PCR技术详细步骤.
pcr的基本步骤
pcr的基本步骤
PCR是一种基因扩增技术，可在特定的温度下，通过DNA聚合酶酶解DNA链，将DNA复制。
PCR的操作步骤非常关键，下面我们将一一介绍。
1. 提取DNA样品
PCR前需要从不同来源提取DNA样品。
例如，可以从口腔、血液、组织和细胞等不同来源中提取DNA样品。
2. 设计引物
PCR过程中，引物起到非常重要的作用，它们在扩增DNA时起到定位特定目标序列的作用。
通过设定引物可以扩增对人类、动植物种群的分子分析、遗传诊断、DNA指纹技术、疾病检测等。
3. 反应液配制
PCR反应液配制非常重要，因为处理步骤、试剂品质、试剂纯度、水平等因素直接影响PCR扩增。
在反应液组成方面，PCR反应液一般包括低盐缓冲液、dNTPs、引物、DNA聚合酶、模板DNA等。
4. PCR反应
PCR反应是PCR的核心步骤。
反应可分为三个步骤：起始温度循环、加温（单样本）、退温和延伸步骤。
这三个步骤会在PCR循环中进行，就像一个复杂的化学机器，大幅缩短了扩增的模板DNA。
5. 电泳分析
电泳分析是一种确定PCR反应是否成功的重要方法。
在PCR反应后，将PCR产物加载到琼脂糖凝胶上，然后通过电场通过凝胶，最终产生电泳图像，以确定扩增的DNA大小，是否纯净、其质量，以及PCR 扩增率高低。
当然了，电泳分析也可以分辨出皮肤受伤时留下的DNA。
总的来说，PCR技术可以说是生命科学中最重要的技术之一。
科学家们可以使用PCR技术直观地观察、修改、了解PCR。
事实上，随着PCR技术的使用逐年增多，它也为生命科学的重要发展带来了很多的帮助和作用。
pcr四个步骤
pcr四个步骤PCR（聚合酶链反应）是一种常用的生物分子扩增技术，被广泛应用于基因组学、医学诊断、犯罪调查等领域。
PCR通常包括四个关键步骤：变性、退火、延伸和终止。
下面将详细介绍PCR的四个步骤及其在实验中的应用。
第一步：变性（Denaturation）变性是PCR的第一步，其目的是将DNA双链解开，得到两条单链DNA。
这一步通常在94-98℃的高温条件下进行，高温能够破坏DNA 的氢键，使DNA解开。
变性步骤在PCR中非常重要，因为它为后续步骤提供了单链DNA 模板。
在变性后，每个DNA模板都可以与引物（引导DNA扩增的短DNA片段）结合形成PCR产物。
第二步：退火（Annealing）退火是PCR的第二个步骤，其目的是使引物与DNA模板序列特异性结合。
在退火步骤中，温度降至50-65℃左右，使引物与DNA模板的互补碱基序列相互结合。
引物是为了扩增目标DNA序列而设计的短DNA片段，通常包含20-30个碱基。
引物的互补碱基序列与目标DNA序列的两个末端相对应，使引物能够与目标DNA序列的两个末端结合。
第三步：延伸（Extension）延伸是PCR的第三个步骤，其目的是通过DNA聚合酶酶活性，在引物的引导下合成新的DNA链。
在延伸步骤中，温度通常在65-75℃之间，取决于所使用的DNA聚合酶。
DNA聚合酶是一种酶，能够识别引物与DNA模板结合的区域，并在该区域上合成新的DNA链。
延伸步骤会在每个引物结合的DNA模板区域合成新的DNA链，形成两个新的DNA双链。
第四步：终止（Termination）终止是PCR的最后一个步骤，其目的是阻止DNA链的继续合成。
在终止步骤中，温度通常在72℃左右，这是DNA聚合酶的最佳工作温度。
终止步骤中使用的方法是在PCR反应体系中加入一种特殊的终止试剂，该试剂能够在DNA合成链上添加一个无法与其他核苷酸连接的特殊核苷酸。
这样，当DNA链合成到终止试剂所添加的核苷酸时，DNA聚合酶无法进一步合成，从而终止了DNA的扩增。
PCR原理和步骤
PCR原理和步骤PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA的特定区域，它主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
PCR的原理是通过DNA复制过程的模拟，在体外扩增DNA片断。
PCR 的基本原理可以归结为三个主要步骤：变性、退火和延伸。
1.PCR反应的第一步是变性。
在变性步骤中，PCR反应混合液中的DNA双链会在高温条件下被分离成两条单链。
这一步骤通常在94-96°C 的高温下进行，以破坏DNA的氢键，并使DNA分离成两条单链。
2. PCR反应的第二步是退火。
在退火步骤中，PCR反应混合液中的引物（primers）会结合到DNA模板的特定区域。
引物是一小段具有互补序列的单链DNA片段，可以识别并结合到目标DNA区域。
退火温度一般在40-60°C之间，可根据引物序列的碱基组成和长度进行调整。
3. PCR反应的第三步是延伸。
在延伸步骤中，引物结合到DNA模板的3'端后，DNA聚合酶会在引物的引导下，在引物的3'端延伸新的DNA 链。
反应液中通常包含一种热稳定的DNA聚合酶，如Taq聚合酶。
这种酶可以耐受高温，因此可以在反应温度为72°C时进行DNA延伸。
上述三个步骤组成了PCR的一个循环。
在一次循环之后，生成的DNA 分子数目增加一倍，而每个新的DNA分子都可以被用作下一轮PCR反应的模板。
通过连续进行PCR循环，可以迅速、精确地扩增目标DNA片段。
PCR反应混合液中的其他成分包括缓冲液、dNTP（脱氧核苷酸三磷酸盐）、Mg2+（镁离子）、引物和模板DNA。
缓冲液提供适当的pH和离子环境，为酶活性提供最佳条件。
dNTP是构建新DNA链所需的四种脱氧核苷酸单元。
Mg2+是DNA聚合酶的辅因子，促进酶的活性。
引物是特异性结合到目标DNA片段的短DNA片段。
模板DNA是PCR扩增的起始材料。
PCR的应用十分广泛。
pcr操作过程
pcr操作过程
PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学中常用的技术，用于扩增特定DNA片段。下 面是PCR操作的一般步骤：
1. 样本准备：收集需要扩增的DNA样本，并进行必要的预处理，如提取DNA、纯化等。
2. PCR反应液的制备：根据PCR反应的要求，准备PCR反应液。PCR反应液通常包括 DNA模板、引物（前向和反向引物）、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs（四种脱氧核苷酸） 和水。
5. 结果分析：PCR反应完成后，可以通过凝胶电泳或其他方法对PCR产物进行分析。凝胶 电泳可以用来检测扩增的DNA片段的大小和纯度。
pcr操作过程
需要注意的是Байду номын сангаасPCR操作过程中应严格遵守无菌操作、避免污染，以保证PCR反应的准确 性和可靠性。此外，根据具体的实验目的和要求，可能需要进行一些额外的步骤，如设计引 物、优化PCR反应条件、进行质控等。
pcr操作过程
3. PCR反应条件的设置：根据目标DNA片段的长度和引物的特性，设置PCR反应的温度 和时间参数。通常包括初始变性步骤（94-98°C，几分钟）、循环扩增步骤（变性、退火和 延伸，通常在50-70°C之间，时间取决于引物和目标片段的长度）、最终延伸步骤（72°C， 几分钟）。
