第7章 亲和层析共56页文档
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第七章亲和层析
特定抗原
酶 受体、结合蛋白 脱氢酶、激酶、干扰素、聚合酶、限制酶等 凝聚因子、脂酶、某些蛋白酶、DNA聚合酶 等 糖蛋白
对应单克隆或多克隆抗体
对应底物、辅酶、抑制剂 对应信号分子、效应物 染料配体 肝素 凝集素、苯基硼酸盐
高
高 高 低 低 低
凝集素、糖苷酶
核酸
对应糖
核酸结合蛋白、互补链
高
高
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
用于制备亲和吸附剂的配体应满足亲和性、特异性要 求;当偶联到载体上时,不妨碍其与目标分子的结合;在 将配体固定化时，应保证其与载体形成稳定的共价键， 不至于从载体上脱落下来.
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
亲和层析中的合适配体
待纯化的生物分子 特定抗体 抗体/免疫球蛋白 配体 对应抗原 蛋白质A/蛋白质G 特异性 高 低
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第七章 亲和层析 第二节 亲和层析配体
二、亲和配体的类型 亲和配体主要分为专一性小分子配体、基团特异性小 分子配体、专一性大分子配体和基团特异性大分子配 体。 专一性小分子配体包括固醇类激素、维生素和特定酶 抑制剂等 . 基团特异性小分子配体的种类最多，包括许多酶的辅 助因子及其类似物，以及仿生染料、硼酸衍生物和许 多氨基酸、维生素等
将配体固定化到载体上后，需检测一下配体的浓度， 以判断偶联过程成功与否。测定偶联上的配体的浓度 有这样几种方法： 1）差示分析法：用加入的配体量减去洗脱液中游离 配体量，即可得出偶联上的配体量。
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
2）直接测定法：直接测定制备好的亲和吸附剂上配 体的浓度。可以根据配体的性质用分光光度法、蛋白 质测定方法或特定基团测定方法来测定。 3）放射分析法：对于具有放射活性的配体，可以很 灵敏地测出固相化配体的浓度。 4）水解法：当配体的测定不受大量的载体水解产物 干扰时，可以用此法测定亲和吸附剂上配体的浓度。 水解的方法可视配体、载体的偶联情况而定，可以采 用酸水解或酶水解。
第7章亲和层析
结合能力的测定
06.05.2021
用溴化氰活化载体
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06.05.2021
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四、特异性吸附
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时， 配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲 和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的 复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影 响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。
物大分子之间的亲和力。
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专一性结合的生物体系
常用配体
分离对象
酶蛋白
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等
抗体
抗原、病毒、细胞
外源凝集素 核酸 激素及维生素
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
细胞
06.05.2021
利用生物大分 子和固定相表面 存在某种特异性 吸附而进行选择 性分离的一种生 物大分子分离的 层析方法。
06.05.2021
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亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一 般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激 素等）组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特性 的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析 柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
亲和层析应用
一、纯化特异性生物分子
1.纯化抗原、抗体及其结合物； 2.分离糖蛋白、各种凝集素； 3.含巯基蛋白质的分离； 4.用寡聚核苷酸分离核酸； 5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。
06.05.2021
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第7章 亲和层析
Anhui University of Technology and Science
第七章 亲和层析
Teaching and Rese
arch Section ·
Department of
Biochemical
Engineering
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7.2.4 配体的选择
7.2.4.2 配体的类型 •通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的 蛋白质等生物大分子结合的配体，
•如各种凝集素可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合 RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分 子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的 洗脱条件也可以得到很高的分辨率。
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第七章 亲和层析
Teaching and Rese
• 疏水性连接臂会对样品产生非特异性吸附，若非必 要，应尽量避免接入连接臂，或选择可自动引入连 接臂的活化方法，或选择接好连接臂的商品化载体 。
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第七章 亲和层析
