蛋白酶抑制剂的配制
PMSF及常用试剂的配制方法
PMSF及常用试剂的配制方法PMSF，全名为苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride），是一种常用的蛋白质酶抑制剂。
它可以抑制蛋白质酶如胰蛋白酶、活化酶和血小板活化因子的活性。
PMSF的配制很简单，以下是一种常见的方法：1.准备材料-PMSF粉末（应提前称量好）-无水酒精（绝对醇）-磷酸缓冲液（可根据实验需求配制不同浓度的缓冲液）2.设计配制方法一般来说，PMSF的最终浓度为1mM，所以我们可以根据实验需要的最终体积和浓度来计算所需的PMSF量和酒精量。
根据以下公式计算所需量：所需PMSF量（mg）= 所需浓度（mmol/L）× 结果体积（L）÷ PMSF的摩尔质量（g/mol）所需酒精量（mL）= 所需体积（L）× （1－所需浓度（mmol/L））÷ 酒精的摩尔浓度（mol/L）3.配制3.1精确称量所需量的PMSF，放入一个干净的容器中。
3.2加入精确量的无水酒精，将PMSF溶解在酒精中。
建议使用磁力搅拌器和溶剂瓶来加速溶解过程。
3.3将溶液转移到含有磷酸缓冲液的容器中，并用缓冲液将溶液稀释至最终体积。
3.4用过滤膜滤过溶液以去除悬浮物和杂质。
通过以上操作，我们就可以制备出所需浓度的PMSF溶液。
常用试剂的配制方法包括以下几个方面：1.缓冲液的配制：缓冲液是实验中常用的试剂之一，可以用来稳定和调节试验的pH值。
常见的缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液等。
它们的配制方法一般为将相应浓度的缓冲液成分溶解在去离子水中，并调节pH至所需值。
2.标准溶液的配制：标准溶液常用于检测和分析中，以提供可靠的浓度和质量参考。
常见的标准溶液包括NaCl标准溶液、EDTA标准溶液、Tris标准溶液等。
它们的配制方法一般为将相应的标准溶质溶解在取定体积的溶剂中，经充分混合后即得到标准溶液。
确保在配制过程中注意各种反应条件的要求，例如温度、pH值等。
蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(植物样品抽提用, 50X)
蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(植物样品抽提用,50X)货号：P1262规格：100T保存：-20ºC保存，有效期12个月。
产品组成：产品名称规格保存蛋白酶抑制剂混合物(植物样品抽提用,50X)2×1mL-20ºC避光磷酸酶抑制剂混合物(50X)2×1mL-20ºC产品说明：植物细胞或组织提取物中含有许多内源性的蛋白酶、磷酸酶等，容易导致提取物中的蛋白降解或去修饰，从而影响后续的蛋白检测。
因此在提取物中添加适当的蛋白酶、磷酸酶等抑制剂是防止蛋白降解和去修饰的有效方法本产品用于植物细胞或组织蛋白提取的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，包含了广谱的丝氨酸、半胱氨酸和酸性蛋白酶抑制剂/氨基肽酶抑制剂，以及丝氨酸/苏氨酸、酪氨酸、酸性及碱性磷酸酶抑制剂。
以1:50的比例把蛋白酶抑制剂混合物(植物样品抽提用,50X)以及磷酸酶抑制剂混合物(50X)加入裂解液中，即可用于植物细胞或组织蛋白的提取，并有效抑制蛋白降解适用范围：抑制植物细胞或组织提取物中的各种蛋白酶(如丝氨酸蛋白酶、氨基肽酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸和天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等)和磷酸酶(如丝氨酸/苏氨酸、酪氨酸、酸性及碱性磷酸酶等)。
适用于Western Blot和免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、蛋白激酶活性测定等。
使用方法：1、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物（植物样品抽提用，50X），使用时分别按照1:50的比例加入到裂解液中，混匀后即可使用。
含有蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物的裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存待后续使用。
2、由于产品中的金属蛋白酶抑制剂能与亚铁等二价金属离子形成红色或紫色的螯合物，所以产品可能呈现浅粉红色；如果裂解液或样品中含有较高浓度亚铁等二价金属离子，可能出现较深的红色，但不影响使用。
蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明
蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明转自:http://www.bioas/html/980.html在与蛋白相关的检测中，最关键的一步便是蛋白质的提取。
在提取的过程中，我们要经常加入以防止。
另外在磷酸化蛋白的研究过程中，也是必不可少的。
本文详细总结了常用的P MSF、 Leupep tin亮肽素、Aproti nin抑肽酶、Pepsta tin胃、EDTA-Na2等以及NaF氟化钠、Na3VO4原矾酸钠、Beta-glycer ophos phate甘油磷酸钠、Na2P2O4焦磷酸钠等的溶液配制、贮存液与工作液浓度及保存条件。
一、蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。
溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。
在水溶液中不稳定。
在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。
分子量：174.2使用：贮存浓度200mM，工作浓度1m MLeupep tin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。
溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。
4℃一周稳定，分成小份，冷冻在 -20℃至少6个月。
分子量：C20H38N6O4×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4x 1/2 H2SO4× H2O:493.6使用：贮存浓度1m g/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。
Aproti nin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。
不抑制凝血酶或因子X。
溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。
膜蛋白溶解液配方
膜蛋白溶解液配方
1.缓冲液配方：
- Tris-HCl：10 mM
-氯化钾（KCl）：150mM
-EGTA（乙酰乙酸盐）：1mM
-硫酸镁（MgSO4）：2mM
-DTT（二硫苏糖醇）：1mM
-茶胰蛋白酶抑制剂（PMSF）：1mM
-pH调节至7.4
2.组件配方：
- 非离子洗涤剂（例如Tween-20）：0.1%
-蛋白激酶抑制剂（例如苯基甲烷磺酰氟化物）：1mM -辣根过氧化物酶（HRP）：0.1%
-蛋白酶抑制剂（例如维它宁K3）：1%
-MgATP：1mM
3.其他添加剂：
-DMSO（二甲基亚砜）：5%
-聚乙二醇（PEG）：10%
配方中每个成分的浓度可以根据实验的具体要求进行调整。
一般情况下，以上配方可以满足大多数膜蛋白的溶解需求。
制备过程：
1. 将Tris-HCl、KCl、EGTA、MgSO4、DTT和PMSF加入适量的去离子
水中。
2.用盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH至7.4
3.加入非离子洗涤剂，并充分混合。
4.加入剩余的组分，例如蛋白酶抑制剂、HRP和MgATP，并充分混合。
5.若需要，加入DMSO和PEG，继续搅拌溶解。
6.最后，用去离子水将溶液补足至所需体积。
需要注意的是，膜蛋白溶解液的制备应在低温和无氧的条件下进行，
以防止蛋白质氧化或降解。
制备好的溶液可以进行滤0.22μm滤膜来除去
悬浮的颗粒，然后储存在-20℃的冰箱中。
这只是一种常用的膜蛋白溶解液配方，实际使用时可以根据特定实验
的需求进行调整。
蛋白酶抑制剂混合液(100×PIC)
产品组成：
名称
编号
蛋白酶抑制剂混合液(100×PIC)
使用说明书
PI0015 1ml
PI0015
Storage
5×1mlቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ1份
-20℃ 避光
操作步骤（仅供参考）：
1、 开盖前，请低速离心一下，以便将黏附于管壁的液体甩至管底。 2、 使用时, 根据裂解液的用量加入 1%的蛋白酶抑制剂混合液(100×PIC)，使其终浓度达
北京雷根生物技术有限公司
蛋白酶抑制剂混合液(100×PIC)
产品简介：
蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor)指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使蛋 白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白变性的物质。蛋白酶抑制剂有很多种，包括 EDTA、 E-64、NaVO3、Bestatin、Leupetin、Pepstatin A、Aprotinin 等，可以有效抑制蛋白的 降解，并维持原有的蛋白间相互作用。
到 1×。
注意事项：
1、 蛋白酶抑制剂混合液有轻微刺激性，小心操作，同时应避免反复冻融。 2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12 个月有效。
相关产品：
产品编号 PI0011 PS0013 PT0001
产品名称 苯甲基磺酰氟溶液(PMSF,100mmol/L) RIPA 裂解液(强) BCA 法蛋白定量试剂盒
Leagene 蛋 白 酶 抑 制 剂 混 合 液 (100 × PIC) 主 要 由 Leupetin 、 Pepstatin A 、 Aprotinin、E-64 等组成，不含 EDTA。该混合物可以抑制绝大多数蛋白酶活性，包括丝氨 酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。该蛋白酶抑制剂混合 液是 100×的浓缩的 DMSO 溶液，适用于从哺乳动物组织、细胞中提取蛋白质，能够更有 效的获得目的蛋白质。提取出来的蛋白可以用于 Western Blot、免疫共沉淀等试验。
蛋白酶抑制剂Cocktail使用说明书奥默生物
奥默生物电话：021-5096 7598 邮箱：techsupport@ 网站：产品简介：本产品是由6种独立的蛋白酶抑制剂（不含EDTA）按照优化的配比配置而成的蛋白酶抑制剂混合物。