4. PCR反应的进行：将PCR反应液加入PCR反应管或板中，放入热循环仪中进行PCR反应 。热循环仪会根据设置的温度和时间参数，自动进行PCR反应的循环。
pcr技术原理及步骤
pcr技术原理及步骤
PCR（聚合酶链式反应）是一种生物学技术，用于在体外大量复制特定的DNA片段。
它在分子生物学和遗传学的研究中得到了广泛应用。
PCR技术的原理是通过逐渐加热和降温的循环反应，使DNA序列在体外被精确地复制。
PCR的步骤主要包括：变性、退火和延伸。
1. 变性：首先将DNA模板加热至95°C，这样会使DNA双链解开，变为两条单链DNA。
2. 退火：将温度降至50-65°C，加入DNA引物（引物是特异性序列，与待扩增的DNA序列互补）。
在适当的温度下，引物会与单链DNA的两端结合形成引物-模板复合物。
3. 延伸：将温度升至72°C，加入热稳定的DNA聚合酶。
在此温度下，DNA聚合酶会沿着引物-模板复合物的DNA链合成新的DNA链。
这样，一个PCR循环完成后，原有的DNA分子被扩增成两个分子。
然后，将温度逐渐循环升高和降低，重复数十次甚至数百次，可以快速产生大量目标DNA。
PCR技术的应用非常广泛，例如在基因工程中用于克隆和表达目的基因、医学诊断中检测特定基因、法医学中的DNA鉴定等。
其原理和步骤的灵活性和高效性使其成为现代生物学的重要工具。
PCR技术详细步骤.
送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。 3, 试剂配制和准备： (1) 双蒸水： 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个 1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。 (2) PCR中所需要的各种试剂 三，PCR时注意事项： 佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。 四，PCR步骤 1， 准备100ul EP管 2， 依次在管中加入：（50ul反应体系） ddH2O 37.5ul ×？ 10mM dNTP 1ul ×？ 10×PCR buffer 5ul ×？ 25mM Mgcl2 （加之前要摇匀） 3ul ×？ 上游引物 1ul ×？ 下游引物 1ul ×？ 模板cDNA 1ul 3， 稍离心 4， 100℃沸水浴1分钟 5， 趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作） 6， 再加入50ul液体石蜡封闭 7， 10000rmp离心1分钟 8， PCR条件 94℃ 1min 58℃ 50sec 72℃ 1min30sec 进行40个循环，然后72℃ 10min 完后4℃保温。 9，10000rmp离心5min 10，将下层水相转入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。 6 电泳鉴定 一，准备工作 1，实验器具与材料： （1）移液枪：10ul （2）吸头：20ul （3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）三角烧瓶：50ml一个
Hale Waihona Puke 至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。 （2）RT中所需要的各种试剂 （3）引物浓度计算方法： （新合成的引物的稀释） 假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量 ×X） 二，RT时注意事项： 为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。 三，RT步骤 用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积） 1， 准备0.65ml的EP管 2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA， 1uldNTP，短暂离心。 3， 65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。 4， 短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SSⅢ逆转录酶。 5， 短暂离心 6， 50℃水浴60分钟进行逆转录。 7， 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶 8， -20℃保存，或立即进行PCR。 用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积） 1， 准备0.65mlEP管 2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA 3， 稍离心，100℃沸水裕1min 4， 加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆转录酶 5， 稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT 6， 100℃沸水裕3min灭活AMV 7， 立即PCR或-20℃保存。 5 聚合酶链式反应（PCR） 二，准备工作 8， 实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）EP管1.5ml、100ul 2，实验器具的处理与准备 (1) 塑料制品：（包括吸头、EP管等）
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增的原理和操作步骤PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，通过扩增DNA片段，能在短时间内从极少量的DNA样本中大量产生目标DNA片段。
PCR的原理和操作步骤如下：PCR原理：PCR是通过逐渐增加的方式在体外复制DNA片段的技术，它包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性（Denaturation）：将含有目标DNA的样本加热至94-96℃，使DNA双链解开，产生两个单链DNA。
2. 退火（Annealing）：将温度降至50-65℃，引入一对寡核苷酸引物/引模，它们在目标DNA的两个末端特异性结合。
引物的设计与目标DNA的序列互补。
其中的一段是在目标DNA序列的正向链上引物，另一段是在反向链上的引物。
3. 延伸（Extension）：将温度升至72℃，引入热稳定的DNA聚合酶，使其延伸引物，生成新的DNA链。
延伸的速度约为300-1000个碱基每分钟。
如此一来，经过一次PCR循环，两条由引物引导的DNA链将被复制一次，重复进行多次PCR循环，DNA量会呈指数增长。
