遗传学第三章
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交变脉冲场凝胶电泳（PFGE）：1984年，Schwartz和
Centor发明；这项技术采用定时改变电场方向的交变电源， 每次电流方向改变后持续1s到5min左右，然后再改变电流方 向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。
• 正交变电场凝胶电泳（OFAGE） • 电场转换凝胶电泳（FIGE） • 等高加压均匀电场（CHEF）
Mapmaker Version 3.0
Joinmap Version 3.0
3. 遗传作图
3.3 遗传连锁是遗传作图的基础 C. 用于关联分析的软件
TASSEL
Structure
4. 物理作图
遗传图谱的局限性： 1. 遗传图谱的分辨率依赖
于所得到的交换数目； 2. 遗传图谱的准确率有限
酿酒酵母第3号染色体遗 传图谱与物理图谱的比较
• 在过去，探针必须是相当长的DNA的分子，通常至 少是40kb的克隆片段；随着荧光信号放大技术的应 用，现在最小可以检测500bp的DNA片段。
荧光原位杂交
（fluorescent in situ hybridization，FISH）
荧光原位杂交 （fluorescent in situ hybridization，FISH）
4.2 荧光原位杂交（FISH） A. 用荧光探针进行原位杂交
• 用于原位杂交的探针的标记要同时满足高灵敏度和 高分辨率两个条件，非放射性的DNA荧光标记技术 能满足这一要求。
• 现已设计出具有不同发光特性的荧光标记物，可以 将一组不同的探针与单个染色体杂交，并分辨出每 种杂交信号，从而检测出各探针的相对位置。
可用该技术构建原核生物和低等真核生物（酵母和真菌）等染色 体较小的生物的限制图谱。限制性作图不能用于大型基因组。
4.1 限制性作图
B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小
如果用普通琼脂糖凝胶电泳来分离大片段DNA分子， 电泳分辨率会大大降低。
4.1 限制性作图
B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小
B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小
稀有酶:
(1) 选用识别序列为7或8碱基的限制性内切酶进行 切割。如：Sap I (7)；Sgf I (8)。
(2) 选用识别序列所含基序在靶DNA分子中稀少的 酶。如人类基因组中，5’-CG-3’序列就比较稀少 ，如果选用Not I（5’-GCGGCCGC-3’）进行消 化，平均约10 Mb才有一个切点。
人的基因组中大约 有4x106个SNP; 绝大多数SNP是双 等位基因； 有的能形成RFLP ，绝大多数不能。
a. 通过寡核苷酸杂交分析检测SNP
寡核苷酸是在试管中合成的长度小于50 bp的DNA分子 ，在高严谨杂交条件下，寡核苷酸只有与待测DNA分子 形成完全的碱基配对时，二者才能杂交；如果有一个碱 基错配，杂交体会非常不稳定，不能形成杂交信号。
A. 限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphism，RFLP） 用限制性内切酶酶切基因组DNA时，在同一种生物的不 同个体间出现含同源序列的酶切片段长度的差异。
人的基因组中大 约有105个RFLP
确 定
R
F
L
P
的
酶切扩增多态性序列（C1eaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS）
习题：一个环状双链DNA分子，有8Kb长，用各种限 制性内切酶酶切后电泳结果如图示，请判断这一环状 DNA分子中各种内切酶的切点位置。
分子量 8Kb 4Kb 2Kb
EcoRI -
Hind III BamHI
-
-
-
E+H
-
B+H -
E+B -