其作用的靶点分别为丝氨酸蛋白酶，丝氨酸半胱氨酸蛋白酶，氨肽酶，半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等，广泛作用于各种蛋白酶，可称之为广谱蛋白酶抑制剂。
本产品应于-20℃环境下密封保存，产品有效期为2年。
使用时可短时间放置于常温或4℃中，用毕应立即放回-20℃中保存。
储存条件：蛋白酶抑制剂Cocktail (不含EDTA，100X DMSO储液)蛋白酶抑制剂Cocktail 使用说明书蛋白酶抑制剂通过抑制蛋白酶的活性，减少蛋白酶对蛋白的分解，从而有效地提高蛋白质得出率，而且不使细胞及组织本身的性质发生改变。
作用原理：产品组成：成分MTT法CCK法 AEBSFAprotininBestatinE-64LeupeptinPepstatin A Cysteine proteases Serine proteases Aminopeptidases Serine proteases Serine and cysteine proteases Aspartic proteases Irreversible Reversible Reversible ReversibleReversible Irreversible 靶点靶点类型运输条件： 蓝冰运输。
奥默生物使用说明：1. 本产品适用于哺乳动物细胞及组织的蛋白质提取及纯化，蛋白免疫印迹（WesternBlot）,免疫共沉淀（Co-IP），免疫荧光（IF），免疫组织化学（IHC），激酶测定（kinaseassay）和抗体，酶诊断试剂盒（Dignose Kit）等。
2. 实验时，按照1:100的容积比，将Cocktail预先加入在已准备好的实验体系中，轻轻混合均匀。
注意事项：1. 本产品不含EDTA，为100×DMSO储存液形式。
蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明
蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明一、蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。
溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。
在水溶液中不稳定。
在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。
分子量：174.2使用：贮存浓度200mM，工作浓度1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。
溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。
4℃一周稳定，分成小份，冷冻在-20℃至少6个月。
分子量：C20H38N6O4 ×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 × H2O:493.6使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。
Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。
不抑制凝血酶或因子X。
溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。
pH约7~8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。
避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。
分子量：6,512使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。
Pepstatin胃蛋白酶抑制剂特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶、许多微生物酸性蛋白酶溶解性：溶于甲醇约1mg/ml；可溶于乙醇，过夜溶解可达到1 mg/ml；在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。
4℃稳定一周，分装储存于-20℃时可保存1个月。
分子量：685.9使用：贮存浓度1mg/ml，使用浓度0.7 μg/ml(1 μM)。
EDTA-Na2特性：金属蛋白酶抑制剂溶解性：溶于水至0.5M，在pH8-9的条件下，4℃稳定至少6个月分子量：372.24使用：工作浓度0.2~0.5 mg/ml(0.5~1.3 mM)，不需现用现配，在溶液pH值调至8~9时再加入。
蛋白酶抑制剂成分
蛋白酶抑制剂成分蛋白酶抑制剂是一种可以抑制蛋白酶活性的化合物。
蛋白酶是一种酶类，它在细胞内起着非常重要的作用，可以分解蛋白质分子，使其成为更小的分子。
但是，在某些情况下，过多的蛋白酶活性会导致细胞内的蛋白质被分解得过快，从而对细胞造成伤害。
因此，蛋白酶抑制剂成分可以在一定程度上保护细胞免受蛋白酶的伤害。
目前，已经发现了很多种蛋白酶抑制剂成分，其中一些已经被广泛应用于医学和生物学领域。
以下是一些常见的蛋白酶抑制剂成分：1. 蛋白酶抑制剂-1（Protease Inhibitor-1）蛋白酶抑制剂-1是一种天然存在于人体中的蛋白质，它可以抑制多种蛋白酶的活性。
研究表明，蛋白酶抑制剂-1可以对多种疾病有治疗作用，如心血管疾病、肿瘤、炎症等。
2. 甲基硫代咪唑（Methylthioadenosine）甲基硫代咪唑是一种天然存在于人体中的化合物，它可以抑制多种蛋白酶的活性。