PCR操作步骤：1.DNA模板制备：从细胞中提取DNA，常用方法有裂解法和酶切法。
通过这些方法获得的DNA片段可作为PCR的模板。
2.引物设计：根据所需扩增的DNA序列设计引物。
引物通常由15-30个核苷酸组成，选择引物时要注意避免二聚体形成和引物之间的副产物形成。
3.反应体系设置：将PCR反应液配置至PCR试管或96孔板中，反应体系一般包括PCR缓冲液、dNTPs、模板DNA、引物、Mg2+离子和聚合酶等成分。
4.PCR循环程序：通常包括初步变性程序、循环变性程序和末端延伸程序。
初步变性程序为94-96℃，1-3分钟；循环变性程序为94-96℃，10-30秒；退火温度为50-65℃，20-60秒；延伸温度为72℃，20-60秒，延伸时间根据目标片段的长度确定，每一循环的延伸时间通常为片段长度的1-2秒。
PCR技术包括哪三步程序和步骤及步骤
PCR技术包括哪三步程序和步骤及步骤引言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一项常用的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、犯罪学等领域。
PCR技术的原理是通过复制和扩增DNA片段，使得少量的DNA可以被快速增加到大量，从而方便后续的实验分析。
本文将介绍PCR技术的三个步骤，并详细描述每个步骤的具体操作。
PCR技术的三个步骤PCR技术一般包括三个步骤，分别是变性、退火和延伸。
下面将对每个步骤逐一进行介绍。
1. 变性（Denaturation）变性是PCR的第一个步骤，其目的是将DNA模板的双链分离为两条单链DNA。
在PCR反应中，常用的变性温度为94-98摄氏度。
变性温度的选择取决于所用的DNA模板的GC含量和所需扩增片段的长度。
变性步骤通常在PCR反应器中进行，将PCR反应器置于热循环仪中，温度快速升至变性温度并保持一段时间，通常为30秒至1分钟。
2. 退火（Annealing）退火是PCR的第二个步骤，其目的是使引物与DNA模板的单链DNA片段结合。
引物是PCR反应中的关键组分，它们是一对具有互补碱基序列的短DNA片段。
在PCR反应中，引物的选择和设计非常重要，其碱基序列应与待扩增的目标DNA片段的两端相互匹配。
退火步骤通常在低温条件下进行，温度通常为50-65摄氏度。
在退火温度下，引物与DNA模板的单链DNA片段发生互补碱基序列的结合，形成引物-模板复合物。
退火时间一般为20-30秒。
3. 延伸（Extension）延伸是PCR的第三个步骤，其目的是将引物-模板复合物延伸为双链DNA。
延伸步骤是通过加入DNA聚合酶酶和适当的dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）来实现的。
延伸步骤通常在较高温度下进行，温度通常为72摄氏度。
在延伸温度下，DNA聚合酶将dNTPs逐个加入到引物末端，以聚合成一条新的DNA链。
延伸时间的长度取决于所需扩增片段的长度，通常为1-2分钟。
pcr技术的原理和步骤
PCR技术的原理和步骤一、引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它在许多领域中具有广泛的应用。
PCR技术的核心原理是通过体外复制DNA，使得我们能够从微量DNA样本中扩增出足够的DNA量进行后续分析。
本文将详细介绍PCR技术的原理和步骤。
二、PCR技术的原理PCR技术的原理主要基于DNA的复制与扩增过程，它包含以下三个重要步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR反应开始时，DNA模板被加热到95°C，使其两个DNA链分离。
这一步骤被称为变性，它破坏了氢键，使DNA双链变为单链。
变性是PCR技术的起始步骤，确保反应中的DNA单链能够被其他反应物所利用。
2. 退火在变性之后，温度降至50-60°C，引物加入PCR反应体系中与单链DNA互补配对。
引物是短的寡聚核苷酸序列，其中一个与DNA模板的一个单链区段互补，另一个与DNA模板的相对应的区段互补。
引物在退火温度下与DNA单链形成氢键，稳定地结合在DNA模板上。
3. 延伸在退火的温度下，酶聚合酶（Taq polymerase）被加入反应中，它能以引物为起始点，在DNA模板上合成互补链。
Taq polymerase是从一种热水生产的细菌中分离得到的，它能耐受高温，因此可以在PCR反应过程中保持活性。
Taq polymerase能够扩增DNA，其DNA合成速度约为每分钟1000个核苷酸。
PCR技术涉及多个步骤，包括DNA提取、反应体系的准备、PCR反应的设置和PCR产物的分析。
1. DNA提取PCR反应需要DNA作为模板。
DNA可以从多种样本中提取，如血液、组织、细胞培养物等。
DNA提取的方法有多种，包括使用商业DNA提取试剂盒或自行制备DNA提取试剂。
2. 反应体系的准备PCR反应体系通常包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液和二硫苏糖醇（DMSO）等。
引物的浓度通常为0.2-0.5 μM，聚合酶的浓度为1-2.5 U/μL。
PCR操作步骤及结果
PCR操作步骤及结果PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种体外放大特定DNA片段的技术，具有高效、快速和特异性的特点。
下面将详细介绍PCR的操作步骤及其结果。
一、PCR的操作步骤：1.模板DNA制备：-从样品中提取DNA，常见的提取方法包括CTAB法、盐溶法和商用DNA提取试剂盒等。
-根据实验需求，选择合适的DNA浓度作为PCR的模板。
2.PCR反应体系的配制：PCR反应体系由模板DNA、引物、dNTPs（四个单核苷酸）、缓冲液和聚合酶等组成。
-引物：引物是PCR反应中的两个短链DNA分子，分别与待扩增的目标DNA的两个互补区域序列相配对。
-dNTPs：dNTPs是脱氧核苷酸，包括A、T、C和G四种，供给聚合酶合成新DNA链使用。
-缓冲液：缓冲液用于提供合适的pH值和离子环境，维持PCR反应的正常进行。
-聚合酶：聚合酶是PCR反应的酶，能够识别引物，并在引物上逐个添加dNTPs，合成新的DNA链。
3.PCR循环反应：PCR反应主要包括三个步骤：变性、引物结合和延伸。
-变性：将PCR反应混合液加热至95°C，使模板DNA的双链解开，得到两条单链DNA。
-引物结合：将PCR反应体系降温至合适的温度（通常为45-65°C），使引物与单链DNA的互补区域结合。
-延伸：将PCR反应体系升温至聚合酶的最适温度（通常为65-75°C），聚合酶在引物的基础上合成新的DNA链，延伸特定的目标序列。
4.PCR循环程序：PCR的循环程序通常分为三个阶段：变性、引物结合和延伸。
-变性：95°C，持续时间为30秒至2分钟。
用于使DNA变性，并解开双链。
-引物结合：温度通常为45-65°C，持续时间为20秒至1分钟。
用于引物与模板DNA的互补区域结合。
-延伸：温度通常为65-75°C，持续时间为0.5-2分钟。