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第七章 亲和层析
赵世光 生物化学工程系·生物技术教研室
第一节 概述
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第七章 亲和层析
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Biochemical
Engineering
层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定
第七章层析
tR′ = tR - t0 ⑥校正保留体积VR′ 扣除死体积后的保留体积称为校
正保留体积（或调整保留体积）；其定义式为：
VR′ = VR–V0
VR′与tR′之间的关系为：
VR′ = tR′ Fc
死体积V0反映了色谱柱的几何特性，它与被测物质的性
质无关。保留体积VR中扣除死体积V0后，即校正保留体积
VR′，将更合理地反映被测组分的保留特点。
第一节 层析的基本原理及分类
2．阻滞因数或比移值Rf
在色谱柱（纸、板）中，溶质的移动速度与流动相的移 动速度之比，称为阻滞因数或比移值Rf，其定义式可写为：
R f 溶 质 （ 流 浓 动 度 相 中 的 心 移 ） 动 的 速 移 度 动 速 度 在 同 溶 一 质 时 （ 间 浓 流 度 动 中 相 心 前 ） 沿 的 的 移 移 动 动 距 距 离 离 ( r ) ( R )
分离度R综合考虑了保留值的差值与峰宽两方面的因素
对柱效率的影响，可衡量色谱柱的总分离效能。
第一节 层析的基本原理及分类
根据分离度R的大小可 以判断被物质在色谱柱中
的分离情况；R值越大，两
色谱峰的距离越远，分离 效果就越好，如图7-5所示。 当R<1时，两峰有部分重叠； 当R = 1时，两峰有98%的 分离；当R = 1.5时，分离 程度可达99.7%；一般用R = 1.5作为相邻两峰完全分 离的标志。
第一节 层析的基本原理及分类
2．固定相的形状
根据固定相或层析装置形状的不同，液相层析法又分纸 层 析 法 ( Paper chromatography)、 薄 层 层 析 法 ( Thin—1ayer chromatography)和柱层析法(Column chromatography)。纸层 析和薄层层析多用于分析目的，而柱层析易于放大，适用于 大量制备分离，是主要的层析分离手段。
亲和层析
Fig5 . Principle of preparing AC media来自 第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（
Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.
2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择 性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。 形成杂质峰（见下图）。
3： 基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架 。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及 寻求稳定的层析条件。
( Fig1. Mechanism of AC)
( Fig2. Mechanism of AC)
具有特异性亲和作用的生物分子 四：配基的种类:(sorts of ligand)
1：抗原与抗体。 2：DNA与互补DNA或RNA（cDNA、 mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。 2：颗粒均匀，具有良好的流速。 3：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。 4：在温和的条件下 能与配基共价偶联。
亲和层析载体的性质与选择 六：常用的亲和层析载体：
第一节： 亲和层析（Affinity Chromatography）的基本概念及特点： 一、 基本概念：(basic concept)： 1： 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基
第七章亲和层析技术概论
• 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 • 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱
困难。 • 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
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（三）、配基偶联的位置
• 配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。
• AMP-Sepharose亲和柱 • 腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对
脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 • 磷酸基接到载体上，对甘油醛-
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四、 载体的活化与偶联
• 糖类载体的活化与偶联 • 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物
活化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）、糖类载体活化与偶联
• 溴化氰活化法 • 高碘酸氧化法 • 环氧化法 • 甲苯磺酰氯法 • 双功能试剂法
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• 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
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亲和吸附剂：载体—配基
• 在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。
• 与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。
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一、亲和层析的原理
• （1）配基固定化：配基