多克隆位点(multiple cloning sites, MCS)：指多个限制性 内切酶的单一切点，由许多限制酶切位点组成。MCS往 往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。
• 形态标记 • 细胞学标记 • 生化标记 • DNA分子标记
所有的标记都必须具有多态性！
DNA分子标记
简称分子标记 指在DNA水平，具有相对差异的等位基因的DNA多
态性标记，是DNA水平上遗传变异的直接反映。
优点： ❖ 不受时间和环境的限制 ❖ 遍布整个基因组，数量无限 ❖ 不影响性状表达 ❖ 变异丰富，多态性好 ❖ 大部分为共显性，能鉴别纯合体和杂合体
当淬灭复合物与荧光染料相 邻时，无荧光发出；如果寡 核苷酸与待测DNA能够杂交 ，则会破坏环形结构，此时 淬灭复合物远离荧光染料， 有荧光发出。
b. 通过耐扩增突变系统检测SNP （Amplification Refractory Mutation System, ARMS）
将SNP位点引入PCR引物3’端的 最后一个碱基，直接进行PCR扩 增。 在严谨的PCR条件下，存在SNP 的引物对不能扩增出目的条带。
一种封闭探针重复序列的方法
4.2 荧光原位杂交（FISH）
B. FISH应用的局限性
• 中期染色体是高度凝聚的，每条染色体都具有可识 别的形态。
• 使用中期染色体的缺点在于，由于它的高度浓缩的 性质，只能进行低分辨率作图，两个标记间至少相 隔1 Mb才能分辨出来。
• 因此，中期染色体FISH主要用于确定新标记在染色 体上的大概位置，为更精细的作图做准备。
两
种
方
法
B. 简单重复序列
Simple sequence repeat, SSR, Microsatellite (微卫星) 指重复单位相对较小（2-6bp的基序），由于重复单位 数目的变化而形成的多态性。
SSR
人的基因组中大 约有5x105个SSR
PCR+平板PAGE 电泳
PCR+毛细管电泳
引物需要荧光标记 可获得片段的准确长度
Tm=4x(G+C)+2x(A+T) C
(1) DNA芯片技术：应用面积为2 cm2 或更小的玻璃或硅质晶片，在上面高 密度的排列着许多寡核苷酸，待测 DNA用荧光标记后与芯片杂交，再用 荧光显微镜检测，发出荧光的表明寡 核苷酸与待测DNA杂交上了。
此方法在一次实验中可以检测许多个 SNP。
(2) 液相杂交技术：在微量滴 定板的孔中进行，每个孔中 含有一种不同的寡核苷酸； 寡核苷酸的一端与荧光染料 连接，另一端与荧光淬灭复 合物连接，且其两个末端可 以形成碱基配对；
QuickTime?an d a decompres sor
are neede d to see this picture.
SSR的检测方法
C. 单核苷酸多态性
（Simple nucleotide polymorphism, SNP） 基因组中的某些位点上，有些个体只有一个核苷酸与 其它个体不同，这种分散在基因组中的单个碱基的差 异就称为SNP。
2) 部分酶解+完全酶解
完全酶解
1200bp 1000bp
部分酶解
3000bp 2200bp 1800bp 1200bp 1000bp
800bp
800bp
800bp 1000bp
* 1200bp
R
Rຫໍສະໝຸດ Baidu
部分酶解
3000bp 2200bp
3)末端标记+部分酶解
1200bp
3) 末端标记+部分酶解
4.1 限制性作图
基因组测序的两种方法
2. 遗传图谱和物理图谱
遗传图谱：指应用遗传学技术（遗传重组）构建的能在 基因组上显示基因和其它序列特征位置的线性排列 图，反映了基因或标记间的相对距离和顺序。cM
物理图谱：指应用分子生物学技术直接分析DNA分子 ，从而构建的能显示包括基因在内的序列特征位置 的图谱，它反映了基因或标记间的实际距离。 bp，kb，Mb
Chapter 3 Mapping Genomes
内容
1. 概述 2. 遗传图谱和物理图谱 3. 遗传作图 4. 物理作图
1. 概述
• 测序工作中有一个局限性：在一个测序反应中一般只 能测出1 kb左右的准确序列。这就意味着长的DNA分 子必须由一系列短的序列拼接而成，即需将大分子分 解为片段，测出每一段的序列，再用计算机寻找重叠 的部分，从而拼接成长的序列－鸟枪法（shotgun）。