用于聚合酶在引物的基础上合成新的DNA链。
pcr三个步骤(pcr技术三大步骤)
pcr三个步骤（pcr技术三大步骤）本文介绍了PCR的详细操作流程，强调了实验中的注意事项，列举了常用缓冲液的配方。
帮助我们在理解实验的基础上更顺利的操作。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外合成双链DNA的一种方法，其原理类似于天然DNA的复制过程，其特异性主要依赖于与其目的片段两端互补的特异引物和高特异性的酶（热启动酶）。
典型的PCR反应有三个步骤：变性，退火，延伸，经过多次循环反应，获得目的片段。
1.DNA模板2.特异性引物3.dNTP Mix4.PCR buffer5.热启动酶1.配置反应体系将各成分依次加入到0.5ml的离心管中扩增使用热启动酶，可在常温下操作，非热启动型的酶要在低温配置反应体系。
2.按照试剂盒说明书设置反应时间和温度，扩增结束后电泳鉴定3.琼脂糖核酸电泳·将电泳所用器具蒸馏水洗净，架好梳子·根据要分离的DNA片段大小制备合适浓度的琼脂糖凝胶，准确称取一定的琼脂糖加入到锥形瓶中，加入30ml左右的电泳缓冲液（TAE或TBE）·在微波炉中加热融化后冷却至40℃左右，充分混匀后倒入电泳槽中·室温下凝固40分钟左右，小心拔出梳子，将凝胶放置电泳槽中准备点样·在电泳槽中加入电泳缓冲液，漫过凝胶表面即可，点样孔内不要有气泡·样品点样前准备好，（在八连管中）加入5ul样品，1ul的6xLoding buffer和1ul的染料混合，用抢将混合后的样品缓缓注入到点样孔中，注意不要串孔·按照正负极（红正黑负），接通电源，电压40-60V，时间30-40min，可根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳·电泳结束，关闭电源，凝胶成像观察，并对比marker确定片段大小不同的琼脂糖浓度分离不同大小的DNA片段：引物引物是决定PCR反应成败的关键，要保证扩增的准确、高效，引物的设计要遵循如下原则：1.引物的设计在cDNA的保守区域，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析的软件，得到不同基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物的长度：15-28bp，长度大于38bp，会使退火温度升高，不利于普通Taq酶的扩增3.引物GC含量在40%-60%，Tm值最好接近72℃4.因密码子的简并性，引物的3’端最好避开密码子的第三位（最好为T）5.碱基分布错落有致，3’端不超过3个连续G或C6.引物自身不要形成发夹结构，引物设计完成，要BLAST验证模板PCR扩增对模板的要求不高，单链、双链DNA均可作为扩增片段，虽然PCR能够扩增微量的DNA，为了保证扩增的特异性，对不同来源的模板，起始浓度有一定要求，如下：模板可以是纯化后的样品也可以是粗制品，不同来源的模板采取不同的处理方法，实验模板的纯化越简单越好，但模板中如果含有任何的Taq酶抑制剂、蛋白酶、核酸酶等，会干扰反应。
简述PCR的反应过程及步骤及结果
简述PCR的反应过程及步骤及结果引言聚合酶链式反应（PCR）是一种用于从DNA样本中扩增特定DNA序列的分子生物学技术。
PCR具有高度的灵敏性和特异性，因此被广泛应用于疾病诊断、基因检测和基因工程等领域。
本文将简述PCR的反应过程、步骤和结果。
反应过程PCR的反应过程主要包括三个阶段：变性、退火和扩增。
1.变性：反应体系中加热至高温（通常为94-98摄氏度），使DNA双链解开，形成单链。
该过程称为变性，其目的是使DNA双链解开，提供单链作为模板进行扩增。
2.退火：反应体系冷却至较低温度（通常为50-65摄氏度），引入引物。
引物可以自由结合到单链DNA上，而不会结合到双链DNA上。
引物的序列与目标序列的两端互补，因此可以选择性地结合到目标序列的两端。
该过程称为退火，其目的是确保引物与目标序列的特异性结合。
3.扩增：反应体系升温至适合DNA聚合酶活性的温度（通常为72摄氏度），DNA聚合酶开始合成新的DNA链。
在该过程中，DNA聚合酶结合到每个引物，开始合成一个新的DNA链。
这样，每个引物都会指向目标序列的不同方向，从而使目标序列的两端同时扩增。
该过程称为扩增，其目的是通过DNA聚合酶合成新的DNA链来扩增目标序列。
步骤PCR通常包括以下步骤：1.准备反应体系：按照所需扩增的DNA序列选择引物，并将引物、模板DNA、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、DNA聚合酶和缓冲液等添加到反应管中。
反应管中的总体积取决于实验设计和所需的扩增量。
2.变性：将反应管加热至高温，使DNA双链解开。
这一步通常在94-98摄氏度下进行，持续时间约为30秒至1分钟。
3.退火：将反应管冷却至低温，引入引物。
引物的结合温度通常为50-65摄氏度，持续时间约为30秒至1分钟。
4.扩增：将反应管升温至合适的温度，使DNA聚合酶开始合成新的DNA链。
该温度通常为72摄氏度，DNA聚合酶的最适工作温度。
5.重复循环：变性、退火和扩增步骤通常被循环反复进行，以扩增目标序列的数量。
PCR技术的基本原理和过程
PCR技术的基本原理和过程PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
它以DNA的复制过程为基础，通过重复的循环反应，迅速产生大量的目标DNA分子。
PCR 技术被广泛应用于基因测序、基因突变分析、疾病诊断等领域。
基本原理PCR技术基于DNA的双链结构和DNA聚合酶的酶活性。
在PCR反应中，需要的主要组成部分有：DNA样本、模板引物、核苷酸和DNA聚合酶。
PCR反应的每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1.变性（Denaturation）：将PCR反应液加热至95°C，使DNA双链解开，生成两条单链DNA。
2.退火（Annealing）：将反应液温度降至50-60°C，使引物与目标DNA序列发生互补碱基配对，形成引物-模板DNA复合物。
3.延伸（Extension）：将反应液温度升至72°C，在引物的引导下，DNA聚合酶开始沿着模板DNA的单链进行复制，合成新的DNA链。
通过循环不断地重复这三个步骤，可以迅速扩增目标DNA片段。
PCR反应的优化为了获得可靠的PCR扩增结果，需要对PCR反应进行优化。
以下是一些常见的PCR 反应优化策略：1.引物的设计：引物的设计是PCR反应成功与否的关键。
引物应具有互补碱基序列，且长度适当（一般为15-30个核苷酸）。
此外，引物的Tm值应相似，以确保在退火步骤时能够特异性结合目标DNA序列。
2.PCR反应体系的优化：PCR反应体系包括模板DNA、引物、核苷酸和酶。
适当调整这些组分的浓度可以提高PCR反应的效率和特异性。
3.PCR条件的优化：PCR反应的温度和时间也是关键因素。