与载体偶联，结合成具有 特异亲和性的分离介质。
3-磷酸脱氢酶有吸附力。
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（四）、配基分子的大小
• 选用大分子配基。
• 甘氨酸
• 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
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（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配
困难。 • 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
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（三）、配基偶联的位置
• 配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。
• AMP-Sepharose亲和柱 • 腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对
脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 • 磷酸基接到载体上，对甘油醛-
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四、 载体的活化与偶联
• 糖类载体的活化与偶联 • 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物
活化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）、糖类载体活化与偶联
• 溴化氰活化法 • 高碘酸氧化法 • 环氧化法 • 甲苯磺酰氯法 • 双功能试剂法
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• 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
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亲和吸附剂：载体—配基
• 在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。
• 与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。
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一、亲和层析的原理
• （1）配基固定化：配基
与载体偶联，结合成具有 特异亲和性的分离介质。
3-磷酸脱氢酶有吸附力。
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（四）、配基分子的大小
• 选用大分子配基。
• 甘氨酸
• 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
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（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配
第7章 亲和层析
2.基质种类
纤维素 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺－琼脂糖凝胶（ACA,Ultrogel） 交联葡聚糖 琼脂糖 交联琼脂糖 应用最多Sepharose 4B 多孔玻璃珠（CPG，Bio-Glass） 其它新型载体
二、配体（基）(ligand）的选择
1、纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 2、亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的 条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 3、配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生 物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响 配基与生物分子之间的亲和力
第一节 基本原理
欲分离的大分子物质S和相对应的专一物质 L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离 的络合物L—S，其中的L又能与活化的基质M 之间能可逆地结合与解离的原理发 展起来的层析法。
亲和层析的特点：
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大 分子
3、特殊性洗脱
亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载 体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。
实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法
六、亲和层析柱的再生
七、应用实例
上样
平衡
洗脱
亲和层析分离GST示意图
3、纯化倍数大，产物纯度高
4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析 条件，因此应用范围受到一定的限制
具有特异性亲和作用的生物分子
抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体
维生素与其特异性结合蛋白
糖蛋白与其相应的植物凝集素
2、专一性洗脱
7 亲和层析
②根据配体的特性进行测定 首先用适当的方法将配体和基质分离开， 首先用适当的方法将配体和基质分离开，然后根据各 种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下， 种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下， 用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照， 用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照，计 算出配体的含量） 算出配体的含量）
四、特异性吸附