3. 遗传作图
3.3 遗传连锁是遗传作图的基础
A. 遗传群体的构建
• 分离群体
P1 P2
P3
连续回交 F1
回交群体（NIL）
• 收集的品种群体
组织培养
三交群体 F2
单倍体
连续自交 染色体加倍
RIL
DH
3. 遗传作图
f2 backcross ri self
3.3 遗传连锁是遗传作图的基础
B. 用于绘制遗传图谱的软件
1) 双酶解
2.9 kb的DNA片段 EcoR I+BamH I
EcoR I BamH I
1.0 0.5
1.2
1.5 KB 1.4 KB
1.2 KB 1.0 KB 0.7 KB
E
1.2 KB 1.0 KB 0.5 KB
BE E
0.5 0.2
B
EB
0.2 KB
0.2
BE
1
2
1.0 0.5 0.2 1.2 B EB 限制酶切图谱
• 一旦得到了基因组图谱，基因组计划中的测序阶段可 以采用下面两种方法之一进行：
(1) 全基因组鸟枪法（whole-genome shotgun）：使用 基因组图谱上的显著特征为界标，指引着将用鸟枪 法获得的大量短序列拼接成主序列。
(2) 克隆重叠群法（clone contig）：将基因组打断成长 度为数百kb或数个Mb的大片段，将这些大片段定位 到基因组图谱上并拼接成重叠群，利用鸟枪法对大 片段分别测序后再进行拼接。
• 这种鸟枪法是小的原核生物测序的标准方法，但是对 于较大的真核生物基因组来说是相当困难的，特别是 当分析基因组的重复区域时会发生错误。
几十个碱基
鸟枪法组装序列
丢失 鸟枪法中遇到的问题－串联重复DNA
错误拼接 鸟枪法中遇到的问题－基因组范围内的重复
1. 概述
• 因此，必须首先建立一个基因组的图谱，通过标明基 因或其他显著特征的位置，为测序提供指导。
3. 遗传作图
3.1 基因是首先被利用的标记
• 最初的遗传图谱是在20世纪初针对果蝇等生物使用基 因作为标记构建的。
• 一个基因必须以指定一个表型的两种替换形式存在或 以等位基因形式存在，才能用于遗传学分析。比如豌 豆茎的高与矮，果蝇眼睛颜色的红与白等。
果 蝇 连 锁 图
3. 遗传作图
3.2 用于遗传学作图的遗传标记 遗传标记：可以示踪染色体、染色体某一片段、某个 基因座在家系中传递的任何一种遗传特征。
1992
4. 物理作图
物理作图的常用方法：
1) 限制性作图：在DNA分子上定位限制性内切酶酶 切位点的相对位置；
2) 荧光原位杂交（FISH）：将分子标记与完整染色 体杂交来确定标记的位置；
3) 序列标签位点（STS）作图：通过对批量的基因组 片段进行PCR和（或）杂交分析，来对短序列进 行定位作图。
正交变电场凝胶电泳
两对电极间的电场可以改变，每对电极与凝胶长度方向成45度角； 电场的每次改变都迫使DNA分子重新排列，从而提高分辨率。
4. 物理作图
4.2 荧光原位杂交（FISH）
A. 用荧光探针进行原位杂交
原位杂交是以标记的DNA分子 为探针，检测完整染色体的一 甲酰胺 种杂交分析方法。
分裂中期染色体
• 操作较繁琐，数据积累速度太慢。
4.2 荧光原位杂交（FISH）
B. FISH应用的局限性 更精细作图的两种途径：
通过荧光标记显示出DNA探针在染色体上的位置
如果探针中含有一 些重复序列，它可 能会和染色体上的 多个位点发生非特 异性杂交； 因此，探针在使用 前要和来自被研究 组织中的未标记 DNA混合； 用于混合的未标记 DNA可以是总的 核DNA，但最好 是富含重复序列的 DNA片段。
这时探针只与特异序列发生杂交
B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小
• 如果使用的限制酶在DNA上切点相对较少，构建限 制性图谱就比较容易。
• 限制性作图更适用于小分子。如果DNA分子小于50 kb，通常选用6碱基识别序列的限制性酶来构建限 制图谱。
• 对于大于50 kb的DNA分子，可以选用“稀有酶” 进行构建。
4.1 限制性作图
4. 物理作图
4.1 限制性作图 （Restriction mapping）
4.1 限制性作图
A. 限制性作图的基本方法
1) 双酶解（double digest） Key：分析重叠片段