研究表明，甲基硫代咪唑可以对多种疾病有治疗作用，如肿瘤、炎症等。
3. 金黄色葡萄球菌蛋白酶抑制剂（Staphylococcus aureus Protease Inhibitor）金黄色葡萄球菌蛋白酶抑制剂是一种可以抑制金黄色葡萄球菌产生的多种蛋白酶的化合物。
这种化合物可以用于治疗金黄色葡萄球菌感染等疾病。
4. 蛋白酶抑制剂A（Protease Inhibitor A）蛋白酶抑制剂A是一种可以抑制多种蛋白酶活性的化合物。
研究表明，蛋白酶抑制剂A可以对多种疾病有治疗作用，如肿瘤、心血管疾病等。
5. 磷酸二酯酶抑制剂（Phosphodiesterase Inhibitor）磷酸二酯酶抑制剂是一种可以抑制多种磷酸二酯酶活性的化合物。
研究表明，磷酸二酯酶抑制剂可以对多种疾病有治疗作用，如心血管疾病、哮喘等。
总之，蛋白酶抑制剂成分具有广泛的应用前景，在医学和生物学领域都有着重要的作用。
未来，随着科学技术的不断发展，相信会有更多的蛋白酶抑制剂成分被发现，并用于治疗更多的疾病。
蛋白酶 磷酸酶抑制剂
常用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的贮存与工作液浓度来源：原创，转载请注明发布时间：2009-10-20 查看次数：21在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步便是蛋白质的提取。
蛋白质的提取过程中，我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的，本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotin in抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶抑制剂，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠，N a3VO4 原矾酸钠，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等。
对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作液浓度，保存都做了详细的说明。
蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶（可逆的地面处理）。
溶解性：溶于异丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果>10mg/ml。
在水溶液中不稳定。
在100%异丙醇，+25℃时稳定至少9个月分子量：174.2使用：贮存浓度：200mM，工作浓度：1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶B溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。
4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月分子量：C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶，激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。
不抑制凝血酶或因子X。
溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，0.1M，pH8.0）。
p H约7-8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。
常用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的贮存与工作液浓度
常用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的贮存与工作液浓度在与蛋白相关的检测中，首先最关键的一步便是蛋白质的提取。
蛋白质的提取过程中，我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
另外在磷酸化蛋白的研究过程中，磷酸酶抑制剂也是必不可少的，本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF，Leupeptin 亮肽素，Aprotinin抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶抑制剂，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠，Na3VO4 原矾酸钠，BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠，Na2P2O4 焦磷酸钠等。
对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制，贮存液与工作液浓度，保存都做了详细的说明。
蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶（可逆的地面处理）。
溶解性：溶于异丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果>10mg/ml。
在水溶液中不稳定。