合适的变性温度和时间可以使DNA完全解开；引物的结构可以在合适的退火温度下结合目标DNA；延伸的时间应足够长，确保DNA聚合酶复制目标DNA的完整长度。
PCR的应用PCR技术在科研和医学诊断领域具有广泛的应用。
下面是一些PCR的常见应用：1.基因测序：通过PCR扩增特定基因片段，可以进行基因测序，对基因序列进行分析，揭示基因的功能和作用。
PCR技术克隆目的基因全过程
PCR技术克隆目的基因全过程PCR（聚合酶链式反应）是一种体外的DNA合成技术，可以通过放大目的基因序列来克隆和检测DNA。
以下是PCR技术克隆目的基因全过程的详细解释。
1.设计引物：引物是用于扩增目的基因的短DNA片段。
引物分为前向引物和反向引物，其序列分别与目的基因的5’和3’末端相互匹配。
引物的设计应该尽量避免互相形成二聚体或发生引物间杂交。
一般情况下，前向引物和反向引物的长度约为18-30个碱基。
2.DNA模板的准备：DNA模板是PCR反应中的起始材料，可以是从细胞中提取的基因组DNA、cDNA或合成的DNA片段等。
DNA模板需要经过特定的处理步骤，如酶切或热变性，以解开DNA双链结构，使得引物能够与目的基因序列起始材料结合。
3.PCR反应体系的制备：PCR反应体系通常包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和稀释的镁离子。
这些成分需要以特定的量和浓度配制在一起。
在反应体系中加入适量的聚合酶，可以保证PCR反应能够进行。
4.PCR扩增条件设定：PCR反应需要经历一系列的温度变化，这些温度的设定旨在创造一个适宜扩增引物的环境。
PCR反应通常包含三个主要的步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤中，DNA模板的双链结构被加热到95°C，使其变性为两条单链DNA。
退火步骤中，反应体系温度降至碱基互补序列的温度，使引物能够与DNA模板结合。
延伸步骤中，反应体系温度升至适合聚合酶的工作温度，引物被复制形成两条新的双链DNA。
这三个步骤的温度和时间根据目的基因的特性和引物的设计来设定。
5.PCR扩增循环：PCR反应通常包含20-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。
每个循环都会使目的DNA序列扩增一倍。
PCR反应的循环数取决于目的基因的起始材料的丰度和所需扩增的DNA数量。
6.PCR产物检测：PCR扩增产物可以通过凝胶电泳等方法进行检测。
凝胶电泳可以将PCR扩增产物按照大小分离。
pcr操作流程和步骤
pcr操作流程和步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种用于复制DNA片段的技术，它在分子生物学和遗传学研究中被广泛应用。
PCR操作流程包括DNA模板的变性、引物的结合、DNA合成和扩增等步骤。
下面将详细介绍PCR的操作流程和步骤。
首先，准备PCR反应体系。
PCR反应体系包括DNA模板、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、聚合酶、缓冲液和水。
将这些试剂按照一定比例混合在一起，制备PCR反应混合液。
第二步是变性。
将PCR反应混合液加热至94-98摄氏度，使DNA双链解旋成两条单链。
这一步称为变性，它使DNA变性，使得引物可以结合到DNA模板上。
第三步是引物的结合。
将PCR反应混合液冷却至50-65摄氏度，使引物与DNA模板结合。
引物是一种短的DNA片段，它可以识别并结合到DNA模板的特定区域。
第四步是DNA合成和扩增。
将PCR反应混合液加热至72摄氏度，使聚合酶开始合成新的DNA链。
聚合酶是一种酶，它能够在引物的引导下合成新的DNA链。
通过多轮循环，可以扩增目标DNA片段。
最后，进行PCR产物的分析。
将PCR反应产物进行电泳分析，可以检测扩增的DNA片段是否符合预期。
通过PCR反应，可以快速、高效地复制目标DNA片段，为分子生物学和遗传学研究提供了重要的工具。
总的来说，PCR操作流程包括准备PCR反应体系、变性、引物结合、DNA合成和扩增等步骤。
掌握PCR技术可以帮助科研人员在实验室中快速、准确地复制DNA片段，为科学研究提供了重要的支持。
PCR技术的发展不仅在基础研究中发挥着重要作用，还在医学诊断、法医学和生物工程等领域有着广泛的应用前景。
PCR技术的不断完善和发展将进一步推动生命科学领域的发展。
pcr简要步骤
pcr简要步骤
PCR，即聚合酶链反应，是一种特异性的体外DNA序列扩增技术。
以下是PCR的简要步骤：
1.变性：通过加热使DNA双螺旋结构解离成单链DNA。
变性温度一般在90~96℃，此温度既能使DNA双链模板变性，又能保持DNA聚合酶活力。
2.退火：在变性后突然使温度降低，使引物与其互补的模板形成杂交链。
退火温度可根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）进行计算，一般退火温度为Tm-5℃，温度太低易出现非特异性扩增，一般范围在50~65℃之间。
3.延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核酸存在的条件下，耐热的DNA聚合酶催化以引物为起点的DNA链的延伸。
延伸温度常用70~74℃，延伸时间根据扩增DNA的长度而确定。
以上三个步骤形成一个循环，每一次循环的产物又和原始模板一起作为下一个循环的模板，因此目的DNA产物是以几何级数增长的。
PCR的循环次数一般在20~40次，循环次数过多将增加非特异产物，循环次数过少则会导致产物量减少，达不到最佳扩增效果。
以上信息仅供参考，如有需要，建议咨询专业技术人员。
PCR技术详细步骤6页
PCR技术详细步骤6页实验步骤：一、样品RNA的抽提1.取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2.两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm 离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3.RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4.RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。
5.RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6.溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、RNA质量检测1.紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