当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时， 当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时，欲分离的大分子物 质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入， 质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入，复合物 的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在， 的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在，使样品中有效成分的移动 受到阻碍，从而形成紧密的复合物带， 受到阻碍，从而形成紧密的复合物带，由于不同组分与吸附剂的结合能力不 同，所以可得到分离和纯化 样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力有关 样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力有关 亲合力 还与样品的pH值 离子强度和反应时间有关 外，还与样品的 值、离子强度和反应时间有关 例1 图7-6，Sepharose-έ氨基乙酰 色氨酸甲酯亲和层析研究发现 ， 氨基乙酰-D色氨酸甲酯亲和层析研究发现 氨基乙酰 条件下， ①在高pH条件下，吸附剂对 胰凝乳蛋白酶的吸附量大 在高 条件下 吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量大 ②在高离子强度条件下，吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量小 在高离子强度条件下，吸附剂对 胰凝乳蛋白酶的吸附量小 亲和层析柱分离γ-球蛋白时 例2 用Con.A-Sepharose亲和层析柱分离 球蛋白时，上样后反应 比3h 亲和层析柱分离 球蛋白时，上样后反应1h比 得率高
第七章亲和层析技术资料
基。
• 特殊配基（special ligand）
2020/10/10
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通用配基（general ligand）
• 用于一类物质的分离提纯。 • 用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配
基； • 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； • 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时
的通用配基等。
特殊配基（specific ligand）
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（二）、常用载体
• 纤维素 (cellulose)
• 琼脂糖凝胶
• 葡聚糖凝胶
• 聚丙烯酰胺凝胶
• 多孔玻璃珠（Bio-Glass）
• 其它载体——Ultrogels ACA、
•
magnogels ACA44
2020/10/10
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1、纤维素
• 纤维素结构紧密、均一性差，不利于大 分子的渗入。
2020/10/10
2
亲和纯化技术
• 亲和层析(Affinity chromatography) • 亲和过滤（膜分离） • 亲和分配（双水相萃取） • 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） • 亲和沉淀（沉淀） • 亲和电泳（电泳）
2020/10/10
3
亲和层析 (affinity Chromatography)
12
• 5、多孔玻璃珠：
• 化学与物理稳定性较好，机械强度高。 • 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱
性蛋白质有非特异性吸附，化学活性基 团少。
• 6、其它载体(p147)
2020/10/10
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三 、 亲和配基
• 理想配基的特点(p149)* • 配基的选择 • 配基的浓度 • 配基偶联的位置 • 配基分子的大小 • 配基的类型
• 特殊配基（special ligand）
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通用配基（general ligand）
• 用于一类物质的分离提纯。 • 用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配
基； • 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； • 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时
的通用配基等。
特殊配基（specific ligand）
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（二）、常用载体
• 纤维素 (cellulose)
• 琼脂糖凝胶
• 葡聚糖凝胶
• 聚丙烯酰胺凝胶
• 多孔玻璃珠（Bio-Glass）
• 其它载体——Ultrogels ACA、
•
magnogels ACA44
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1、纤维素
• 纤维素结构紧密、均一性差，不利于大 分子的渗入。
2020/10/10
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亲和纯化技术
• 亲和层析(Affinity chromatography) • 亲和过滤（膜分离） • 亲和分配（双水相萃取） • 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） • 亲和沉淀（沉淀） • 亲和电泳（电泳）
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亲和层析 (affinity Chromatography)
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• 5、多孔玻璃珠：
• 化学与物理稳定性较好，机械强度高。 • 缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱
性蛋白质有非特异性吸附，化学活性基 团少。
• 6、其它载体(p147)
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三 、 亲和配基
