海洋微生物中提取产生抗生素菌株

海洋微生物中提取产生抗生素菌株

一、实验题目:从海洋微生物中提取产抗生素菌株

二、实验背景：海洋微生物包括海洋细菌、海洋真菌和海洋放线菌，其种类约为陆生微生物的20倍以上，海洋微生物其特殊的生存环境（高盐、高压、低温、低光照和寡营养），从而可合成一些结构新颖的抗生素，这是陆地微生物所不具备的。从海洋微生物中筛选新抗生素，实际上是由陆地资源发掘向整个自然界的延伸，开发海洋微生物资源的意义是重大的，表现在几个方面：

（1）海洋丰富的微生物资源为新药发现提供了多样的物种基础，它的开发将使人类进一步认识自然。

（2）新抗生素由于结构与作用机制可能有别于陆生来源的抗生素，将极大的克服目前的抗药性，同时为新药的合成提供新的“母核”。

（3）微生物易于培养、发酵，可无限再生而无需过度开发野生资源。

三、实验原理：已知海洋微生物其特殊的生存环境（高盐、高压、低温、低光照和寡营养），从而可合成一些结构新颖的抗生素，抗生素可以抑制周围微生物的生长。若把这些微生物置于含有供试菌的琼脂平板上，则其周围会形成一个圆形的不长菌的透明区域，即透明圈。这样就可以选择不同类型的微生物做供试菌，来寻找能抑制该类微生物生长的抗生素产生菌。本次实验采用的是纸片扩散法，其原理为：纸片中的药物向纸片周围扩散时形成递减的浓度梯度，纸片周围的实验菌生长若受到抑制，就会形成抑菌透明圈，透明圈越大、越透明，说明实验菌对该药物越敏感，反之，则不敏感。实验时，在固体培养基表面均匀涂布实验菌后，将滤纸片平整的贴在平板表面。取适量待测样品加到滤纸中央，培养一定时间后测量透明圈直径。该方法具有直观、快速的优点，在化合物分离纯化过程中还可以用来进行活性成分的追踪。

四、实验步骤：

1、采集海水：用采水器分别采集不同海域的海水，并做好标记。

2、挑选放线菌：将采来的海水放入离心管离心后再涂布到配好的高氏一号培养基上，放入37℃的恒温培养箱中培养，待菌落长出后观察其形态。

3、放线菌纯培养：在培养基上挑出符合条件的单个菌落用划线培养的方法接种到高氏一号培养基上。

4、振荡：在生物安全柜中将固体培养基上的菌落接种到液体培养基中，然后斜放到37℃的气浴恒温振荡器中振荡。

5、离心：7天后，将振荡器中的液体培养基及放线菌倒入离心管中，放入转速为5000r/min的离心机中离心10min，。

6、纯培养敏感菌：首先将冷藏的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌复苏，然后将其分别划线培养于新制成的完全培养基上，再放入37℃的恒温培养箱中培养。

7、药敏试验：分别取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的单菌落分别划线培养于完全培养基上，然后将灭菌的滤纸片间隔贴到培养基上，并用无菌移液枪将离心过的放线菌菌液打到滤纸片上，将培养基放到37℃的恒温培养箱中培养，观察抑菌环的情况。

8、重复试验：将以上实验步骤重复以验证实验结果的准确性。

备注：1、实验过程中注意无菌操作。

2、完全培养基配方如下：材料及器材

胰蛋白胨 10g 1、试剂

K2HPO4 3g 胰蛋白胨、K2HPO4、琼脂、酵母浸膏、

琼脂 15-20g 蒸馏水、葡萄糖。1mol/LNaOH、1mol/L

pH 7.0±0.2 HCL。

酵母浸膏 5g 2、器材

葡萄糖 1g 试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、

蒸馏水 1000ml 培养基分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、

pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳或橡皮

筋、纱布等。

3、高氏一号培养基配方：

可溶性淀粉20.0g、硝酸钾1.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、氯化钠0.5g、

硫酸亚铁0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000 mL、

pH7.2～7.4。