（1）浓度测定A260下读值为1表示40μgRNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40μlDEPC水中，取5μl，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：35μl×0.84μg/μl=29.4μg（2）纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
PCR技术整个流程
PCR技术整个流程概述聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种体外复制DNA的重要技术，它能够在较短时间内大量复制特定DNA片段。
PCR技术广泛应用于医学、法医学、农业科学和生物学研究等领域。
本文将介绍PCR技术的整个流程，包括所需试剂和设备、反应步骤等。
所需试剂和设备•DNA模板：待扩增的DNA片段。
•引物（Primers）：两个与DNA模板序列相互补充的寡核苷酸序列。
•DNA聚合酶：如Taq聚合酶，具有耐高温特性。
•脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dTTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）和脱氧胞苷酸（dCTP）。
•缓冲液：钠离子、镁离子等离子平衡反应环境。
•试管或PCR反应管：用于混合反应物的容器。
•PCR仪：用于控制反应温度的仪器。
PCR反应步骤1.Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至95℃，使DNA分子的双链解开，形成单链DNA。
2.Annealing（退火）：将PCR反应体系温度降低至50-65℃，使引物与DNA模板的目标序列互相结合，形成引物-模板复合物。
3.Extension（延伸）：将PCR反应体系温度调节至72℃，在这一温度下，DNA聚合酶以引物为模板，向3’端方向合成新的DNA链，形成双链DNA。
4.循环反应：通过反复进行变性、退火和延伸步骤，扩增DNA分子的数量。
每个PCR循环可以产生指数级增加的目标DNA序列。
5.延伸步骤时间：延伸步骤的时间根据所需扩增的DNA片段长度和DNA聚合酶的活性进行调控，通常为30秒至3分钟。
PCR结果分析PCR反应结束后，产生的扩增产物可通过多种方法进行分析： 1. 琼脂糖凝胶电泳检测：将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶孔中，通过电泳使DNA分子在凝胶中迁移，从而确定DNA片段的大小。
2. 实时荧光定量PCR：通过添加一种荧光染料，实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化，可以定量分析初始模板的数量。
简述PCR技术的原理和步骤及特点
简述PCR技术的原理和步骤及特点前言PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链反应，是一种用于在体外大规模扩增DNA片段的核酸技术，也是分子生物学、遗传学和生物医学研究中最重要和常用的实验技术之一。
它具有高效、快速、敏感、特异性强等特点，广泛应用于基因重排、突变检测、基因表达分析、遗传疾病诊断等领域。
PCR技术的原理PCR技术的原理基于DNA的双链结构及DNA聚合酶的酶活性。
其中，PCR反应体系主要包含模板DNA、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、DNA聚合酶和缓冲液。
具体步骤如下：1.变性：将PCR反应体系中的DNA在高温下（95℃）变性，使DNA双链解开成两个单链。
2.引物结合：将PCR反应体系温度降低（通常为50-55℃），使两个引物与模板DNA结合。
3.延伸：将PCR反应体系温度升高至DNA聚合酶的最适工作温度（通常为72℃），DNA聚合酶按照引物的序列导向，从引物的3’端开始延伸，合成新的DNA链。
4.重复步骤：重复以上步骤，不断进行DNA的变性、引物结合和延伸，形成指数级增加的DNA复制产物。
PCR技术的原理就是通过不断的循环变性、引物结合和延伸，使目标DNA片段在体外被扩增。
PCR技术的步骤PCR技术的具体步骤由一系列温度变化的PCR循环组成。
标准PCR循环通常包含以下几个温度阶段：1.变性：将PCR反应混合溶液加热至95℃，使DNA变性。
此步骤通常持续15-30秒。
2.引物结合：将PCR反应体系温度降至50-60℃，使引物与目标DNA片段结合。
此步骤通常持续20-30秒。
3.延伸：将PCR反应体系温度升至72℃，DNA聚合酶在此温度下最活跃，开始合成新的DNA链。
此步骤的时间由目标DNA片段的长度决定，通常为1分钟/千碱基。
重复以上循环，每个PCR循环会使目标DNA片段的数量翻倍，最终达到指数级的扩增。
PCR技术的特点PCR技术具有以下几个显著的特点：1.高效快速：PCR技术能在几个小时内扩增目标DNA片段，远远快于传统的DNA复制方法。
pcr反应的实验操作流程
pcr反应的实验操作流程PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的技术，它可以在短时间内大量复制目标DNA序列。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
下面是一份关于PCR反应的实验操作流程：1. 准备PCR反应体系：首先准备PCR反应混合液，包括模板DNA、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、聚合酶和缓冲液。
确保所有试剂在冰上保存，避免受到污染。
2. 设计引物：根据目标DNA序列设计引物，引物是PCR反应的关键组成部分，它们会在变性和退火步骤中结合到目标DNA序列上。
3. 加入PCR反应混合液：将准备好的PCR反应混合液分配到反应管中，确保每个反应管中的混合液量相同。
4. 放入PCR仪：将反应管放入PCR仪中，设置好反应条件，包括温度、时间和循环次数等参数。
5. 进行PCR反应：启动PCR仪，让反应在设定的条件下进行。
在变性步骤中，DNA双链解旋；在退火步骤中，引物结合到目标DNA序列上；在延伸步骤中，聚合酶复制DNA序列。
6. 分析PCR产物：反应结束后，取出反应管，可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法对PCR产物进行分析，确认目标DNA序列是否被扩增成功。
7. 结果解读：根据PCR产物的大小和数量，可以判断PCR反应的效果，进一步分析目标DNA序列的存在与否。
总结：PCR反应是一种快速、高效的DNA扩增技术，可以在短时间内扩增目标DNA序列。
正确的实验操作流程和条件设置对PCR 反应的成功至关重要，只有严格按照操作规程进行实验，才能获得准确可靠的结果。
PCR技术在分子生物学研究中有着广泛的应用，可以用于基因克隆、基因表达分析、疾病诊断等领域。
PCR反应的操作流程虽然简单，但需要实验人员具备一定的实验技能和经验，才能保证实验的顺利进行和结果的准确性。