• 理想配基的特点(p149)* • 配基的选择 • 配基的浓度 • 配基偶联的位置 • 配基分子的大小 • 配基的类型
第七章 亲和层析技术
第2章亲和层析1 亲和分离技术概论利用生物分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和分离技术。
在该技术中，亲和分离过程是通过引入亲和配基得以实现的（如图2-1）。
所谓亲和配基，是指具有对生物分子专一识别性或特异相互作用的物质。
将亲和配基固定在不同的介质上，可得到不同的亲合分离技术，如固定在层析介质上，达到专一性层析分离的技术称为亲和层析技术。
将亲和配基接在分离膜上，得到亲和膜分离技术。
图2-1：亲和分离过程的示意图生物分子之间的亲和识别包括抗体和抗原、酶和底物、激素和受体等之间的亲合作用，这些亲和作用属于生物专一性识别；此外，某些物质和生物大分子之间还有一些特异性作用，如染料和某些酶（特别是脱氢酶和激酶等），植物凝集素和糖蛋白，金属离子和蛋白质表面的组氨酸等之间的作用，都可以应用于亲和分离过程。
根据以上两种亲和作用的不同，可将亲和配基按其来源分为二类：生物特异性配基，如抗体、NAD、AMP等和拟生物亲和配基，如染料、金属离子等。
表2-1常见亲和层析的命名作用原理以及它们的相关应用的专一性识别或特异性作用，必须是可逆的。
(2)配基与被分离的生物大分子之间要有足够高的结合常数，能形成稳定的复合物；但同时结合又不能太强，当外界条件适当的改变，且不使待分离的目的大分子变性时，就可将复合分子解离，使目标分子和配基分离，同时亲和配基得以再生。
(3)能够进行一定的化学改性，易于固定在层析介质或其他分离介质上。
且固定到分离介质上之后，配基的专一性识别或特异性作用不发生明显的变化。
目前，亲和分离技术众多，命名方法也很多。
一般而言，常根据配基的名称和所使用技术的名称组合来命名，如固定化金属离子亲和膜技术、染料亲和层析等。
现将常用的亲和层析技术名称、原理和应用简单的列如表2-1：1.1 亲和配基在亲和分离技术中，亲和配基起着举足轻重的作用。
亲和配基的专一性和特异性，决定着分离纯化时所得产品的纯度，亲和配基与目标分子之间作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度，影响它们的使用范围。
亲和层析
活化凝胶
以偶联时所用的缓冲液洗涤，立即将凝胶放入含 有偶联化合物(配基)的缓冲液中，在4 ℃慢慢搅拌
12小时
偶联的亲和层析吸附剂
活化过程要注意的问题： (1)溴化氰有毒，操作时应注意通风； (2)活化过程会产生大量的热，除加溴化 氰活化载体的过程需在30 ℃反应外，其 他过程均需在冰浴中进行 ； (3)偶联反应后应尽量除净载体上的活化 基团 。 除去载体上的活化基团可用乙醇胺或1－ 氨基－丙烷－2，3－二醇搅拌10小时左右。 然后用水、2mol/L氯化钾依次洗涤后，用 水将氯化钾洗净。
琼脂糖的酰肼衍生物 溴化氰活化琼脂糖在偶联胺类化合物 时形成N－取代的异脲键，仍保留有 氨基的碱性。当介质的pH低于氨基的 pK时，氨基上带有正电荷，使琼脂糖 凝胶衍生物具有了离子交换层析的性 质，增加了非特异性吸附。这一现象 可用制备成酰肼的衍生物而加以解决。
第二步：
处理后的凝胶
2L水室温洗涤。加入0.1mol/L氢氧化钠24 ℃保温
30～40分钟
凝胶
2L水及1L无水二氧六环洗涤脱水后，悬浮在200ml 二氧六环中，加入0.1mol/L的固体N－羟基琥珀酸亚 胺及0.1mol碳二亚胺，室温振摇90分钟，用二氧六 环洗，
亲和吸附剂
偶氮键的偶联：琼脂糖凝胶或其 他载体的偶氮衍生物可以与含有 酚或咪唑基的配基偶联。
每毫升凝胶加80～100μmol叠氮(对位硝基苯甲酰叠氮溶解在二甲 基甲酰胺中，配成0.1mol/L)， 5℃搅拌1小时，室温继续反应3～4 小时。 50％二甲基甲酰胺洗涤后用水洗。悬于0.2mol/L的连二亚硫酸钠 溶液中(用0.5mol/L碳酸氢钠pH8.5配制),混合物在40℃保持1～2小 时，过滤后水洗
2013年8月4日星期日 11
《亲和层析》幻灯片
固定化金属离子亲和层析
• 1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯 合亲和层析(Immobilized MetalChelated Affinity Chromatography)〞 的概念，首次成功地在琼脂糖上偶联了螯 合剂亚氨基二乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与 金属离子如Cu++螯合后，可与生物分子如 蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结 合力不同，从而将蛋白质别离。
• 染料配体与很多蛋白以及酶的活性位点相互作用， 以模仿这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂 的形式进展。
四、亲和层析载体
载体在亲和层析中的作用：使配体固定化、 提供结合的空间环境
〔一〕亲和层析对载体〔基质〕的要求 极低的非特异吸附性 大量的化学基团能被有效的活化，而且容易和配体
结合 有较好的理化稳定性和生物惰性 有高度的水不溶性和亲水性。载体的亲水性往往是
亲和力
• 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑 制剂、激素－受体等等，它们之间都能够 专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲 和力。
固相化 (Immobilise)
配体Ligand:亲和层析中能被某一生 物大分子识别和可逆结合的生物专一性物 质。即被固定在基质上的分子称为配体。
• 特异性配体：一般是指只与单一或很少种类的蛋 白质等生物大分子结合的配体。配体一般为复杂 的生命大分子物质〔如抗体、受体和酶的类似底 物等〕，它具有较强的吸附选择性和较大的结合 力。
• 通用性配体：一般是指特异性不是很强，能和某 一类的蛋白质等生物大分子结合的配体。配体一 般为简单的小分子物质〔如金属、染料、以及氨 基酸等〕，它本钱低廉，具有较高的吸附容量。
《亲和层析》幻灯片
第七章 层析分离技术(4)亲和层析
7.4 亲和层析
三、亲和层析的操作过程
洗脱(elution)
按洗脱机理可分为：
（1）竞争性洗脱：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的 小分子化合物为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗 脱目标物。
例1：t-PA亲和层析，赖氨酸和精氨酸均为其抑制剂； 例2：带有His标签的蛋白质的金属鳌和亲和层析，用咪唑溶液为洗脱剂）