在100%异丙醇，+25℃时稳定至少9个月分子量：174.2使用：贮存浓度：200mM，工作浓度：1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纤溶酶，和组织蛋白酶B 溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。
4℃一周稳定,分成小份冷冻在-20℃至少6个月分子量：C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 x H2O:493.6使用：贮存浓度：1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶，激肽释放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。
不抑制凝血酶或因子X。
溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如，tris，0.1M，pH8.0）。
pH约7-8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。
避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。
细胞提蛋白
从细胞系中提取蛋白质贴壁细胞：1、对于每1×107细胞，按照100μl RIPA中加入1μl PMSF、1μl 蛋白酶抑制剂和1μl磷酸酶抑制剂的方案配制裂解液，配制后置于冰上，现配现用（注：在计算理论用量后，配制时应在理论用量基础上增加多一份裂解液，如本来要配600μl，实际就配700μl，以避免移液误差导致最后一个样裂解液不足）；2、用PBS洗三遍，以尽量去除原有的培养基；3、每个样中加入计算用量的裂解液，用干净的刮勺将细胞刮尽，将细胞悬液移入标记好的EP管中进行裂解。
在切换不同样品的时候，刮勺要在PBS里面过一下，以洗掉残留在上面的上一个样的样本。
裂解时间控制在30min左右1。
此时应开始预冷离心机，并预热金属浴至目的温度2。
整个第三步操作宜严格在冰上进行。
4、在预冷至4℃的离心机中，12000rpm离心15-20min；5、弃沉淀，转移上清至新的标记好的EP管中，加入上清体积1/4的SDS并混匀3；6、检测蛋白浓度，步骤见“测蛋白浓度.docx”7、100℃金属浴5min，而后转移至-20℃冰箱保存。
短期不行WB实验时，则应将样品转移至-80℃冰箱。
悬浮细胞：1、裂解液配制方案同前；2、对于悬浮细胞，收集细胞悬液后1200rpm×5min离心，弃上清，PBS洗，也是三遍；最后一遍洗的时候，先转移至EP管再离心是个不错的选择。
3、直接向EP管中加入计算用量的裂解液，重悬后冰上离心30min。
4、后续操作同前。
注：1、裂解时间也有人因操作失误延长至1h，实际中没有造成很大的损失，但个人意见，实验步骤还应尽量紧凑些；在中间过程中可以反复吹打，尽可能使其形成单个细胞悬浮状态，使其充分裂解。
2、常用的蛋白变性方案为100℃×5min，也有人用65℃×30min或37℃×60min，但后者实际上是对非常特殊的蛋白使用的方案，这一类蛋白富含疏水性氨基酸（包括色氨酸、缬氨酸、脯氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，例如β-淀粉样蛋白中，上述氨基酸占比达到57%），高温时容易发生蛋白多聚化现象，形成多聚体，此时免疫印迹实验无法在目的条带检测到蛋白表达。
组织蛋白提取
鼠脑组织总蛋白提取一：蛋白提取1.脑组织称重，按照1：8（1g脑组织加8ml）的比例计算蛋白酶抑制剂的量(Aprotinin 、Pepstatin、NaF、Na3VO4、Leupeptin ，PMSF不稳定最后取出来加，都是1:100的稀释)和TNE的量，先在每个EP管中加入计算好的TNE再加蛋白酶抑制剂，每个ＥＰ管中加入３颗珠子，用匀浆器匀浆或用研磨棒研磨。
（蛋白酶抑制剂五种从-20拿到4度冰箱中溶解.各取100微升加入10毫升的TNE中（13层析柜中），TNE缓冲液（1.21g Tris,5.84g NaCl,0.37g EDTA/升），2.匀浆完毕后用枪头将混合好的溶液吸入EP管，一般大块组织加600微，小块加300微，4°离心14000转/min，20min。
3.取上清移入新EP管(最好离两次) ，溴酚蓝·甘油·SDS·巯基乙醇等组成samplebuffer（4X），Sample Buffer与蛋白比为3:1，在97度煮5分钟。
防止盖子开，最好用东西盖住。
始终在冰盒中操作，最后蛋白放入-80。
二：测蛋白浓度计算所需BCA的量，按MA:MB:MC=25：24：1的比例配好，每个孔总量为300ul,BSA:A-I各加150ul,Mix加150ul因BSA是溶解在NaCl，故加样时蛋白溶液和0.9%NaCl共加150ul(蛋白3ul,NaCl 147ul)注意加样时要加复孔。
酶标仪震荡5s37°孵育2小时Western Blot的有效检测下限为0.1-1ng蛋白提取可以分为三个步骤：第一步获取材料。
第二步分离目的细胞或组织成份并破碎。
细胞破碎的方法分为机械法和非机械法，机械法可以是振动、搅拌、研磨、压滤、超声、匀浆，非机械法可以是干燥、改变渗透压、冻融、酶解（纤维素酶、溶菌菌、蜗牛酶）等，不同来源的材料对于不同的处理方法耐受程度是不一样的，例如超声波可以很容易破碎动物细胞，但是破碎酵母细胞就困难许多。
PMSF及常用试剂的配制方法
PMSF及常用试剂的配制方法PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲磺酰氟）是一种常用的蛋白质保护剂和蛋白酶抑制剂。
下面是PMSF的配制方法和常用试剂的配制方法。