2) 部分酶解+完全酶解：比较分析这两种情况下的片 段大小。
3) 末端标记+部分酶解 a) 利用放射性的同位素标记DNA的3’端或5’端 b) 部分酶解 c) 放射自显影
Centor发明；这项技术采用定时改变电场方向的交变电源， 每次电流方向改变后持续1s到5min左右，然后再改变电流方 向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。
• 正交变电场凝胶电泳（OFAGE） • 电场转换凝胶电泳（FIGE） • 等高加压均匀电场（CHEF）
Mapmaker Version 3.0
Joinmap Version 3.0
3. 遗传作图
3.3 遗传连锁是遗传作图的基础 C. 用于关联分析的软件
TASSEL
Structure
4. 物理作图
遗传图谱的局限性： 1. 遗传图谱的分辨率依赖
于所得到的交换数目； 2. 遗传图谱的准确率有限
酿酒酵母第3号染色体遗 传图谱与物理图谱的比较
• 在过去，探针必须是相当长的DNA的分子，通常至 少是40kb的克隆片段；随着荧光信号放大技术的应 用，现在最小可以检测500bp的DNA片段。
荧光原位杂交
（fluorescent in situ hybridization，FISH）
荧光原位杂交 （fluorescent in situ hybridization，FISH）
4.2 荧光原位杂交（FISH） A. 用荧光探针进行原位杂交
• 用于原位杂交的探针的标记要同时满足高灵敏度和 高分辨率两个条件，非放射性的DNA荧光标记技术 能满足这一要求。
• 现已设计出具有不同发光特性的荧光标记物，可以 将一组不同的探针与单个染色体杂交，并分辨出每 种杂交信号，从而检测出各探针的相对位置。
可用该技术构建原核生物和低等真核生物（酵母和真菌）等染色 体较小的生物的限制图谱。限制性作图不能用于大型基因组。
4.1 限制性作图
B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小
如果用普通琼脂糖凝胶电泳来分离大片段DNA分子， 电泳分辨率会大大降低。
4.1 限制性作图
B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小
B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小
稀有酶:
(1) 选用识别序列为7或8碱基的限制性内切酶进行 切割。如：Sap I (7)；Sgf I (8)。
(2) 选用识别序列所含基序在靶DNA分子中稀少的 酶。如人类基因组中，5’-CG-3’序列就比较稀少 ，如果选用Not I（5’-GCGGCCGC-3’）进行消 化，平均约10 Mb才有一个切点。
人的基因组中大约 有4x106个SNP; 绝大多数SNP是双 等位基因； 有的能形成RFLP ，绝大多数不能。
a. 通过寡核苷酸杂交分析检测SNP
寡核苷酸是在试管中合成的长度小于50 bp的DNA分子 ，在高严谨杂交条件下，寡核苷酸只有与待测DNA分子 形成完全的碱基配对时，二者才能杂交；如果有一个碱 基错配，杂交体会非常不稳定，不能形成杂交信号。
A. 限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphism，RFLP） 用限制性内切酶酶切基因组DNA时，在同一种生物的不 同个体间出现含同源序列的酶切片段长度的差异。
人的基因组中大 约有105个RFLP
确 定
R
F
L
P
的
酶切扩增多态性序列（C1eaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS）
习题：一个环状双链DNA分子，有8Kb长，用各种限 制性内切酶酶切后电泳结果如图示，请判断这一环状 DNA分子中各种内切酶的切点位置。
分子量 8Kb 4Kb 2Kb
EcoRI -
Hind III BamHI
-
-
-
E+H
-
B+H -
E+B -
多克隆位点(multiple cloning sites, MCS)：指多个限制性 内切酶的单一切点，由许多限制酶切位点组成。MCS往 往是人工合成的一段外源基因的插入部位的DNA序列。