样品需进行预处理：通过离心或超滤除去微小颗粒； 缓冲液离子强度： 载体活化时引入一些带基团，低离子强度下，树脂对杂质的静电作用较 强，因此，提高盐浓度可减少杂质的非特异性吸附； 在离子强度太高的情况下，由于间隔臂上的碳氢链疏水性增强，也可能 产生非特异性吸附 因此，缓冲液的离子强度应适中（100~500mmol/L）
第七章 层析分离技术（4）
本章内容
7.1 层析技术导论 7.2 凝胶过滤层析 7.3 离子交换层析 7.4 亲和层析 7.5 固定金属离子亲和层析 7.6 疏水作用层析 7.7 反相层析
7.4 亲和层析
一、基本原理及特点 二、亲和层析的基本组成 三、亲和层析的操作过程 四、亲和层析存在的问题 五、举例：利用谷胱甘肽-亲和层析树脂 纯化GST-融合蛋白
(1)溴化氰法
溴化氰在碱性条件下与多糖上的羟基反应导入氰酯键或亚氨碳酸酯 到基质上,进而与配基偶联。
优点: （1）适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质 （2）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联 （3）操作步骤简单,重现性好。 （4）偶联条件温和,特别适用于偶联敏感性生物大分子。 缺点： （1）形成的异脲键易产生非特异性吸附, （2）共价键不稳定,配基容易脱落, （3）活化操作危险性大（CNBr为剧毒药品，操作需在通风橱中进 行），反应后的残余液需经处理再排放。
《亲和层析》课件
固定相可以是蛋白质、核酸、多糖等生物 大分子
流动相可以是缓冲液、有机溶剂等
亲和层析可以分离纯化生物大分子，如蛋 白质、核酸、多糖等
亲和层析的应用广泛，如蛋白质纯化、药 物筛选、生物检测等
03
亲和层析的实验流 程
亲和层析的实验准备
材料准备：亲和 层析柱、缓冲液、 样品、洗脱液等
设备准备：层析 仪、离心机、紫 外分光光度计等
亲和层析的应用领域
生物制药：分离 纯化蛋白质、多 肽等生物大分子
食品工业：分离 纯化食品添加剂、 天然色素等
环境监测：分离 纯化重金属离子、 有机污染物等
化学分析：分离 纯化有机化合物、 无机化合物等
亲和层析的基本原理
亲和层析是一种分离纯化生物大分子的方 法
原理：利用生物大分子与固定相之间的亲 和力进行分离
06
亲和层析的发展趋 势和展望
亲和层析技术的未来发展方向
提高分离效率：通过改进亲和层 析技术，提高分离效率，降低成 本
智能化发展：结合人工智能技术， 实现亲和层析的自动化、智能化
添加标题
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添加标题
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扩大应用领域：将亲和层析技术 应用于更多领域，如生物制药、 食品加工等
环保化发展：采用环保材料和工 艺，降低对环境的影响，实现可 持续发展
亲和层析在生物医药领域的应用
蛋白质纯化： 分离、纯化蛋 白质，提高纯
度
药物筛选：筛 选药物，提高 药物研发效率
疫苗生产：分 离、纯化疫苗， 提高疫苗质量
诊断试剂：制 备诊断试剂， 提高诊断准确
性
亲和层析在环境监测领域的应用
土壤监测：检测土壤中的污 染物，如农药残留、重金属 等
大气监测：检测大气中的污 染物，如二氧化硫、氮氧化
流动相可以是缓冲液、有机溶剂等
亲和层析可以分离纯化生物大分子，如蛋 白质、核酸、多糖等
亲和层析的应用广泛，如蛋白质纯化、药 物筛选、生物检测等
03
亲和层析的实验流 程
亲和层析的实验准备
材料准备：亲和 层析柱、缓冲液、 样品、洗脱液等
设备准备：层析 仪、离心机、紫 外分光光度计等
亲和层析的应用领域
生物制药：分离 纯化蛋白质、多 肽等生物大分子
食品工业：分离 纯化食品添加剂、 天然色素等
环境监测：分离 纯化重金属离子、 有机污染物等
化学分析：分离 纯化有机化合物、 无机化合物等
亲和层析的基本原理
亲和层析是一种分离纯化生物大分子的方 法
原理：利用生物大分子与固定相之间的亲 和力进行分离
06
亲和层析的发展趋 势和展望
亲和层析技术的未来发展方向
提高分离效率：通过改进亲和层 析技术，提高分离效率，降低成 本
智能化发展：结合人工智能技术， 实现亲和层析的自动化、智能化
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扩大应用领域：将亲和层析技术 应用于更多领域，如生物制药、 食品加工等
环保化发展：采用环保材料和工 艺，降低对环境的影响，实现可 持续发展
亲和层析在生物医药领域的应用
蛋白质纯化： 分离、纯化蛋 白质，提高纯
度
药物筛选：筛 选药物，提高 药物研发效率
疫苗生产：分 离、纯化疫苗， 提高疫苗质量
诊断试剂：制 备诊断试剂， 提高诊断准确
性
亲和层析在环境监测领域的应用
土壤监测：检测土壤中的污 染物，如农药残留、重金属 等
大气监测：检测大气中的污 染物，如二氧化硫、氮氧化
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细胞表面特异性蛋白、外源凝集素
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蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 抗原
待纯化的蛋白质
特定单克隆抗体或多 克隆抗体
单克隆抗体
特定抗原
蛋白质A/蛋 白质G
蛋白酶抑制剂
免疫球蛋白 蛋白酶
磷酸
磷酸酶
三嗪染料 脱氢酶、激酶、聚合 酶、限制酶、干扰素
抗生物素蛋白 含生物素的酶
配体 肝素
胆固醇
条件可提高层析的 分辨率
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海南大学农学院wss12
三、亲和层析具备的三要素
介质(基质)—具有活化基团
间隔臂— 连接介质与配体的分子
配体— 具有识别能力 反配体（分离物）— 与配体进行可逆结合
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海南大学农学院wss13
■ 四、亲和层析法的四要点
配体 Ligand (L)
复合物带
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样品中有效成分 在亲和吸附剂上的 吸附量，除了与它 们之间的亲和力有 密切关系外，还与 样品的pH值和离子 强度有关系。
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海南大学农学院wss25
五、层析步骤
样品制备
选择配体
结合步骤 装柱操作
凝胶与配体偶联
流速控制 洗脱方法 淋洗
结合能力的测定
29.05.2020
用溴化氰活化载体
海南大学农学院wss22
29.05.2020
海南大学农学院wss23
四、特异性吸附