PMSF的配制方法：1. 准备一个干燥的50ml量瓶。
2.使用甲醇（MeOH）将PMSF溶解。
PMSF通常为250mM的浓度，可以根据需要准备不同浓度的溶液。
在本文中，我们以250mM的浓度为例。
3. 将1.575g的PMSF加入到干燥的50ml量瓶中。
4. 加入足够的甲醇使溶液体积达到50ml。
5.轻轻摇匀直至PMSF完全溶解。
6.将溶液过滤，然后将其储存在一个干燥的、避光的容器中。
常用试剂的配制方法：1. Tris缓冲液的配制方法：-准备一个1L的容器。
- 加入121.14g的Tris基（Tris base）。
-加入适量的蒸馏水，搅拌溶解。
- 调整溶液的pH至所需的目标值。
对于常用的Tris缓冲液，pH通常在7.2-8.0之间。
-最后加入足够的蒸馏水使溶液体积达到1L。
-将溶液过滤，然后进行灭菌处理。
2.SDS-凝胶的配制方法：- 准备一个干燥的50ml量瓶。
- 加入所需浓度的丙烯酰胺（acrylamide）和二甲基亚硫胺（N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）。
-搅拌溶解。
- 加入所需浓度的过硫酸铵（ammonium persulfate，APS）。
-搅拌溶解。
- 加入足够的蒸馏水使溶液体积达到50ml。
-混匀并尽快注入到凝胶模具中，在其固化之前将样品添加到凝胶孔中。
3. Tris-EDTA缓冲液（TE缓冲液）的配制方法：-准备一个1L的容器。
- 加入11.2g的Tris基。
-加入2.68g的EDTA。
-搅拌溶解。
-调整溶液的pH至所需的目标值。
对于常用的TE缓冲液，pH通常在7.4左右。
-最后加入足够的蒸馏水使溶液体积达到1L。
-将溶液过滤，然后进行灭菌处理。
组织裂解液和细胞裂解液如何配制
组织裂解液和细胞裂解液如何配制一、细胞裂解液配制方法一一、试剂准备1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液:150 mM NaCL1% NP-40 (去垢剂)0.1% SDS (去垢剂)2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂)1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。
2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF1.5 mM EDTA1mM NaVanadate （钒酸钠）(任选)3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。
二、实验步骤1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。
加入足够的冷的 PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。
在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。
2、向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。
3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。
4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。
如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。
5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在 -70℃。
4方法二NP-40 or Triton-100 1%TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/LNaCl 150mmol/LPMSF（苯甲基磺酰氟）0.1mmol/L(100µg/ml)Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 µmol/L(0.7µg/ml)Leupeptin（亮抑制肽） 0.5mg/mlAprotinin（抑蛋白酶肽）0.3µmol/L(1µg/ml)（注：PMSF 贮存液：100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中；Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0);Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中；Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存）裂解操作程序：* 离心收集1×107个细胞* 加入4℃预冷1%NP-40裂解液100µl* 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织进行匀浆）* 4℃放置15~30min* 4℃离心，15 000rpm,10min，取上清备用。
全蛋白抽提试剂盒
凯基全蛋白提取试剂盒Cat Number：For Research Use OnlyStore at 4℃ for one yearExpire date：一、 试剂盒说明本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白， 用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效。