• 形态标记 • 细胞学标记 • 生化标记 • DNA分子标记
所有的标记都必须具有多态性！
DNA分子标记
简称分子标记 指在DNA水平，具有相对差异的等位基因的DNA多
态性标记，是DNA水平上遗传变异的直接反映。
优点： ❖ 不受时间和环境的限制 ❖ 遍布整个基因组，数量无限 ❖ 不影响性状表达 ❖ 变异丰富，多态性好 ❖ 大部分为共显性，能鉴别纯合体和杂合体
当淬灭复合物与荧光染料相 邻时，无荧光发出；如果寡 核苷酸与待测DNA能够杂交 ，则会破坏环形结构，此时 淬灭复合物远离荧光染料， 有荧光发出。
b. 通过耐扩增突变系统检测SNP （Amplification Refractory Mutation System, ARMS）
将SNP位点引入PCR引物3’端的 最后一个碱基，直接进行PCR扩 增。 在严谨的PCR条件下，存在SNP 的引物对不能扩增出目的条带。
一种封闭探针重复序列的方法
4.2 荧光原位杂交（FISH）
B. FISH应用的局限性
• 中期染色体是高度凝聚的，每条染色体都具有可识 别的形态。
• 使用中期染色体的缺点在于，由于它的高度浓缩的 性质，只能进行低分辨率作图，两个标记间至少相 隔1 Mb才能分辨出来。
• 因此，中期染色体FISH主要用于确定新标记在染色 体上的大概位置，为更精细的作图做准备。
两
种
方
法
B. 简单重复序列
Simple sequence repeat, SSR, Microsatellite (微卫星) 指重复单位相对较小（2-6bp的基序），由于重复单位 数目的变化而形成的多态性。
SSR
人的基因组中大 约有5x105个SSR
PCR+平板PAGE 电泳
PCR+毛细管电泳
引物需要荧光标记 可获得片段的准确长度
Tm=4x(G+C)+2x(A+T) C
(1) DNA芯片技术：应用面积为2 cm2 或更小的玻璃或硅质晶片，在上面高 密度的排列着许多寡核苷酸，待测 DNA用荧光标记后与芯片杂交，再用 荧光显微镜检测，发出荧光的表明寡 核苷酸与待测DNA杂交上了。
此方法在一次实验中可以检测许多个 SNP。
(2) 液相杂交技术：在微量滴 定板的孔中进行，每个孔中 含有一种不同的寡核苷酸； 寡核苷酸的一端与荧光染料 连接，另一端与荧光淬灭复 合物连接，且其两个末端可 以形成碱基配对；
QuickTime?an d a decompres sor
are neede d to see this picture.
SSR的检测方法
C. 单核苷酸多态性
（Simple nucleotide polymorphism, SNP） 基因组中的某些位点上，有些个体只有一个核苷酸与 其它个体不同，这种分散在基因组中的单个碱基的差 异就称为SNP。
2) 部分酶解+完全酶解
完全酶解
1200bp 1000bp
部分酶解
3000bp 2200bp 1800bp 1200bp 1000bp
800bp
800bp
800bp 1000bp
* 1200bp
R
Rຫໍສະໝຸດ Baidu
部分酶解
3000bp 2200bp
3)末端标记+部分酶解
1200bp
3) 末端标记+部分酶解
4.1 限制性作图
基因组测序的两种方法
2. 遗传图谱和物理图谱
遗传图谱：指应用遗传学技术（遗传重组）构建的能在 基因组上显示基因和其它序列特征位置的线性排列 图，反映了基因或标记间的相对距离和顺序。cM
物理图谱：指应用分子生物学技术直接分析DNA分子 ，从而构建的能显示包括基因在内的序列特征位置 的图谱，它反映了基因或标记间的实际距离。 bp，kb，Mb
Chapter 3 Mapping Genomes
内容
1. 概述 2. 遗传图谱和物理图谱 3. 遗传作图 4. 物理作图
1. 概述
• 测序工作中有一个局限性：在一个测序反应中一般只 能测出1 kb左右的准确序列。这就意味着长的DNA分 子必须由一系列短的序列拼接而成，即需将大分子分 解为片段，测出每一段的序列，再用计算机寻找重叠 的部分，从而拼接成长的序列－鸟枪法（shotgun）。
3. 遗传作图
3.3 遗传连锁是遗传作图的基础
A. 遗传群体的构建
• 分离群体