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时， 配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲 和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的 复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影 响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。
29.05.2020
海南大学农学院wss5
亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一 般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激 素等）组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特性 的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析 柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
偶合反应 (3) Coupling Reaction
(1) Solid Matrix
杂质
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S
(2)
Specific
S
Binding
Substance (S)
S
溶解 Elution
(4)
S
S
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五、亲和层析的特点
条件温和：不影响样品的生物活性，适合生物大 分子的操作。
技术背景
各种大分子物质之间理化特性的差异性。 但如果这种差异性较小，纯化较麻烦，最终收得
率很低。
29.05.2020
海南大学农学院wss1
内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作 第三节 提高吸附剂的操作容量 第四节 应用实例
29.05.2020
海南大学农学院wss2
第一节 基本原理
M
L
蛋白质2与配体无
S
生物学特异性
1
2
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海南大学农学院wss3
一、亲和层析的概念
亲和力
根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子 特异识别和可逆结合的特征，将生物分子间的这种结合 能力称为亲和力。
29.05.2020
海南大学农学院wss4
亲和层析法
利用生物大分 子和固定相表面 存在某种特异性 吸附而进行选择 性分离的一种生 物大分子分离的 层析方法。
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*
Elution volume
海南大学农学院wss16
五、亲和层析的特点
柱层析柱小 Vt＝1～1.5ml。上样量大,达 1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。
操作简单，时间快速。 柱子填充载体昂贵，配体的特异性，有时找不
到适宜的配体，不适合所有生物大分子样品。
PriboFast ®黄曲霉毒 素B1免疫 层析亲和柱
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内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作 第三节 提高吸附剂的操作容量 第四节 应用实例
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海南大学农学院wss18
第二节 操作
一、理想基质的性质
二、配基（配体）的选择 优良的配体必须具备两个条件： 配体与生物大分子具有合适的亲和力； 配体具有与载体牢固地结合，又不影响与生
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海南大学农学院wss8
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海南大学农学院wss9
■ 二、亲和层析法的作用机理
(1) X
B A
Sample
(2)
Washing
A
B
亲和基团 配体
固相载体
X
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脂肪酸
核苷酸
苯基硼酸 盐
凝集素
待纯化的蛋白质
凝聚因子、脂酶、结缔 组织蛋白酶、DNA聚
合酶 胆固醇受体、胆固醇结
合蛋白 脂肪酸结合蛋白、白蛋
白 核苷酸结合蛋白、需核
苷酸的酶 糖蛋白
糖蛋白
糖
凝集素、糖苷酶
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海南大学农学院wss21
三、亲和吸附剂的制备
载体的活化（CNBr）
配体的偶联
物大分子之间的亲和力。
29.05.2020
海南大学农学院wss19
专一性结合的生物体系
常用配体
分离对象
酶蛋白
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等
抗体
抗原、病毒、细胞
外源凝集素 核酸 激素及维生素
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
细胞
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(3)
Elution
A
B
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29.05.2020
海南大学农学院wss11
特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和层
析法：
方法
配体
性能
特异性配体亲和 层析法
通用性配体亲和 层析法
复杂的生命大分子 具有较强的吸附选 物质（如抗体、受 择性和较大的结合 体和酶的类似底物 力 等）
简单的小分子物质 成本低廉，具有较 （如金属、染料、 高的吸附容量，通 以及氨基酸等） 柱子再生
29.05.2020
海南大学农学院wss26
洗脱方法
29.05.2020
海南大学农学院wss27
纯化效率高：一步法分离和纯化混合物中的样品， 提纯达几千倍,得到高纯度样品。
选择性强：依据生物学特异性，而非物理化学性 质分离原理。故特异的层析图为2个峰，第1个为 杂峰，第2峰为纯品。
29.05.2020
海南大学农学院wss15
■ 典型的亲和层析操作：
Protein
pH 2.05
Activity