获得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂。
二、 试剂盒组份组份 KGP250 （50 tests） KGP2100（100 tests）储存温度 Lysis Buffer 50 mL 100 mL 4℃磷酸酶抑制剂 250 μL 500μL -20℃蛋白酶抑制剂 50 μL 100 μL -20℃PMSF（100mM）500 μL 1000 μL -20℃L三、 操作步骤Ⅰ 实体组织蛋白的提取1． 在每1mL 冷Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制剂， 1 μL蛋白酶抑制剂和 5μL 100mM PMSF，混匀。
冰上保存数分钟待用。
2． 每100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入0.5～1 mL冷 Lysis Buffer，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；3． 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，离心10000转/分，4℃离心5 min；4． 取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford法、BCA法）；5． 分装保存于-70℃,避免反复冻融。
Ⅱ 培养细胞蛋白提取1． 贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入10mL/150mm培养板的冷PBS洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液；2． 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中， 1000转/分离心10 min，再用10mL/150mm培养板的冷PBS，1000转/分离心5 min洗两次；3． 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入5μL磷酸酶抑制剂， 1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF，混匀。
真菌蛋白提取方法
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产品号 3102 3411 3501 3121 3122 3125 3105 3702
产品 膜蛋白提取试剂盒 BCA 蛋白定量试剂盒 蛋白 Marker 细菌膜蛋白提取试剂盒 植物总蛋白提取试剂盒 蛋白酶抑制剂混合物 蛋白磷酸酶抑制剂混合物 SDS-PAGE 上样 Buffer
盒组分针对厚细胞壁样本进行优化，提取过程简单方便，可在 1 小时内完成。该试剂盒含有 的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。提 取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白质电泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。
使用方法： 1. 提取液制备：每 500ul 冷的真菌蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物， 4ul 蛋白稳定剂，混匀后置冰上备用。 2. 取 100mg 组织样本剪碎①，置于研钵中用液氮研磨。（没有液氮研磨条件也可直 接加入提取液后置冰上研磨即可） 3. 研磨后加入 500ul 真菌蛋白提取液。 4. 混匀后，在 4℃条件下振荡 20-30 分钟。 5. 在 4℃，14000rpm 条件下离心 10 分钟。 6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到真菌总蛋白。 7. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
真菌蛋白提取试剂盒
产品组成：
产品组成 规格
真菌蛋白提取液 蛋白稳定剂
蛋白酶抑制剂混合物
BB-31ul
BB-3127-2 100T 50ml 400ul 200ul
WB实验组织总蛋白提取方法
WB实验组织总蛋白提取方法WB实验组织总蛋白提取方法WB组织总蛋白提取步骤第一步提取组织蛋白上清液1，准备裂解液（1）溶PMSF（将PMSF晶体溶到PMSF溶剂中，即配成10ml100mM的PMSF液体）（2）裂解液的制备组成：PIRA裂解液+PMSF溶剂+蛋白酶抑制剂10mlPIRA=100ulPMSF=1片蛋白酶抑制剂（3）将配好的裂解液放在4℃备用。
2，研磨组织（心尖）（1）准备研钵，药勺（2把），长镊子，保温箱（里面放入冰块），汤勺，离心管，天平，手套（2幅），液氮，冰盘，振荡器。
（2）将所有接触到组织的工具用液氮预冷。
（3）1人负责将组织组织给研磨者并随时加液氮（此人必须记住每次研磨者所研磨的组织的编号）2人研磨组织（多次快速），同时一人将1.5ml离心管编号预冷去皮。
（4）将研磨好的组织放在去皮处理的对应的离心管中称重。
（用大白纸记录好每个样的重量，便于离心时配平用）。
（5）加裂解液（1mg组织加6ul裂解液）。
（6）震荡混匀后放入冰盘上，等所有的`样加完后一齐在摇床上摇1h。
3，离心提取蛋白上清液（1）提前30min预冷离心机（4℃）。