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三，抽提步骤 1． 匀浆化作用 取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨 组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗， 后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。 2． 分离阶段 每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，漩涡震荡15秒，使其充分 混匀，冰上静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。 3． RNA的沉淀 将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙 醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。 3 4． RNA的洗脱 小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤 RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。 5． RNA的再溶解 小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA 沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶 性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。 6，RNA的保存 提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。 TRIzol法抽提总RNA 细胞1×107 组织100mg ↓ 加1mlTRIzol 细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓ 匀浆（要彻底，后转至EP管） （组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管） ↓ 颠倒混匀10下，室温5分钟 ↓ 加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5） ↓ 颠倒混匀15S，室温5分钟 ↓
至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。 （2）RT中所需要的各种试剂 （3）引物浓度计算方法： （新合成的引物的稀释） 假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量 ×X） 二，RT时注意事项： 为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。 三，RT步骤 用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积） 1， 准备0.65ml的EP管 2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA， 1uldNTP，短暂离心。 3， 65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。 4， 短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SSⅢ逆转录酶。 5， 短暂离心 6， 50℃水浴60分钟进行逆转录。 7， 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶 8， -20℃保存，或立即进行PCR。 用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积） 1， 准备0.65mlEP管 2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA 3， 稍离心，100℃沸水裕1min 4， 加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆转录酶 5， 稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT 6， 100℃沸水裕3min灭活AMV 7， 立即PCR或-20℃保存。 5 聚合酶链式反应（PCR） 二，准备工作 8， 实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）EP管1.5ml、100ul 2，实验器具的处理与准备 (1) 塑料制品：（包括吸头、EP管等）
PCR技术详细步骤－从RNA抽提到电泳鉴定
RNA抽提 一，准备工作 1， 实验器具与材料： （1） 移液枪：1ml、200ul、10ul （2） 吸头：1ml、200ul、20ul （3） 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个 （4） EP管1.5ml、100ul （5） 玻璃研磨器 （6） 容量瓶：1000ml （7） 盐水瓶：100ml （8） 15ml塑料管一个（配75％乙醇用） 2， 实验器具的处理与准备 （1） 塑料制品：（包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置 于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。 （2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器） 先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用 蒙锡纸包裹送至干烤3次。 （3） 金属制品：（镊子等） 先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水） 3， 试剂配制和准备： （1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加 1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75％乙醇的DEPC水 的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至 高压。 （2） 75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC 水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。 （3） 异丙醇：放入棕色瓶 （4） 氯仿：放入棕色瓶 （5） Trizol：100ml/瓶 存放于4℃ 二，抽提时注意事项： 全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接 触可疑污染物。
