界。
(3) 克 隆 动 物 的 鉴 定
克隆山羊。
12.2 动物克隆的意义
体细胞与胚胎干细胞的关系
胚胎干细 胞
体细胞
12.2 动物克隆的意义
对传统动物繁殖模式的挑战； 对社会伦理的挑战； 保存物种、延续生命、提高人口素质？
பைடு நூலகம்
12.3 动物克隆的原理及技术路线
12.3.1 动物克隆的原理
胚胎分割的原理 胚胎细胞核移植的原理 体细胞核移植的原理
已分化的体细胞在特定条件下，经过去分化也具 有全能性，其前提条件是这种细胞在体外进行诱 导进入休眠状态。
12.3 动物克隆的原理及技术路线 12.3.2 动物克隆的技术路线
12.4 动物克隆的方法
(1) 胚胎 细胞核移 植的操作 程序
核供体细胞的获得 受体细胞的选择及去核
核卵重组
细胞融合与激活
(1) 胚胎细胞核移植的操作方法
③ 核卵重组 带下移植 胞质内注射
④ 细胞融合与激活 细胞融合：仙苔病毒法，电融合法 激活：原理是通过电刺激、钙离子载体等方法， 使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受 精”的状态。
(1) 胚胎细胞核移植的操作方法
⑤重构胚的培养与移植 重组胚移入中间受体或体外培养，观察其发 育率 重组胚移植的受体母体要选择皮毛颜色与供 体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的品种、 同期发情处理……
对于体细胞核移植的后代，既要从 形态、性别上鉴定供体细胞与克隆 后代的亲缘关系，又要分子生物学 水平鉴定
DNA 指 纹 ：指每个个体所特有的 基因多态性
鉴定方法：RAPD 微卫星 RFLP
DOLLY的鉴定：微卫星
12.5 动物克隆的影响因素
影响核移植的主要因素
供体细胞核的选择 胚细胞的分离和注入 卵母细胞去核效果 受体胞质的成熟程度及其激活能力 核质相互作用与细胞周期同步化 重组胚的培养及发育 重组胚的妊娠率