P1 P2
P3
连续回交 F1
回交群体（NIL）
• 收集的品种群体
组织培养
三交群体 F2
单倍体
连续自交 染色体加倍
RIL
DH
3. 遗传作图
f2 backcross ri self
3.3 遗传连锁是遗传作图的基础
B. 用于绘制遗传图谱的软件
1) 双酶解
2.9 kb的DNA片段 EcoR I+BamH I
EcoR I BamH I
1.0 0.5
1.2
1.5 KB 1.4 KB
1.2 KB 1.0 KB 0.7 KB
E
1.2 KB 1.0 KB 0.5 KB
BE E
0.5 0.2
B
EB
0.2 KB
0.2
BE
1
2
1.0 0.5 0.2 1.2 B EB 限制酶切图谱
• 一旦得到了基因组图谱，基因组计划中的测序阶段可 以采用下面两种方法之一进行：
(1) 全基因组鸟枪法（whole-genome shotgun）：使用 基因组图谱上的显著特征为界标，指引着将用鸟枪 法获得的大量短序列拼接成主序列。
(2) 克隆重叠群法（clone contig）：将基因组打断成长 度为数百kb或数个Mb的大片段，将这些大片段定位 到基因组图谱上并拼接成重叠群，利用鸟枪法对大 片段分别测序后再进行拼接。
• 这种鸟枪法是小的原核生物测序的标准方法，但是对 于较大的真核生物基因组来说是相当困难的，特别是 当分析基因组的重复区域时会发生错误。
几十个碱基
鸟枪法组装序列
丢失 鸟枪法中遇到的问题－串联重复DNA
错误拼接 鸟枪法中遇到的问题－基因组范围内的重复
1. 概述
• 因此，必须首先建立一个基因组的图谱，通过标明基 因或其他显著特征的位置，为测序提供指导。
3. 遗传作图
3.1 基因是首先被利用的标记
• 最初的遗传图谱是在20世纪初针对果蝇等生物使用基 因作为标记构建的。
• 一个基因必须以指定一个表型的两种替换形式存在或 以等位基因形式存在，才能用于遗传学分析。比如豌 豆茎的高与矮，果蝇眼睛颜色的红与白等。
果 蝇 连 锁 图
3. 遗传作图
3.2 用于遗传学作图的遗传标记 遗传标记：可以示踪染色体、染色体某一片段、某个 基因座在家系中传递的任何一种遗传特征。
1992
4. 物理作图
物理作图的常用方法：
1) 限制性作图：在DNA分子上定位限制性内切酶酶 切位点的相对位置；
2) 荧光原位杂交（FISH）：将分子标记与完整染色 体杂交来确定标记的位置；
3) 序列标签位点（STS）作图：通过对批量的基因组 片段进行PCR和（或）杂交分析，来对短序列进 行定位作图。
正交变电场凝胶电泳
两对电极间的电场可以改变，每对电极与凝胶长度方向成45度角； 电场的每次改变都迫使DNA分子重新排列，从而提高分辨率。
4. 物理作图
4.2 荧光原位杂交（FISH）
A. 用荧光探针进行原位杂交
原位杂交是以标记的DNA分子 为探针，检测完整染色体的一 甲酰胺 种杂交分析方法。
分裂中期染色体
• 操作较繁琐，数据积累速度太慢。
4.2 荧光原位杂交（FISH）
B. FISH应用的局限性 更精细作图的两种途径：
通过荧光标记显示出DNA探针在染色体上的位置
如果探针中含有一 些重复序列，它可 能会和染色体上的 多个位点发生非特 异性杂交； 因此，探针在使用 前要和来自被研究 组织中的未标记 DNA混合； 用于混合的未标记 DNA可以是总的 核DNA，但最好 是富含重复序列的 DNA片段。
这时探针只与特异序列发生杂交
B. 限制性作图的规模受限于限制性片段的大小
• 如果使用的限制酶在DNA上切点相对较少，构建限 制性图谱就比较容易。
• 限制性作图更适用于小分子。如果DNA分子小于50 kb，通常选用6碱基识别序列的限制性酶来构建限 制图谱。
• 对于大于50 kb的DNA分子，可以选用“稀有酶” 进行构建。
4.1 限制性作图
4. 物理作图
4.1 限制性作图 （Restriction mapping）
4.1 限制性作图
A. 限制性作图的基本方法
1) 双酶解（double digest） Key：分析重叠片段
2) 部分酶解+完全酶解：比较分析这两种情况下的片 段大小。
3) 末端标记+部分酶解 a) 利用放射性的同位素标记DNA的3’端或5’端 b) 部分酶解 c) 放射自显影