4℃，离心12000rmp，15分钟 ↓ 转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中 ↓ 加等体积异丙醇（约400 -500μl），混匀后-20℃中1小时 ↓ 4℃，离心12000rmp，10分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml ↓ 4℃离心7500rmp，5分钟 ↓ 弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥） ↓ 溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl） （可在55-60℃水中，<10分钟助溶） ↓ 立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录 4 逆转录（RT） 一，准备工作 1， 实验器具与材料： （1）移液枪：200ul、10ul （2）吸头：200ul、20ul （3）EP管1.5ml、100ul （4）水浴箱 2，实验器具的处理与准备 塑料制品：（包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置 于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。 3，试剂配制和准备： （1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加 1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC 水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送
（5）琼脂糖 2，实验器具的处理与准备 (1) 塑料制品：（包括吸头等） 送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。 （2）电泳板及电泳槽： 用自来水冲洗干净备用 3, 试剂配制和准备： (1) 电泳缓冲液（TAE）： 先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液：将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水 中，在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0（约需 4gNaOH）。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。 再配制50×TAE溶液：在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱，加入28.55ml 冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保 存。 （2）琼脂糖溶液（1.0％）： 50×TAE溶液取10ml，稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖，电炉上煮 至沸腾，溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/ml EB 5ul，充分混 匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置45min左 右后进行电泳。 （3）溴化乙锭（EB）（10mg/ml）： 在20ml水中加入0.2g溴化乙锭，磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器 或将溶液转移至棕色瓶中，室温保存。 （4）加样缓冲液（Loading Buffer）一般为6×Loading Buffer 二，电泳鉴定时注意事项： 佩戴一次性手套，避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新 的，不要超过两周。 五，电泳步骤 1， 50×TAE取10ml稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸 后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入电泳槽中。 9， 用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电 泳板中，冷却后，拔出梳子，放入电泳槽中。 10， 加样：PCR Marker：1ul Marker＋1ul Loading Buffer＋4ul TAE 混匀于塑料膜上，加入孔中。PCR样品：5ul 样品DNA＋1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。 11， 接上电源，电压120V，电流50mA进行电泳。 12， 入吸头台。 3, 试剂配制和准备： (1) 双蒸水： 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个 1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。 (2) PCR中所需要的各种试剂 三，PCR时注意事项： 佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。 四，PCR步骤 1， 准备100ul EP管 2， 依次在管中加入：（50ul反应体系） ddH2O 37.5ul ×？ 10mM dNTP 1ul ×？ 10×PCR buffer 5ul ×？ 25mM Mgcl2 （加之前要摇匀） 3ul ×？ 上游引物 1ul ×？ 下游引物 1ul ×？ 模板cDNA 1ul 3， 稍离心 4， 100℃沸水浴1分钟 5， 趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作） 6， 再加入50ul液体石蜡封闭 7， 10000rmp离心1分钟 8， PCR条件 94℃ 1min 58℃ 50sec 72℃ 1min30sec 进行40个循环，然后72℃ 10min 完后4℃保温。 9，10000rmp离心5min 10，将下层水相转入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。 6 电泳鉴定 一，准备工作 1，实验器具与材料： （1）移液枪：10ul （2）吸头：20ul （3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个 （4）三角烧瓶：50ml一个