（2）配平。
（3）离心，按照配平时的组放样（13000r，5min）。
（4）取上清液，储存在-20℃备用。
（提前将1.5ml的离心管编号）。
第二步BCA法测蛋白浓度1，37℃预热水浴箱2，配蛋白标准液（1）准备9个1.5ml离心管并编号A,B,C,D,E,F,G,H,I（2）按照说明书配制标准样。
3，将蛋白上清液稀释十倍（1）准备0.5ml的离心管并编号。
（2）取上清液6ul，然后加入54ul蒸馏水，震荡混匀。
2，配BCA工作液RagentA：B=50:1工作液所需用量计算：总体积=（n待测样+9标准样）×2×200ul其中A液xx，B液xx。
3，向酶标板（96孔板）中加入蛋白和工作液先加25ul蛋白，再加200ul工作液，每个样加两个孔。
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How to make protease and phosphotase inhibitors Protease inhibitors are rapidly inactivated in aqueous solutions and should be added to solutions immediately before use. Cocktail solutions are stored at -20 degrees and are good for approximately 6 months.
I. Protease Inhibitor Cocktail
The Protease inhibitor cocktail is used as 100X for extract preps and as 1000X for column elution buffers. Cocktail is made in 100% EtOH and contains:
Some components are not completely soluble in 100% EtOH. Vortex solution well before use to obtain a cloudy suspension and add to buffer - they become soluble in aqueous
II. 100 mM PMSF
PMSF is very unstable in aqueous solutions. The 100 mM stock solution is made in isopropanol and stored in the dark at -20 degrees. Must be warmed (37 degrees) to get into solution. Use at 1 mM in solutions.
Activation of Sodium Orthovanadate (sigma s-6508)
Sodium orthovanadate should be activated for maximal inhibition of protein phosphotyrosyl-phosphatases .
1. Prepare powder needed for 200 mM solution of sodium orthovanadate,
dissolve in ddH2O.
2. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of
the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow.
3. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes).
4. Cool to room temperature.
5. Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution
remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.
6. adjust volume.
7. Store the activated sodium orthovanadate as aliquots at -20°C.
This procedure depolymerizes the vanadate, converting it into a more potent inhibitor of protein tyrosine phosphatases. Please note that adding DTT rapidly inactivates sodium orthovanadate.
Sodium fluoride (Sigma, s-1504)
Dissolve sodium fluoride to 500mM in ddH20, store in darkness at 4 degree. Also you first make activated 400 mM sodium orthovanadata and 1 M sodium fluoride separately, and then 1:1 mix them together to a 100x concentration (200mM sodium orthovanadata and 500 mM sodium fluoride). Aliquot to 15ml tubes, keep in -20°C and in darkness.。